2472807 - Интерлейкин-13-связывающие белки

Интерлейкин-13-связывающие белки

Иллюстрации

Показать все

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен связывающий белок, специфичный к IL-13, содержащий 6CDR участков (три из легкой и три из тяжелой цепи). Раскрыты конструкция антитела на основе этого белка и конъюгат на основе антитела. Описаны: варианты НК, кодирующей антитело или конструкцию, а также вектор экспрессии, вектор репликации и клетки, несущие такие вектора. Описан способ получения белка путем культивирования клетки и белок, полученный указанным способом. Описаны композиции на основе вариантов белков. Использование изобретения может найти применение в медицине в лечении и диагностике заболеваний, связанных активностью IL-13, негативно влияющей на здоровье. 13 н. и 37 з.п. ф-лы, 23 табл., 2 пр.

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/843249, поданной 8 сентября 2006 года.

Область изобретения

Настоящая заявка относится к IL-13-связывающим белкам и, в частности, к их применению для профилактики и/или лечения различных заболеваний, включая астму, аллергию, COPD (ХОБЛ), фиброз и рак.

Ссылка на соглашение о совместном исследовании

Содержание настоящей заявки находится под защитой соглашения о совместном исследовании, заключенном между Protein Design Labs, Inc. и Abbott Laboratories 14 декабря 2005 года, и относится к рекомбинантно сконструированным антителам против IL-13.

Уровень техники

IL-13 человека является гликопротеином с размером 17 кДа, клонированным из активированных Т-клеток (Zurawski and de Vries 1994 Immunol Today 15 19-26) и продуцируемым активированными Т-клетками линии Th2, хотя IL-13 также продуцируют Т-клетки Th0 и Th1 CD4+, Т-клетки CD8+ и некоторые не-T-клеточные популяции, такие как мастоциты (Zurawski and de Vries 1994 Immunol Today 15 19-26). Функция IL-13 включает переключение изотипа иммуноглобулина на IgE в В-клетках человека (Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 3730-4) и супрессию продукции воспалительных цитокинов как у человека, так и у мыши (de Waal Malefyt, Figdor et al. 1993 J Immunol 151 6370-81; Doherty, Kastelein et al. 1993 J Immunol 151 7151-60). IL-13 связывается с рецепторами на поверхности клеток, IL-13Rα1 и IL-13Rα2. IL-13Rα1 взаимодействует с IL-13 с низкой аффинностью (KD~10 нМ), с последующим рекрутингом IL-4Ra с образованием сигнального гетеродимерного рецепторного комплекса с высокой аффинностью (KD~0,4 нМ) (Aman, Tayebi et al. 1996 J Biol Chem 271 29265-70; Hilton, Zhang et al. 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93 497-501). Этот комплекс IL-4R/IL-13α1 экспрессируется на многих типах клеток, таких как В-клетки, моноциты/макрофаги, дендритные клетки, эозинофилы, базофилы, фибробласты, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки дыхательных путей и гладкомышечные клетки дыхательных путей (Graber, Gretener et al. 1998 Eur J Immunol 28 4286-98; Murata, Husain et al. 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa, Yu et al. 2001 Cytokine 13 75-84). Лигирование рецепторного комплекса IL-13α1/IL-4R приводит к активации различных путей передачи сигнала, включая пути передачи сигнала и активатора транскрипции (STAT6) и пути субстрата рецептора-2 инсулина (IRS-2) (Wang, Michieli et al. 1995 Blood 864218-27; Takeda, Kamanaka et al. 1996 J Immunol 157 3220-2). Сама по себе цепь IL-13α2 имеет высокую аффинность (KD~0,25-0,4 нМ) в отношении IL-13 и функционирует как «рецептор-ловушка», отрицательно регулирующий связывание IL-13 (Donaldson, Whitters et al. 1998 J Immunol 161 2317-24), и как рецептор передачи сигнала, который индуцирует синтез TGF-β и фиброз через АР-1-путь в макрофагах и, возможно, других типах клеток (Fichtner-Feigl, Strober et al. 2006 Nat Med 12 99-106).

Несколько исследований, проведенных на преклинических моделях астмы животных, показывают, что IL-13 играет важную роль в астме. Эти данные включают устойчивость к астме у мышей с нокаутом IL-13, а также ингибирование фенотипа астмы антагонистами IL-13 (растворимыми рецепторами IL-13, анти-IL-13-mAb и т.д.) в различных мышиных моделях (Sela 1999 Harefuah 137 317-9; Wills-Karp and Chiaramonte 2003 Curr Opin Pulm Med 9 21-7; Wills-Karp 2004 Immunol Rev 202 175-90). Многочисленные исследования продемонстрировали, что фармакологическое введение рекомбинантного IL-13 в легкие мышей, а также морских свинок индуцирует гиперсекрецию слизи дыхательных путей, эозинофилию и AHR (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Kibe, Inoue et al. 2003 Am J Respir Crit Care Med 167 50-6; Vargaftig and Singer 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284 L260-9; Vargaftig and Singer 2003 Am J Respir Cell Mol Biol 28 410-9). Эти эффекты IL-13 воспроизводятся в системах трансгенных мышей с конститутивной или индуцируемой экспрессией IL-13 (Zhu, Homer et al. 1999 J Clin Invest 103 779-88; Zhu, Lee et al. 2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S67-70; Lanone, Zheng et al. 2002 J Clin Invest 110 463-74). Постоянная трансгенная сверхэкспрессия IL-13 индуцирует субэпителиальный фиброз и эмфизему. Мыши, дефектные по IL-13 (и IL-4) и молекулы передачи сигнала STAT6, неспособны развивать индуцируемое аллергенами AHR и сверхпродукцию слизи (Kuperman, Huang et al. 2002 Nat Med 8 885-9). Исследования с использованием растворимого слитого белка рецептора IL-13 (sIL-13Rα2Fc) продемонстрировали центральную роль этого цитокина в экспериментальном заболевании дыхательных путей, индуцированном аллергеном овальбумином (OVA) (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Taube, Duez et al. 2002 J Immunol 169 6482-9). Эффективность лечения с использованием анти-IL-13 также была продемонстрирована в модели хронической астмы мышей. Кроме проявления признаков гиперсекреции слизи и AHR, эта модель хронической астмы демонстрирует несколько отличительных признаков заболевания человека, которые отсутствуют в моделях острой формы заболевания. К ним относятся эозинофилия ткани легкого, локализованной в межэпителиальных пространствах, а также фиброз гладких мышц, как измерено по увеличению отложения коллагена. Эту модель хронической астмы индуцируют повторяемыми аэрозольными введениями OVA в чувствительных к OVA мышей 1 раз в неделю в течение 4 недель в целом. Анти-IL-13-антитело, вводимое в течение последних 2 недель введений OVA (со дня 36 с регистрациями эффективности, оцениваемыми в день 53 исследования), значимо ингибировало AHR, легочное воспаление, гиперплазию бокаловидных клеток, гиперсекрецию слизи и фиброз дыхательных путей (Yang, Li et al. 2005 J Pharmacol Exp Ther). Кроме того, было также продемонстрировано, что терапевтическое действие антагониста IL-13 ингибирует AHR в модели астмы приматов [Abstract, American Thoracic Society 2005].

Предполагается, что IL-13 участвует в патогенезе астмы человека, так как в легких астматических пациентов были обнаружены повышенные уровни мРНК и белка IL-13, которые коррелируют с тяжестью этого заболевания (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94). Кроме того, были идентифицированы генетические полиморфизмы IL-13 человека, которые приводят к повышенным уровням IL-13, которые связаны с астмой и атопией (Heinzmann, Mao et al. 2000 Hum Mol Genet 9 549-59; Hoerauf, Kruse et al. 2002 Microbes Infect 4 37-42; Vercelli 2002 Curr Opin Allergy Clin Immunol 2 389-93; Heinzmann, Jerkic et al. 2003 J Allergy Clin Immunol 112 735-9; Chen, Ericksen et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 553-60; Vladich, Brazille et al. 2005 J Clin Invest), и повышенные уровни IL-13 были детектированы в легких пациентов с астмой (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94; Arima, Umeshita-Suyama et al. 2002 J Allergy Clin Immunol 109 980-7; Berry, Parker et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 1106-9). Генетическое сцепление между IL-13 и астмой было также продемонстрировано, так как индивидуумы с полиморфизмом в гене IL-13, который вызывает более высокие уровни IL-13 плазмы, имеют увеличенный риск атопии и астмы (Wills-Karp 2000 Respir Res 1 19-23).

Вследствие этой роли IL-13 человека при различных нарушениях человека были созданы терапевтические подходы для ингибирования активности IL-13 или противодействия активности IL-13. В частности, проводились поиски антител, которые связываются с IL-13 и нейтрализуют IL-13, в качестве средства ингибирования активности IL-13. Однако в данной области существует потребность в улучшенных антителах, способных связывать IL-13. Предпочтительно, такие антитела связывают IL-13 человека. Предпочтительно, эти антитела способны нейтрализовать IL-13 человека. Настоящее изобретение относится к новому семейству связывающих белков, CDR-трансплантированных антител, гуманизированных антител и их фрагментов, способных связывать IL-13 человека, связывающихся с высокой аффинностью и связывающих и нейтрализующих IL-13 человека.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к IL-13-связывающим белкам. Связывающие белки по изобретению включают, но не ограничиваются ими, антитела, антигенсвязывающие части и другие антигенсвязывающие белки, способные связывать IL-13 человека. Кроме того, изобретение относится к способам получения и применения IL-13-связывающих белков.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к связывающему белку, способному связывать IL-13. В предпочтительном варианте осуществления связывающий белок связывает IL-13 человека. Предпочтительно, связывающий белок способен модулировать биологическую функцию IL-13. Более предпочтительно, связывающий белок способен нейтрализовать IL-13.

В одном из аспектов изобретения связывающий белок способен связывать IL-13 и предотвращать связывание IL-13 с IL-13α1-рецептором. В другом аспекте изобретения связывающий белок способен связывать IL-13 и предотвращать связывание IL-13 с IL-13α2-рецептором. В предпочтительном варианте осуществления связывающий белок способен связывать IL-13 и предотвращать связывание IL-13 как с IL-13α1-рецептором, так и с IL-13α2-рецептором.

Один вариант изобретения относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, в котором указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает IL-13 человека и ингибирует связывание указанного IL-13 с IL-13α2-рецептором в анализе связывания рецептора на основе клеточной поверхности с IC₅₀, выбранной из группы, состоящей из приблизительно 1,5×10^-8-1×10^-8 M, 1×10^-8-1×10^-9 M, 10^-9-10^-10 M и 10^-10-10^-11 M или в анализе связывания рецептора на основе ELISA с IC₅₀, выбранной из группы, состоящей из приблизительно 1,8×10^-8-1×10^-8 M, 1×10^-8-1×10^-9 M, 10^-9-10^-10 M и 10^-10-10^-11 M. Предпочтительно, это антитело связывает IL-13 человека и ингибирует связывание указанного IL-13 с IL-13α2-рецептором в анализе связывания рецептора на клеточной поверхности с IC₅₀ 2,7×10^-9 М и в анализе связывания рецептора на основе ELISA IC₅₀ 1,1×10^-9 M. Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает IL-13 человека и ингибирует связывание указанного IL-13 с его IL-13α2-рецептором в анализе связывания рецептора на основе клеточной поверхности или в анализе связывания рецептора на основе ELISA приблизительно на 70-100% при концентрации 100 нМ. Предпочтительно, этим антителом является антитело 13C5.5. Более предпочтительно, это антитело не является антителом BAK502G9, mAb13.2 или MJ2-7.

В другом аспекте изобретение относится к выделенному антителу, или его антигенсвязывающему фрагменту, где указанное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает IL-13 человека и ингибирует AHR приблизительно на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% на модели астмы человека, индуцированной IL-13. Предпочтительно, антитело ингибирует AHR более, чем на 86%, в модели астмы человека, индуцированной IL-13. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает IL-13 человека и ингибирует AHR приблизительно на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% и ингибирует продукцию слизи приблизительно на 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90% или 100% в модели астмы человека, индуцированной IL-13. Предпочтительно, антителом является антитело 13C5.5. Более предпочтительно, антитело не является антителом BAK502G9, mAb13.2 или MJ2-7.

В одном из вариантов осуществления связывающий белок по изобретению имеет константу скорости ассоциации (k_on) в отношении IL-13 по меньшей мере приблизительно 10² M^-1c^-1; по меньшей мере приблизительно 10³ M^-1c^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁴ M^-1c^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁵ M^-1c^-1; или по меньшей мере приблизительно 10⁶ M^-1c^-1, при измерении с помощью резонанса поверхностных плазмонов. Предпочтительно, связывающий белок по изобретению имеет константу скорости ассоциации (k_on) в отношении IL-13, равной 10²-10³ M^-1c^-1; 10³-10⁴ M^-1с^-1; 10⁴-10⁵ M^-1c^-1 или 10⁵-10⁶ M^-1c^-1, при измерении с помощью резонанса поверхностных плазмонов.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению имеет константу скорости диссоциации (k_off) в отношении IL-13 максимально приблизительно 10^-3 с^-1; максимально приблизительно 10^-4 с^-1; максимально приблизительно 10^-5 с^-1 или максимально приблизительно 10^-6 с^-1, при измерении с помощью резонанса поверхностных плазмонов. Предпочтительно, связывающий белок по изобретению имеет константу скорости диссоциации (k_off) в отношении IL-13 10^-3-10^-4 с^-1; 10^-4-10^-5 с^-1 или 10^-5-10^-6 с^-1, при измерении с помощью резонанса поверхностных плазмонов.

В другом варианте осуществления связывающий белок по изобретению имеет константу диссоциации (K_D) в отношении IL-13 максимально приблизительно 10^-7 M; максимально приблизительно 10^-8 M; максимально приблизительно 10^-9 M; максимально приблизительно 10^-10 M; максимально приблизительно 10^-11 M; максимально приблизительно 10^-12 M или максимально приблизительно 10^-13 M. Предпочтительно, связывающий белок по изобретению имеет константу диссоциации (K_D) в отношении IL-13 10^-7-10^-8 M; 10^-8-10^-9 M; 10^-9-10^-10 M; 10^-10-10^-11 M; 10^-11-10^-12 M или 10^-12-10^-13 M.

Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает IL-13 с характеристиками связывания, выбранными из группы, состоящей из: a) константы скорости ассоциации (k_on), равной приблизительно 10⁵-10⁶ M^-1с^-1 или приблизительно 10⁶-10⁷ M^-1с^-1, или b) константы скорости диссоциации (k_off), равной приблизительно 10^-4-10^-5 с^-1 или приблизительно 10^-5-10^-6 с^-1, при измерении с помощью резонанса поверхностных плазмонов, или c) константы диссоциации (K_D), равной приблизительно 1,5×10^-10-1×10^-10 M или приблизительно 10^-10-10^-11 M. Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет константу скорости ассоциации (k_on) в отношении IL-13, выбранную из группы, состоящей из: 6,68×10⁵ M^-1с^-1, 7,86×10⁵ M^-1с^-1, 8,35×10⁵ M^-1с^-1, 8,69×10⁵ M^-1с^-1, 9,15×10⁵ M^-1с^-1, 1,26×10⁶ M^-1с^-1, 1,7×10⁶ M^-1с^-1 и 2,51×10⁶ M^-1с^-1. Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет константу скорости диссоциации (k_off) в отношении IL-13, выбранную из группы, состоящей из: 1,23×10^-4 с^-1; 1,76×10^-4 с^-1; 4,74×10^-4 с^-1; 1,91×10^-5 с^-1; 2,14×10^-5 с^-1; 3,82×10^-5 с^-1; 8,81×10^-5 с^-1; и 9,65×10^-5с^-1, при измерении по резонансу поверхностных плазмонов. Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, имеет константу диссоциации (K_D) в отношении IL-13, выбранную из группы, состоящей из: 1,05×10^-10 M; 7,10×10^-10 M; 1×10^-11 M; 2,20×10^-11 M; 2,72×10^-11 M; 4,17×10^-11 M; 5,68×10^-11 M; 7,01×10^-11 M; 7,10×10^-11 M и 9,79×10^-11 M.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к связывающим белкам, способным связывать специфический эпитоп на IL-13. Предпочтительно, специфический эпитоп содержит область С-концевой спирали D IL-13 человека. Более предпочтительно, этот специфический эпитоп содержит аминокислотную последовательность VRDTK IEVAQ FVKDL LL HLK KLFRE GR, соответствующую аминокислотам 104-130 последовательности SEQ ID NO:1. В другом аспекте антитело, или его антигенсвязывающая часть, связывает эпитоп, содержащий область С-концевой спирали D и область N-концевой спирали А IL-13 человека. Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающая часть, связывает IL-13 человека, чтобы IL-13 с указанным антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, связанным с эпитопом, определяемым топографическими областями Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 и Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130 последовательности SEQ ID NO:1, был ингибирован для связывания с IL-13-рецептором. Предпочтительно, это антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает IL-13 человека, чтобы IL-13 с указанным антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, связанным с эпитопом, определяемым топографическими областями Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 и Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127 последовательности SEQ ID NO:1, был ингибирован для связывания с IL-13-рецептором. Предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает IL-13 человека, чтобы IL-13 с указанным антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, связанным с эпитопом, определяемым топографическими областями Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 и Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130 последовательности SEQ ID NO:1 был ингибирован для связывания с IL-13α2-рецептором. Более предпочтительно, антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает IL-13 человека, чтобы IL-13 с указанным антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, связанным с эпитопом, определяемым топографическими областями Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 и Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130 последовательности SEQ ID NO:1 был ингибирован для связывания с IL-13α2-рецептором, при условии, что указанное антитело не является антителом BAK502G9 или MJ2-7. Наиболее предпочтительно, этим антителом является антитело 13C5.5.

В одном из аспектов выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает IL-13 и предотвращает связывание IL-13 с IL-13α2-рецептором с характеристиками связывания, выбранными из группы, состоящей из связывания с эпитопом на IL-13, включающим спирали А и D; константы скорости ассоциации (k_on) приблизительно 10⁵-10⁶ M^-1с^-1 или приблизительно 10⁶-10⁷ M^-1с^-1; константы скорости диссоциации (k_off) приблизительно 10^-4-10^-5 с^-1 или приблизительно 10^-5-10^-6 с^-1, при измерении с помощью резонанса поверхностных плазмонов; и константы диссоциации (K_D) приблизительно 1,5×10^-10-1×10^-10 M или приблизительно 10^-10-10^-11 M. В другом аспекте выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает IL-13 и предотвращает связывание IL-13 с IL-13α2-рецептором с характеристиками связывания, выбранными из группы, состоящей из связывания с эпитопом на IL-13, включающим спирали А и D; константы скорости ассоциации (k_on) приблизительно 10⁵-10⁶ M^-1с^-1 или приблизительно 10⁶-10⁷ M^-1с^-1; константы скорости диссоциации (k_off) приблизительно 10^-4-10^-5 с^-1 или приблизительно 10^-5-10^-6 с^-1, при измерении с помощью резонанса поверхностных плазмонов; и константы диссоциации (K_D) приблизительно 1,5×10^-10-1×10^-10 M или приблизительно 10^-10-10^-11 M.

В одном из аспектов изобретение относится к связывающему белку, способному связывать IL-13, причем указанный антигенсвязывающий домен содержит по меньшей мере один CDR, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

CDR-H1. X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇ (SEQ ID NO:64), где:

X₁ обозначает T, D, G или S;

X₂ обозначает S;

X₃ обозначает D;

X₄ обозначает M, S, Y, L или H;

X₅ обозначает G, W, Y, A, S или N;

X₆ обозначает V, I или M; и

X₇ обозначает D, H, S, Y, N или G;

CDR-H2. X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇ (SEQ ID NO:65), где:

X₁ обозначает M, E, H, R, S, G или L;

X₂ обозначает I или не присутствует;

X₃ обозначает H, Y, A, D, S или W;

X₄ обозначает P, S, W или G;

X₅ обозначает S, G, E или D;

X₆ обозначает D, G, S, E или N;

X₇ обозначает S, Y или G;

X₈ обозначает E, N, Y, V или R;

X₉ обозначает T, I или K;

X₁₀ обозначает R, Y, I, D или A;

X₁₁ обозначает L, Y, D или F;

X₁₂ обозначает N, P, S или D;

X₁₃ обозначает Q, E, D, P или S;

X₁₄ обозначает K, M, S, T, A или V;

X₁₅ обозначает F, L, V или M;

X₁₆ обозначает K, R или Q; и

X₁₇ обозначает D, G или S;

CDR-H3. X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-Х₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄ (SEQ ID NO:66), где:

X₁ обозначает W, T, G, Υ, D или I;

X₂ обозначает R, A, S, G или V;

X₃ обозначает T, F, Y или S;

X₄ обозначает S, T или Y;

X₅ обозначает Y, F или G;

X₆ обозначает F или Y;

X₇ обозначает S, Y, I или F;

X₈ обозначает D, L, Y или P;

X₉ обозначает Y;

X₁₀ обозначает G;

X₁₁ обозначает Y, A, P или E;

X₁₂ обозначает F, M, S, L или I;

X₁₃ обозначает D, V, N или K; и

X₁₄ обозначает Y или F;

CDR-L1. X₁-X₂-X₃-X₄-Х₅-Х₆-Х₇-X₈-X₉-Х₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-Х₁₅-Х₁₆-Х₁₇ (SEQ ID NO:67), где:

X₁ обозначает K или R;

X₂ обозначает S или A;

X₃ обозначает S или T;

X₄ обозначает Q, K или I;

X₅ обозначает N, S, T, G или E;

X₆ обозначает L, T или S;

X₇ обозначает L, Q или V;

X₈ обозначает Y, N, H, D или T;

X₉ обозначает S, I или T;

X₁₀ обозначает S, D, N, H или Y;

X₁₁ обозначает N или G;

X₁₂ обозначает Q;

X₁₃ обозначает K, F, N, E или S;

X₁₄ обозначает N, T или S;

X₁₅ обозначает Y или F;

X₁₆ обозначает L, A или M; и

X₁₇ обозначает A, D, E, H или N;

CDR-L2. X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇ (SEQ ID NO:68), где:

X₁ обозначает L, S, K, T, W или Y;

X₂ обозначает V, T или A;

X₃ обозначает S или N;

X₄ обозначает N, K, T, M или R;

X₅ обозначает R, K или L;

X₆ обозначает F, D, E, H, P или A; и

X₇ обозначает S, R или P; и

CDR-L3. X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉ (SEQ ID NO:69), где:

X₁ обозначает F, W, Q или A;

X₂ обозначает Q или L;

X₃ обозначает H, G, Y, W или N;

X₄ обозначает N, S, T, L или Y;

X₅ обозначает Y, T, S, E или H;

X₆ обозначает L, V, F, Y, N, G, P или D;

X₇ обозначает P или H;

X₈ обозначает L, F, Y, W или R; и

X₉ обозначает T или V.

Предпочтительно, антигенсвязывающий домен содержит по меньшей мере один CDR, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

остатки 31-35 SEQ ID NO:32;

остатки 50-66 SEQ ID NO:32;

остатки 99-105 SEQ ID NO:32;	остатки 99-112 SEQ ID NO:41;
остатки 24-39 SEQ ID NO:33;	остатки 31-35 SEQ ID NO:42;
остатки 55-61 SEQ ID NO:33;	остатки 50-66 SEQ ID NO:42;
остатки 94-102 SEQ ID NO:33;	остатки 99-100 SEQ ID NO:42;
остатки 31-35 SEQ ID NO:34;	остатки 24-39 SEQ ID NO:43;
остатки 50-66 SEQ ID NO:34;	остатки 55-61 SEQ ID NO:43;
остатки 99-105 SEQ ID NO:34;	остатки 94-102 SEQ ID NO:43;
остатки 24-39 SEQ ID NO:35;	остатки 31-35 SEQ ID NO:44;
остатки 55-61 SEQ ID NO:35;	остатки 50-65 SEQ ID NO:44;
остатки 94-102 SEQ ID NO:35;	остатки 98-106 SEQ ID NO:44;
остатки 31-35 SEQ ID NO:36;	остатки 24-40 SEQ ID NO:45;
остатки 50-66 SEQ ID NO:36;	остатки 56-62 SEQ ID NO:45;
остатки 99-109 SEQ ID NO:36;	остатки 95-103 SEQ ID NO:45;
остатки 24-39 SEQ ID NO:37;	остатки 31-37 SEQ ID NO:46;
остатки 55-61 SEQ ID NO:37;	остатки 52-67 SEQ ID NO:46;
остатки 94-102 SEQ ID NO:37;	остатки 100-112 SEQ ID NO:46;
остатки 31-35 SEQ ID NO:38;	остатки 24-34 SEQ ID NO:47;
остатки 50-66 SEQ ID NO:38;	остатки 50-56 SEQ ID NO:47;
остатки 99-109 SEQ ID NO:38;	остатки 89-97 SEQ ID NO:47;
остатки 31-35 SEQ ID NO:39;	остатки 31-37 SEQ ID NO:48;
остатки 50-66 SEQ ID NO:39;	остатки 52-67 SEQ ID NO:48;
остатки 99-112 SEQ ID NO:39;	остатки 100-112 SEQ ID NO:48;
остатки 24-39 SEQ ID NO:40;	остатки 24-34 SEQ ID NO:49;
остатки 55-61 SEQ ID NO:40;	остатки 50-56 SEQ ID NO:49;
остатки 94-102 SEQ ID NO:40;	остатки 89-97 SEQ ID NO:49;
остатки 31-35 SEQ ID NO:41;	остатки 31-37 SEQ ID NO:50;
остатки 50-66 SEQ ID NO:41;	остатки 52-67 SEQ ID NO:50;

остатки 100-112 SEQ ID NO:50;

остатки 24-34 SEQ ID NO:51;

остатки 60-66 SEQ ID NO:51;

остатки 89-97 SEQ ID NO:51;

остатки 31-35 SEQ ID NO:52;

остатки 50-66 SEQ ID NO:52;

остатки 99-107 SEQ ID NO:52;

остатки 23-36 SEQ ID NO:53;

остатки 52-58 SEQ ID NO:53;

остатки 91-99 SEQ ID NO:53;

остатки 31-35 SEQ ID NO:54;

остатки 50-65 SEQ ID NO:54;

остатки 98-107 SEQ ID NO:54;

остатки 24-38 SEQ ID NO:55;

остатки 54-60 SEQ ID NO:55;

остатки 93-101 SEQ ID NO:55;

остатки 31-35 SEQ ID NO:56;

остатки 50-65 SEQ ID NO:56;

остатки 98-107 SEQ ID NO:56;

остатки 24-38 SEQ ID NO:57;

остатки 54-60 SEQ ID NO:57;

остатки 93-101 SEQ ID NO:57;

остатки 31-35 SEQ ID NO:58;

остатки 50-65 SEQ ID NO:58;

остатки 98-107 SEQ ID NO:58;

остатки 24-38 SEQ ID NO:59;

остатки 54-60 SEQ ID NO:59;

остатки 93-101 SEQ ID NO:59;

остатки 31-35 SEQ ID NO:60;

остатки 50-65 SEQ ID NO:60;

остатки 98-107 SEQ ID NO:60;

остатки 24-38 SEQ ID NO:61;

остатки 54-60 SEQ ID NO:61;

остатки 93-101 SEQ ID NO:61;

остатки 31-35 SEQ ID NO:62;

остатки 50-65 SEQ ID NO:62;

остатки 98-107 SEQ ID NO:62;

остатки 24-38 SEQ ID NO:63;

остатки 54-60 SEQ ID NO:63; и

остатки 93-101 SEQ ID NO:63.

В предпочтительном варианте осуществления этот связывающий белок содержит по меньшей мере 3 CDR, выбранных из набора CDR вариабельного домена, состоящего из:

Набор CDR VH 25C8
VH25C8 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:32
VH25C8 CDR-H2	Остатки 50-66 SEQ ID NO:32
VH25C8 CDR-H3	Остатки 99-105 SEQ ID NO:32
Набор CDR VL 25C8
VL 25C8 CDR-L1	Остатки 24-39 SEQ ID NO:33
VL 25C8 CDR-L2	Остатки 55-61 SEQ ID NO:33
VL 25C8 CDR-L3	Остатки 94-102 SEQ ID NO:33
Набор CDR VH 9C11
VH 9C11 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:34
VH 9C11 CDR-H2	Остатки 50-56 SEQ ID NO:34
VH 9C11 CDR-H3	Остатки 99-105 SEQ ID NO:34
Набор CDR VL 9C11
VL 9C11 CDR-L1	Остатки 24-39 SEQ ID NO:35
VL 9C11 CDR-L2	Остатки 55-61 SEQ ID NO:35
VL 9C11 CDR-L3	Остатки 94-102 SEQ ID NO:35
Набор CDR VH 21D9
VH 21D9 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:36
VH 21D9 CDR-H2	Остатки 50-66 SEQ ID NO:36
VH 21D9 CDR-H3	Остатки 99-109 SEQ ID NO:36
Набор CDR VL 21D9
VL 21D9 CDR-L1	Остатки 24-39 SEQ ID NO:37
VL 21D9 CDR-L2	Остатки 55-61 SEQ ID NO:37
VL 21D9 CDR-L3	Остатки 94-102 SEQ ID NO:37
Набор CDR VH 22D10
VH 22D10 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:38
VH 22D10 CDR-H2	Остатки 50-66 SEQ ID NO:38
VH 22D10 CDR-H3	Остатки 99-109 SEQ ID NO:38
Набор CDR VL 22D10
VL 22D10 CDR-L1	Остатки 24-39 SEQ ID NO:37
VL 22D10 CDR-L2	Остатки 55-61 SEQ ID NO:37
VL 22D10 CDR-L3	Остатки 94-102 SEQ ID NO:37
Набор CDR VH 5F1
VH 5F1 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:39
VH 5F1 CDR-H2	Остатки 50-66 SEQ ID NO:39
VH 5F1 CDR-H3	Остатки 99-112 SEQ ID NO:39
Набор CDR VL 5F1
VL SF1 CDR-L1	Остатки 24-39 SEQ ID NO:40
VL SF1 CDR-L2	Остатки 55-61 SEQ ID NO:40
VL SF1 CDR-L3	Остатки 94-102 SEQ ID NO:40
Набор CDR VH 5G1
VH 5G1 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:41
VH 5G1 CDR-H2	Остатки 50-66 SEQ ID NO:41
VH 5G1 CDR-H3	Остатки 99-112 SEQ ID NO:41
Набор CDR VL 5G1
VL 5G1 CDR-L1	Остатки 24-39 SEQ ID NO:40
VL 5G1 CDR-L2	Остатки 55-61 SEQ ID NO:40
VL 5G1 CDR-L3	Остатки 94-102 SEQ ID NO:40
Набор CDR VH 3H7
VH 3H7 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:42
VH 3H7 CDR-H2	Остатки 50-66 SEQ ID NO:42
VH 3H7 CDR-H3	Остатки 99-100 SEQ ID NO:42
Набор CDR VL 3H7
VL 3H7 CDR-L1	Остатки 24-39 SEQ ID NO:43
VL 3H7 CDR-L2	Остатки 55-61 SEQ ID NO:43
VL 3H7 CDR-L3	Остатки 94-102 SEQ ID NO:43
Набор CDR VH 14B2

VH 14B2 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:44
VH 14B2 CDR-H2	Остатки 50-65 SEQ ID NO:44
VH 14B2 CDR-H3	Остатки 98-106 SEQ ID NO:44
Набор CDR VL 14B2
VL 14B2 CDR-L1	Остатки 24-40 SEQ ID NO:45
VL 14B2 CDR-L2	Остатки 56-62 SEQ ID NO:45
VL 14B2 CDR-L3	Остатки 95-103 SEQ ID NO:45
Набор CDR VH 13C5
VH 13C5 CDR-H1	Остатки 31-37 SEQ ID NO:46
VH 13C5 CDR-H2	Остатки 52-67 SEQ ID NO:46
VH 13C5 CDR-H3	Остатки 100-112 SEQ ID NO:46
Набор CDR VL 13C5
VL 13C5 CDR-L1	Остатки 24-34 SEQ ID NO:47
VL 13C5 CDR-L2	Остатки 50-56 SEQ ID NO:47
VL 13C5 CDR-L3	Остатки 89-97 SEQ ID NO:47
Набор CDR VH 29G5
VH 29G5 CDR-H1	Остатки 31-37 SEQ ID NO:48
VH 29G5 CDR-H2	Остатки 52-67 SEQ ID NO:48
VH 29G5 CDR-H3	Остатки 100-112 SEQ ID NO:48
Набор CDR VL 29G5
VL 29G5 CDR-L1	Остатки 24-34 SEQ ID NO:49
VL 29G5 CDR-L2	Остатки 50-56 SEQ ID NO:49
VL 29G5 CDR-L3	Остатки 89-97 SEQ ID NO:49
Набор CDR VH 33C3
VH 33C3 CDR-H1	Остатки 31-37 SEQ ID NO:50
VH 33C3 CDR-H2	Остатки 52-67 SEQ ID NO:50
VH 33C3 CDR-H3	Остатки 100-112 SEQ ID NO:50

Набор CDR VL 33C3
VL 33C3 CDR-L1	Остатки 24-34 SEQ ID NO:51
VL 33C3 CDR-L2	Остатки 60-66 SEQ ID NO:51
VL 33C3 CDR-L3	Остатки 89-97 SEQ ID NO:51
Набор CDR VH 4A8
VH 4A8 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:52
VH 4A8 CDR-H2	Остатки 50-66 SEQ ID NO:52
VH 4A8 CDR-H3	Остатки 99-107 SEQ ID NO:52
Набор CDR VL 4A8
VL 4A8 CDR-L1	Остатки 23-36 SEQ ID NO:53
VL 4A8 CDR-L2	Остатки 52-58 SEQ ID NO:53
VL 4A8 CDR-L3	Остатки 91-99 SEQ ID NO:53
Набор CDR VH 1B6
VH 1B6 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:54
VH 1B6 CDR-H2	Остатки 50-65 SEQ ID NO:54
VH 1B6 CDR-H3	Остатки 98-107 SEQ ID NO:54
Набор CDR VL 1B6
VL 1B6 CDR-L1	Остатки 24-38 SEQ ID NO:55
VL 1B6 CDR-L2	Остатки 54-60 SEQ ID NO:55
VL 1B6 CDR-L3	Остатки 93-101 SEQ ID NO:55
Набор CDR VH 3E5
VH 3E5 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:56
VH 3E5 CDR-H2	Остатки 50-65 SEQ ID NO:56
VH 3E5 CDR-H3	Остатки 98-107 SEQ ID NO:56
Набор CDR VL 3E5
VL 3E5 CDR-L1	Остатки 24-38 SEQ ID NO:57
VL 3E5 CDR-L2	Остатки 54-60 SEQ ID NO:57
VL 3E5 CDR-L3	Остатки 93-101 SEQ ID NO:57
Набор CDR VH 6C8
VH 6C8 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:58
VH 6C8 CDR-H2	Остатки 50-65 SEQ ID NO:58
VH 6C8 CDR-H3	Остатки 98-107 SEQ ID NO:58
Набор CDR VL 6C8
VL 6C8 CDR-L1	Остатки 24-38 SEQ ID NO:59
VL 6C8 CDR-L2	Остатки 54-60 SEQ ID NO:59
VL 6C8 CDR-L3	Остатки 93-101 SEQ ID NO:59
Набор CDR VH 5D3
VH 5D3 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:60
VH 5D3 CDR-H2	Остатки 50-65 SEQ ID NO:60
VH 5D3 CDR-H3	Остатки 98-107 SEQ ID NO:60
Набор CDR VL 5D3
VL 5D3 CDR-L1	Остатки 24-38 SEQ ID NO:61
VL 5D3 CDR-L2	Остатки 54-60 SEQ ID NO:61
VL 5D3 CDR-L3	Остатки 93-101 SEQ ID NO:61
Набор CDR VH 8B6
VH 8B6 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:62
VH 8B6 CDR-H2	Остатки 50-65 SEQ ID NO:62
VH 8B6 CDR-H3	Остатки 98-107 SEQ ID NO:62
Набор CDR VL 8B6
VL 8B6 CDR-L1	Остатки 24-38 SEQ ID NO:63
VL 8B6 CDR-L2	Остатки 54-60 SEQ ID NO:63
VL 8B6 CDR-L3	Остатки 93-101 SEQ ID NO:63

Предпочтительно, связывающий белок содержит по меньшей мере два набора CDR вариабельных доменов. Предпочтительно, по меньшей мере два набора CDR вариабельных доменов выбраны из группы, состоящей из:

Набор CDR VH 25C8 и набор CDR VL 25C8;

Набор CDR VH 9C11 и набор CDR VL 9C11;

Набор CDR VH 21D9 и набор CDR VL 21D9;

Набор CDR VH 22D10 и набор CDR VL 22D10;

Набор CDR VH 5F1 и набор CDR VL 5F1;

набор CDR VH 5G1 и набор CDR VL 5G1;

Набор CDR VH 3H7 и набор CDR VL 3H7;

Набор CDR VH 14B2 и набор CDR VL 14B2;

Набор CDR VH 13C5 и набор CDR VL 13C5;

Набор CDR VH 29G5 и набор CDR VL 29G5;

Набор CDR VH 33C3 и набор CDR VL 33C3;

Набор CDR VH 4A8 и набор CDR VL 4A8;

Набор CDR VH 1B6 и набор CDR VL 1B6;

Набор CDR VH 3E5 и набор CDR VL 3E5;

Набор CDR VH 6C8 и набор CDR VL 6C8;

Набор CDR VH 5D3 и набор CDR VL 5D3 и

набор CDR VH 8B6 и набор CDR VL 8B6.

В другом варианте осуществления описанный выше связывающий белок дополнительно содержит акцепторный каркас человека. Предпочтительно, акцепторный каркас человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SEQ ID NO:6,

SEQ ID NO:7,

SEQ ID NO:8,

SEQ ID NO:9,

SEQ ID NO:10,

SEQ ID NO:11,

SEQ ID NO:12,

SEQ ID NO:13,

SEQ ID NO:14,

SEQ ID NO:15,

SEQ ID NO:16,

SEQ ID NO:17,

SEQ ID NO:18,

SEQ ID NO:19,

SEQ ID NO:20,

SEQ ID NO:21,

SEQ ID NO:22,

SEQ ID NO:23,

SEQ ID NO:24,

SEQ ID NO:25,

SEQ ID NO:26,

SEQ ID NO:27,

SEQ ID NO:28,

SEQ ID NO:29,

SEQ ID NO:30 и

SEQ ID NO:31.

В предпочтительном варианте осуществления связывающим белком является CDR-трансплантированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, способное связывать IL-13. Предпочтительно, CDR-трансплантированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, содержит один или несколько вышеописанных CDR. Предпочтительно, это CDR-трансплантированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, содержит акцепторный каркас человека. Более предпочтительно, акцепторным каркасом человека является любой из акцепторных каркасов человека, описанных выше.

В предпочтительном варианте осуществления связывающим белком является гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, способное связывать IL-13. Предпочтительно, гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, содержит один или несколько вышеописанных CDR, включенных в вариабельный домен антитела человека акцепторного каркаса человека. Предпочтительно, вариабельный домен антитела человека является консенсусным вариабельным доменом человека. Более предпочтительно, акцепторный каркас человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области в качестве ключевого остатка, причем ключевой остаток выбран из группы, состоящей из остатка, смежного с CDR; остатка сайта гликозилирования; необычного остатка; остатка, способного взаимодействовать с IL-13 человека; остатка, способного взаимодействовать с CDR; канонического остатка; контактного остатка между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи; остатка в зоне верньера и остатка в области, которая перекрывается между CDR1 вариабельной тяжелой цепи по определению Хотиа и первым каркасом тяжелой цепи по определению Кабата. Предпочтительно, акцепторный каркас человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области, причем аминокислотная последовательность данного каркаса является по меньшей мере на 65% идентичной последовательности указанного акцепторного каркаса человека и содержит по меньшей мере 70 аминокислотных остатков, идентичных указанному акцепторному каркасу человека. Предпочтительно, эта аминокислотная замена в ключевом остатке выбрана из группы, состоящей из 2L, 15L, 22L, 41L, 42L, 44L, 49L, 50L, 51L, 62L, 71L, 73L, 10H, 44H, 46H, 48H, 67H, 68H, 70H, 72H, 74H, 76H, 83H, 84H, 86H, 87H и 97H.

В предпочтительном варианте осуществления связывающим белком является гуманизированное антитело или его антигенсвязывающая часть, способные связывать IL-13. Предпочтительно, гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, содержит один или несколько CDR, описанных выше. Более предпочтительно, гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, содержит три или более CDR, описанных выше. Наиболее предпочтительно, гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, содержит шесть CDR, описанных выше.

В другом варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, содержит по меньшей мере один вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SEQ ID NO:70,

SEQ ID NO:71,

SEQ ID NO:72,

SEQ ID NO:73,

SEQ ID NO:74,

SEQ ID NO:75,

SEQ ID NO:76,

SEQ ID NO:77,

SEQ ID NO:78,

SEQ ID NO:79,

SEQ ID NO:80,

SEQ ID NO:81,

SEQ ID NO:82,

SEQ ID NO:83,

SEQ ID NO:84,

SEQ ID NO:85,

SEQ ID NO:92,

SEQ ID NO:93 и

SEQ ID NO:94.

Более предпочтительно гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающая часть, содержит два вариабельных домена, выбранных из вышеописанной группы. Более предпочтительно, связывающий белок содержит два вариабельных домена, причем указанные два вариабельных домена имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

SEQ ID NO:70 и SEQ ID NO:71,

SEQ ID NO:72 и SEQ ID NO:73,

SEQ ID NO:74 и SEQ ID NO:75,

SEQ ID NO:76 и SEQ ID NO:77,

SEQ ID NO:78 и SEQ ID NO:79,

SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:81,

SEQ ID NO:82 и SEQ ID NO:83,

SEQ ID NO:84 и SEQ ID NO:85,

SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:92,

SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:93, и

SEQ ID NO:80 и SEQ ID NO:94.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к конструкции антитела, содержащей любой из вышеописанных связывающих белков и линкерный полипептид или иммуноглобулин. В предпочтительном варианте осуществления конструкция антитела выбрана из группы, состоящей из молекулы иммуноглобулина, моноклонального антитела, химерного антитела, CDR-трансплантированного антитела, гуманизированного антитела, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, дисульфид-связанного Fv, scFv, однодоменного антитела, диатела, мультиспецифического антитела, антитела с двойной специфичностью и биспецифического антитела. В предпочтительном варианте осуществления эта конструкция антитела содержит константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из константного домена IgM человека, константного домена IgG1 человека, константного домена IgG2 человека, константного домена IgG3 человека, константного домена IgG4 человека, константного домена IgE человека и константного домена IgA человека. Более предпочтительно, эта конструкция антитела содержит SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5. В другом варианте осуществления изобретение относится к конъюгату антитела, содержащему вышеописанную конструкцию и агент, выбранный из группы, состоящей из: молекулы иммуноадгезии, агента визуализации, терапевтического агента и цитотоксического средства. В предпочтительном варианте осуществления агент визуализации выбран из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента,

Интерлейкин-13-связывающие белки

Патент 2472807