Питательная среда для культивирования и выделения возбудителей гнойных бактериальных менингитов, сухая (варианты)

Питательная среда для культивирования и выделения возбудителей гнойных бактериальных менингитов, сухая (варианты)

Реферат

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинической микробиологии. Наиболее эффективно это изобретение может быть использовано для диагностики гнойных бактериальных менингитов (ГБМ), вызванных основными возбудителями заболевания: менингококками (Neisseria meningitidis), гемофильной палочкой (Haemophilus influenzae), пневмококками (Streptococcus pneumoniae). Изобретение может найти практическое применение в санитарно-эпидемиологических и научно-исследовательских учреждениях Минздрава, занимающихся вопросами лабораторной диагностики гнойных бактериальных менингитов.

Для культивирования на искусственных питательных средах N. meningitidis и S. pneumoniae необходим фактор роста X, а для Н. influenzae - факторы роста Х и V, источником которых являются эритроциты крови. Фактор роста Х представляет собой группу термостабильных тетрапиррольных соединений, входящих в состав железосодержащих пигментов гемина и гематина, которые принимают участие в цитохромном транспорте электронов и синтезе каталазы и пероксидазы. Фактор роста V - термолабильный кофермент, включающий НАД - никотинамидадениндинуклеотид (коэнзим I) или НАДФ - никотинамидадинуклеотид фосфат (коэнзим II), участвующий в окислительно-восстановительных реакциях бактериальных клеток и высвобождающийся из эритроцитов при прогревании нативной дефибринированной крови при 70-80°С.

Известна питательная среда для выделения менингококков, в состав которой входят кислотный гидролизат казеина, аминопептид, экстракт кормовых дрожжей, экстракт семян льна (Л.С.Черкасова, И.С.Королева, И.М.Грубер, В.А.Мельникова, О.М.Кузьменко. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2008; 1:69-71. Питательная среда для выделения Neisseria meningitidis).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, относится то, что данная среда не позволяет получить рост гемофильной палочки и пневмококка.

Известна питательная среда для выращивания менингококков - сывороточный агар, в состав которой входит триптический перевар Хоттингера или агар для бруцелл и инактивированная лошадиная сыворотка (Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. МУК 4.2.1887-04. - М., 2005).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной питательной среды, относится то, что данная среда не позволяет получить рост гемофильной палочки и пневмококка.

Известна питательная среда для выращивания пневмококков - кровяной агар, которая помимо питательного агара содержит 5% дефибринированной крови барана, лошади, крупного рогатого скота (Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. МУК 4.2.1887-04. - М., 2005).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании данной питательной среды, относится то, что эта среда не позволяет получить рост гемофильной палочки вследствие отсутствия в среде фактора роста V.

Известна питательная среда для культивирования бактерий Haemophilus influenzae, содержащая аминопептид, однозамещенный фосфат калия, двузамещенный фосфат калия, натрий хлористый, магний хлористый, кальций хлористый, глюкозу, гемин, тиамин, пантотенат кальция в комплексе с фактором роста V (патент RU № 2258737, C12N 1/20, C12Q 1/04, 2005).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании этой питательной среды, относится то, что данная среда не позволяет получить хороший рост пневмококка.

Наиболее близкой, по совокупности признаков, к заявляемому изобретению является среда с гретой кровью (шоколадный агар), приготовленная на основе колумбийского агара (Columbia agar base, BBL, Cat. № 11124), (Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов. МУК 4.2 1887-04 утв. Главным Государственным санитарным врачом РФ 04.03.2004). Компонентный состав среды, г/л:

Панкреатический гидролизат казеина	12,0
Пептический перевар животных тканей	5,0
Дрожжевой экстракт	3,0
Мясной экстракт	3,0
Кукурузный крахмал	1,0
Натрий хлористый	5,0
Вареная нативная дефибринированная кровь лошади или
человека без консервантов	100 мл
Вода дистиллированная	900 мл

Способ приготовления:

к 100 мл стерильного расплавленного и охлажденного до 50°С питательного агара добавляют 10 мл дефибринированной крови лошади или человека без консервантов, тщательно перемешивают и прогревают при температуре 75°С в течение 10 мин двукратно при постоянном встряхивании.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании этой питательной среды, относится то, что:

- для приготовления среды требуется наличие нативной дефибринированной крови лошади или человека, что значительно усложняет технологию приготовления среды;

- данная среда не позволяет получать рост гемофильной палочки вследствие нестабильного содержания в среде фактора роста V, который высвобождается в результате прогревания нативной крови;

- использование нативной крови не позволяет получать стандартные среды со стабильными ростовыми свойствами;

- даже небольшое нарушение технологии приготовления среды (нагрев среды с кровью выше 80°С и экспозиции свыше 10 мин) ведет к разрушению фактора роста V, необходимого для роста гемофильной палочки.

Технический результат - создание стандартной сухой питательной среды для культивирования и выделения основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов (N.meningitidis, H.influenzae, S.pneumoniae), простой в приготовлении и обладающей стабильными физико-химическими и биологическими свойствами.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения по первому варианту достигается тем, что предлагаемая сухая питательная среда для культивирования и выделения основных возбудителей ГБМ, содержащая питательную основу, минеральные вещества и агар, дополнительно содержит ферментативный гидролизат черного альбумина, крахмал растворимый, калий фосфорнокислый однозамещенный и ростовую добавку №1 при следующем количественном соотношении компонентов, г:

Панкреатический гидролизат казеина	15,0
Пептон ферментативный	5,0
Ферментативный гидролизат черного альбумина	15,0
Дрожжевой экстракт	5,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный	1,0
Натрий хлористый	1,0
Крахмал растворимый	1,0
Агар микробиологический	10,0
Ростовая добавка	1,3749,

причем ростовая добавка содержит следующие компоненты, г:

Аденин	0,01
Витамин B12	0,001
Кальция пантотенат	0,001
Тиамина хлорид	0,001
Гуанина гидрохлорид	0,0003
Кокарбоксилаза	0,001
Никотинамидадениндинуклеотид (НАД)	0,001
Нитрат железа	0,0002
Тиамина гидрохлорид	0,0003
L-глутамин	0,10
L-цистеина гидрохлорид	0,259
Р-аминобензойная кислота	0,00013
Поливинилпирролидон или
мальтодекстрин глюсидекс 19	1,0

Второй вариант предлагаемой сухой питательной среды для культивирования и выделения основных возбудителей ГБМ, содержащей питательную основу, минеральные вещества и агар, дополнительно содержит ферментативный гидролизат черного альбумина, крахмал растворимый, калий фосфорнокислый однозамещенный и ростовую добавку №2 при следующем количественном соотношении компонентов, г:

Панкреатический гидролизат казеина	15,0
Пептон ферментативный	5,0
Ферментативный гидролизат черного альбумина	15,0
Дрожжевой экстракт	5,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный	1,0
Натрий хлористый	1,0
Крахмал растворимый	1,0
Агар микробиологический	10,0
Ростовая добавка	1,161

причем ростовая добавка содержит следующие компоненты, г:

Автолизат пекарных дрожжей	0,16
Никотинамидадениндинуклеотид (НАД)	0,001
Поливинилпирролидон или
мальтодекстрин глюсидекс 19	1,0

Только при вышеперечисленном составе и данных концентрациях компонентов питательной среды достигается указанный технический результат.

Питательная среда (первый и второй варианты) не содержит нативной крови. Отличием предлагаемой питательной среды от прототипа является применение сухого ферментативного гидролизата черного альбумина в комплексе с крахмалом растворимым, калием фосфорнокислым однозамещенным и ростовыми добавками №1, 2, обеспечивающими стандартность сухой питательной среды с заданными физико-химическими и биологическими характеристиками.

Использование в составе заявляемой среды дополнительных компонентов не оказывает отрицательного влияния на ее качество по физико-химическим и биологическим показателям.

Физико-химические показатели сухой питательной среды для выращивания основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов следующие: рН среды - 7,4; аминный азот - 2,6%; хлориды в пересчете на NaCl - 11,6%; прочность студня среды - 400 г.

Компонентный состав и возможность применения заявляемой среды для выращивания основных возбудителей ГБМ (N.meningitidis, H.influenzae, S.pneumoniae) подтверждены экспериментальным путем и неизвестны из доступных источников информации.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами:

Пример 1. Приготовление питательной среды (первый вариант).

Получение ферментативного гидролизата черного альбумина, сухого.

100 г черного альбумина растворяют в 1000 мл дистиллированной воды.

Навеску фермента протосубтилина (зависит от активности фермента) вносят в раствор черного альбумина, тщательно перемешивают до однородной массы.

Нагревают до 48°С и выдерживают при этой температуре в течение 2 ч.

Полученный гидролизат черного альбумина нагревают до кипения и фильтруют. Фильтрат высушивают в распылительной сушке. Полученный сухой ферментативный гидролизат черного альбумина подвергается контролю по физико-химическим и микробиологическим показателям.

Компоненты, входящие в состав ростовой добавки, взвешивают на

аналитических весах согласно прописи, растворяют в 20 мл дистиллированной воды,стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр марки DURAPORE® с диаметром пор 0,22 мкм и высушивают в лиофильной сушке. Состав ростовой добавки, г:

Аденин	0,01
Витамин B12	0,001
Кальция пантотенат	0,001
Тиамина хлорид	0,001
Гуанина гидрохлорид	0,0003
Кокарбоксилаза	0,001
Никотинамидадениндинуклеотид (НАД)	0,001
Нитрат железа	0,0002
Тиамина гидрохлорид	0,0003
L-глутамин	0,10
L-цистеина гидрохлорид	0,259
Р-аминобензойная кислота	0,00013
Поливинилпирролидон или
мальтодекстрин глюсидекс 19	1,0

Получение питательной среды, сухой.

Все компоненты питательной среды проходят тщательный входной контроль по физико-химическим и микробиологическим показателям.

Навески ингредиентов питательной среды, согласно прописи, тщательно измельчают и смешивают в смесителе, г:

Панкреатический гидролизат казеина	15,0
Пептон ферментативный	5,0
Ферментативный гидролизат черного альбумина	15,0
Дрожжевой экстракт	5,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный	1,0
Натрий хлористый	1,0
Крахмал растворимый	1,0
Агар микробиологический	10,0
Ростовая добавка вносится в готовую к применению среду	1,3749

Способ приготовления среды, готовой к применению.

Навеску ростовой добавки в количестве 1,3749 г в асептических условиях растворяют в 20 мл стерильной дистиллированной воды.

Навеску сухой питательной среды в количестве 53,0 г растворяют в 980 мл дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин, охлаждают до 50°С. В стерильную охлажденную питательную среду вносят 20 мл растворенной стерильной ростовой добавки, перемешивают и разливают в чашки Петри, которые используют для определения биологических показателей питательной среды.

Определение биологических показателей питательных сред.

Определение биологических показателей питательных сред проводят в соответствии с МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».

В качестве среды сравнения (прототип) используют среду с гретой кровью, приготовленную на основе колумбийского агара.

В качестве тест-штаммов используют музейные штаммы: N.meningitidis С 23252, Н.influenzae типа В (Hib) 423, S. pneumoniae ATCC 6503. Все культуры получают из ГИСК им Л.А.Тарасевича и восстанавливают из лиофилизированного состояния путем двухкратного пассажа на «шоколадном» агаре с добавлением фактора роста V.

Микробные взвеси тест-штаммов готовят с использованием 0,9% раствора хлористого натрия. Доводят концентрацию микробных взвесей до 10 единиц по стандартному образцу мутности ОСО 42-25-59-86 П. Из исходных стандартных взвесей готовят десятикратные разведения путем последовательного переноса 0,5 мл взвеси культуры в 4,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия: для менингококков - N.meningitidis С 23252 и гемофильной палочки - H.influenzae (Hib) 423 до разведения 10-⁶, для S.pneumoniae ATCC 6503 до разведения 10^-5.

Проводят посев по 0,1 мл взвеси тест-штамма N. meningitidis С 23252 из разведения 10^-6 на три чашки Петри с предлагаемой средой и на три чашки Петри со средой прототипом. Засевают по 0,1 мл взвеси тест-штамма и H influenzae (Hib) 423 из разведения 10^-6 на три чашки Петри с предлагаемой средой и на три чашки Петри со средой прототипом. Посев S. pneumoniae производят по 0,1 мл взвеси из разведения 10^-5 на три чашки Петри с предлагаемой средой и на три чашки Петри со средой прототипом. Учет результатов проводят через 17 - 24 ч инкубации посевов при температуре (37±1)°С в микроаэрофильных условиях в атмосфере 5% СО².

Биологические свойства питательных сред оценивают по следующим показателям:

- чувствительности - способности среды обеспечивать рост тест-штаммов: Neisseria meningitidis С 23252, Haemophilus influenzae (Hib) 423 и Streptococcus pneumoniae ATCC 6503 из минимальной посевной дозы;

- показателю прорастания - процентного отношения числа колоний тест-штаммов, выросших на испытуемой среде, к числу таковых на контрольной среде;

- скорости роста - времени появления колоний, размеру колоний тест-штаммов.

Полученные результаты представлены в табл.1.

Пример 2. Приготовление питательной среды (второй вариант).

Способ получения ферментативного гидролизата черного альбумина показан в примере №1.

Способ получения автолизата пекарных дрожжей.

100 г пекарных дрожжей измельчают, помещают в стеклянную колбу, вносят 200 мл дистиллированной воды и перемешивают до получения однородной суспензии.

Полученную суспензию нагревают до температуры 45°С и выдерживают при этой температуре 48 ч при периодическом перемешивании. Затем суспензию охлаждают, помещают в холодильник и выдерживают при температуре 4°С в течение 24 ч. Полученный автолизат декантируют и фильтруют. Стерилизацию полученного автолизата проводят путем фильтрации через мембранный фильтр марки DURAPORE® с диаметром пор 0,22 мкм. Высушивание автолизата проводят в лиофильной сушке. Полученный сухой автолизат пекарных дрожжей подвергается контролю по физико-химическим и микробиологическим показателям.

Получение ростовой добавки №2.

Компоненты, входящие в состав ростовой добавки, взвешивают на аналитических весах согласно прописи, растворяют в 20 мл дистиллированной воды, стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр марки DURAPORE® с диаметром пор 0,22 мкм и высушивают в лиофильной сушке.

Состав ростовой добавки №2, г:

Автолизат пекарных дрожжей	0,16
Никотинамидадениндинуклеотид (НАД)	0,001
Поливинилпирролидон или
мальтодекстрин глюсидекс 19	1,0

Получение сухой питательной среды по варианту 2.

Все компоненты питательной среды проходят тщательный входной контроль по

физико-химическим и микробиологическим показателям.

Навески ингредиентов питательной среды, согласно прописи, тщательно

измельчают и смешивают в смесителе, г:

Панкреатический гидролизат казеина	15,0
Пептон ферментативный	5,0
Ферментативный гидролизат черного альбумина	15,0
Дрожжевой экстракт	5,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный	1,0
Натрий хлористый	1,0
Крахмал растворимый	1,0
Агар микробиологический	10,0

Способ приготовления среды по варианту 2, готовой к применению.

Навеску сухой питательной среды в расчете на 1,0 л среды, в количестве 53,0 г, растворяют в 980 мл дистиллированной воды и стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 15 мин.

Навеску ростовой добавки в количестве 1,161 г растворяют в 20 мл стерильной дистиллированной воды и вводят в стерильную охлажденную до 45-50°С питательную среду, перемешивают и разливают в чашки Петри, которые используют для определения биологических свойств питательной среды.

Определение биологических показателей питательной среды по варианту 2 проводят аналогично процедурам, указанным в примере 1.

Полученные результаты представлены в табл. 1.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что предлагаемая среда обладает высокой чувствительностью, обеспечивая рост Haemophilus influenzae (Hib) 423 из разведения 1×10^-6 в виде слизистых, круглых, сероватого цвета полупрозрачных колоний диаметром до 2 мм, Neisseria meningitidis С 23252 из разведения 1×10^-6 в виде гладких, блестящих, маслянистых сероватого цвета, полупрозрачных колоний диаметром до 2,0 мм, а - Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 из разведения 1×10^-5 в виде нежных полупрозрачных колоний диаметром до 1,0 мм с зоной просветления питательной среды вокруг колоний.

Предлагаемая среда была испытана при исследовании образцов клинического материала от ребенка, предположительно погибшего от менингита.

В результате проведенных исследований была выделена культура Haemophilus influenzae (Hib) из образца, содержащего мозговую оболочку.

Предлагаемая среда в сравнении со средой-прототипом является стандартной сухой питательной средой для культивирования и выделения основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов (Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae), простой в приготовлении и обладающей стабильными физико-химическими и биологическими свойствами.

Среда не содержит в составе нативной крови и позволяет получать стабильный рост гемофильной палочки, менингококков и пневмококков как при выращивании чистых культур возбудителей, так и при выделении их из клинического материала.

Таблица 1
Биологические показатели предлагаемой среды и среды-прототипа для культивирования и выделения основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов
Тест-штаммы	Предлагаемая средаВариант 1	Предлагаемая средаВариант 2	Среда-прототип
1	2	3	4
Haemophilus influenzae (Hib) 423.
Количество колоний	24±3	25±3	25±4
Размер колоний	1,0-1,5 мм	1,0 мм - 1,6 мм	0,8-1,2 мм
Морфология:	Гладкие, слизистые, полупрозрачные колонии сероватого цвета со специфическим запахом. Грамотрицательные палочки с хорошей капсулой	Гладкие, слизистые, полупрозрачные колонии сероватого цвета со специфическим запахом. Грамотрицательные палочки с хорошей капсулой	Гладкие, слизистые, полупрозрачные колонии сероватого цвета со специфическим запахом. Грамотрицательные палочки с хорошей капсулой
Показатель прорастания	99,5±1,5	99,7±1,5	99,1±1,0
Скорость роста, размер колоний	На 17 ч инкубации 1,2-1,5мм	На 17 ч инкубации 1,2- 1,6мм	На 17 ч инкубации 0,8-1,2 мм
Neisseria meningitidis С23252
Количество колоний	59±5	60±5	59±4
Размер колоний Морфология:	Гладкие, слизистые, полупрозрачные колонии сероватого цвета диаметром до 1,5 мм. Грамотрицательные парные кокки.	Гладкие, слизистые, полупрозрачные колонии сероватого цвета диаметром до 1,5 мм. Грамотрицательные парные кокки.	Гладкие, слизистые, полупрозрачные колонии сероватого цвета диаметром до 1,3 мм. Грамотрицательные парные кокки.
Показатель прорастания	99,2±0,8	99,8±0,8	99,5±0,8
Скорость роста, размер колоний	На 17 ч инкубации 1,0-1,5 мм	На 17 ч инкубации 1,0-1,5 мм	На 17 ч инкубации 0,8-1,3 мм

1	2	3	4
Streptococcus pneumoniae ATCC6503
Количество колоний	20±4	21±4	20±3
Размер колонийМорфология	Нежные полупрозрачные четко очерченные колонии диаметром около 1 мм. В зоне роста возбудителя наблюдается зона просветления среды. Грамположительные овальные кокки с хорошо развитой капсулой.	Нежные полупрозрачные четко очерченные колонии диаметром около 1 мм. В зоне роста возбудителя наблюдается зона просветления среды. Грамположительные овальные кокки с хорошо развитой капсулой.	Нежные полупрозрачные четко очерченные колонии диаметром около 1 мм. В зоне роста возбудителя наблюдается зона просветления среды. Грамположительные овальные кокки с хорошо развитой капсулой.
	100,0±1	99,8±0,8	98,9±1
Показатель прорастанияСкорость роста,размер колоний	На 24 ч инкубации 0,6-1,0 мм	На 24 ч инкубации 0,6-1,0 мм	На 24 ч инкубации 0,4-0,8 мм

1. Питательная среда для культивирования и выделения основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов, сухая, содержащая питательную основу, минеральные вещества и агар, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит сухой ферментативный гидролизат черного альбумина, крахмал растворимый, калий фосфорнокислый однозамещенный и ростовую добавку №1 при следующем количественном соотношении компонентов, г:

Панкреатический гидролизат казеина	15,0
Пептон ферментативный	5,0
Ферментативный гидролизат черного альбумина	15,0
Дрожжевой экстракт	5,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный	1,0
Натрий хлористый	1,0
Крахмал растворимый	1,0
Агар микробиологический	10,0
Ростовая добавка №1	1,3749

2. Питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что ростовая добавка №1 представляет собой стерильную лиофильновысушенную смесь следующего состава, г:

Аденин	0,01
Витамин В12	0,001
Кальция пантотенат	0,001
Тиамина хлорид	0,001
Гуанина гидрохлорид	0,0003
Кокарбоксилаза	0,001
НАД	0,001
Нитрат железа	0,0002
Тиамина гидрохлорид	0,0003
L-глутамин	0,10
L - цистеина гидрохлорид	0,259
П - аминобензойная кислота	0,00013
Поливинилпирролидон или
мальтодекстрин глюсидекс 19	1,0

3. Питательная среда для культивирования и выделения основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов, содержащая питательную основу, минеральные вещества и агар, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит сухой ферментативный гидролизат черного альбумина, крахмал растворимый, калий фосфорнокислый однозамещенный и ростовую добавку №2 при следующем количественном соотношении компонентов, г:

Панкреатический гидролизат казеина	15,0
Пептон ферментативный	5,0
Ферментативный гидролизат черного альбумина	15,0
Дрожжевой экстракт	5,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный	1,0
Натрий хлористый	1,0
Крахмал растворимый	1,0
Агар микробиологический	10,0
Ростовая добавка №2	1,161

4. Питательная среда по п.3, отличающаяся тем, что ростовая добавка №2 представляет собой стерильную лиофильновысушенную смесь следующего состава, г:

Автолизата пекарных дрожжей	0,16
Никотинамиадениндинуклеотид (НАД)	0,001
Поливинилпирролидон или
мальтодекстрин глюсидекс 19	1,0