Менингококковые полипептиды fhbp

Менингококковые полипептиды fhbp

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области иммунизации и, в частности, иммунизации против заболеваний, вызванных патогенными бактериями рода Neisseria, такими как N. meningitidis (менингококк).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Neisseria meningitidis является грамотрицательной инкапсулированной бактерией, которая колонизирует верхние дыхательные пути примерно у 10% людей в популяции. Хотя имеются полисахаридные и конъюгированные вакцины против серогрупп A, C, W135 и Y, такой способ не может быть применен по отношению к серогруппе B, так как полисахарид капсулы является полимером полисиаловой кислоты, которая является аутоантигеном у человека. Чтобы разработать вакцину против серогруппы B, использовали экспонированные на поверхности белки, находящиеся в везикулах наружной мембраны (OMV). Такие вакцины вызывают гуморальные ответы в виде бактерицидных антител в сыворотке и защищают от заболевания, но они не способны индуцировать перекрестную защиту от других штаммов [1]. Поэтому некоторые исследователи сфокусировали свое внимание на специфичных менингококковых антигенах для применения их в вакцинах [2].

Одним из таких антигенов является менингококковый белок, связывающий фактор H (fHBP), также известный как белок "741" [SEQ ID 2535 и 2536 в ссылке 3; SEQ ID 1 в настоящем описании], "NMB1870", "GNA1870" [ссылки 4-6, после публикации 2], "P2086", "LP2086" или ORF2086" [7-9]. Этот липопротеин экспрессируется во всех многочисленных менингококковых штаммах. Последовательности fHBP были сгруппированы в три семейства [4] (называемые в настоящем описании семействами I, II и III), и было обнаружено, что сыворотка, полученная против определенного семейства, является бактерицидной в случае такого же семейства, но не активна против штаммов, которые экспрессируют одно из двух других семейств, т.е. существует перекрестная защита в пределах семейства, но нет перекрестной защиты между разными семействами.

Поэтому, чтобы добиться перекрестной защиты от разных штаммов с использованием fHBP, используют более одного семейства. Чтобы избежать необходимости в экспрессии и очистке отдельных белков, было предложено экспрессировать разные семейства в виде гибридных белков [10-12], включающих два или три семейства в виде одной полипептидной цепи. В публикациях 13 и 14 описаны различные основанные на мутагенезе способы модификации последовательностей fHBP для увеличения их сферы действия в случаях семейств I, II и III.

Целью настоящего изобретения являются дополнительные и улучшенные способы преодоления специфичности защиты по отношению к определенным семействам, обеспечиваемой fHBP, и применение таких способов для обеспечения иммунитета против менингококкового заболевания и/или инфекции, особенно для случая серогруппы B.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полноразмерный fHBP имеет следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1) у штамма MC58:

В зрелом липопротеине отсутствуют первые 19 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 1, и в ΔG форме fHBP отсутствуют первые 26 аминокислот.

Последовательность MC58 (SEQ ID NO: 1) имеется в fHBP семейства I. Антитела, полученные с использованием последовательности MC58, обладают высокой бактерицидной активностью против штамма MC58, но намного более низкой активностью против штаммов, которые экспрессируют fHBP семейства II или III. В некоторых вариантах изобретение относится к модифицированным формам fHBP, при этом модификация (модификации) повышают способность белка вызывать образование бактерицидных антител, перекрестно действующих на разные семейства. В других вариантах изобретение относится к формам fHBP, которые обычно вызывают образование бактерицидных антител, перекрестно действующих на разные семейства.

Соответственно, изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 и 77. Такие аминокислотные последовательности начинаются с остатка, который соответствует Val-27 последовательности MC58, но включают различные аминокислотные модификации в ниже расположенных участках.

Предпочтительными являются две последовательности, SEQ ID NO: 20 и 23. Также предпочтительна последовательность SEQ ID NO: 76.

Полипептиды обладают способностью индуцировать бактерицидные противоменингококковые антитела после введения животному-хозяину, и в предпочтительных вариантах могут индуцировать антитела, которые являются бактерицидными против штаммов в каждом из трех семейств fHBP I-III. Дополнительная информация о бактерицидных ответах приведена ниже.

Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, k% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 76. Значение k может выбрано из 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более.

Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, содержащую первый фрагмент и второй фрагмент последовательности SEQ ID NO: 76, при этом указанный первый фрагмент включает эпитоп, находящийся в пределах аминокислот 89-154 последовательности SEQ ID NO: 76, и указанный второй фрагмент включает эпитоп, находящийся в пределах аминокислот 187-248 последовательности SEQ ID NO: 76. Обычно первый и второй фрагменты независимо имеют длину, по меньшей мере, 7 аминокислот, например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60 аминокислот или более.

Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая (i) имеет, по меньшей мере, k% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 76 и (ii) содержит указанный первый и второй фрагменты последовательности SEQ ID NO: 76.

Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, но в которой один или несколько остатков 127, 128, 133, 135, 136, 139, 140, 142, 144, 146, 148, 155, 156, 158, 160, 162, 166, 167, 171, 173, 179, 182, 185, 188, 190, 193, 197, 202, 204, 206, 208, 209, 210, 223, 235, 236 и/или 237 были либо заменены другой аминокислотой, либо делетированы. Замена может быть осуществлена аминокислотой из соответствующего положения в последовательности SEQ ID NO: 2. Полипептид может вызывать образование антител, которые могут связываться с обеими последовательностями, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, но в которой один или несколько остатков 146, 148, 155, 156, 158, 160, 162, 171, 173, 179, 182, 235, 236 и/или 237 были заменены другой аминокислотой. Замена может быть осуществлена аминокислотой из соответствующего положения в последовательности SEQ ID NO: 2. Полипептид может вызывать образование антител, которые могут связываться с обеими последовательностями, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, но в которой один или несколько остатков 127, 128, 133, 135, 136, 139, 140, 141, 142, 144, 166, 167, 185, 188, 190, 193, 197, 202, 204, 206, 208, 209, 210 и/или 223 были либо заменены другой аминокислотой, либо делетированы. Замена может быть осуществлена аминокислотой из соответствующего положения в последовательности SEQ ID NO: 2. Полипептид может вызывать образование антител, которые могут связываться с обеими последовательностями, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Полипептиды

Полипептиды согласно изобретению могут быть получены различными способами, например химическим синтезом (по меньшей мере, частично), расщеплением более длинных полипептидов с использованием протеаз, трансляцией с РНК, очисткой из культуры клеток (например, из культуры рекомбинантных экспрессирующих клеток или из культуры N. meningitidis) и т.д. Предпочтительным путем экспрессии является гетерологичная экспрессия в хозяине E. coli.

fHBP является природным липопротеином N. meningitidis. Также обнаружено, что он липидизируется при экспрессии в E. coli с нативной лидерной последовательностью. Полипептиды согласно изобретению могут иметь N-концевой остаток цистеина, который может быть липидизирован, например, содержать группу пальмитоила, обычно с образованием трипальмитоил-S-глицерилцистеина. В других вариантах полипептиды не липидизированы.

Характерной особенностью предпочтительных полипептидов согласно изобретению является способность индуцировать бактерицидные противоменингококковые антитела после введения животному-хозяину.

Полипептиды предпочтительно получают, по существу, в очищенной или, по существу, выделенной форме (т.е. в форме, по существу, не содержащей других полипептидов клеток Neisseria или клеток-хозяев) или, по существу, изолированной форме. В общем, предлагаются полипептиды в не встречающемся в природе окружении, например, их выделяют из встречающейся в природе окружающей среды. В некоторых вариантах данный полипептид присутствует в композиции, которая обогащена полипептидом по сравнению с контролем. По существу, предлагается очищенный полипептид, при этом "очищенный" означает, что полипептид присутствует в композиции, которая, по существу, не содержит других экспрессированных полипептидов, при этом "по существу, не содержит" означает, что менее чем 90%, обычно менее чем 60% и более предпочтительно менее чем 50% композиции состоит из других экспрессированных полипептидов.

Полипептиды могут иметь различные формы (например, нативную, слитую, гликозилированную, негликозилированную, липидизированную, с дисульфидными мостиками и т.д.).

Последовательности SEQ ID NO: 4-76 не содержат N-концевого метионина. Если полипептид согласно изобретению получают в результате трансляции в биологическом хозяине, то требуется стартовый кодон, который будет обеспечивать наличие N-концевого метионина у большинства хозяев. Таким образом, полипептид согласно изобретению будет, по меньшей мере, на стадии возникновения, включать остаток метионина, расположенный выше указанной последовательности.

В некоторых вариантах полипептид имеет один метионин на N-конце, непосредственно за которым следует последовательность; в других вариантах может быть использована более длинная расположенная выше последовательность. Такая расположенная выше последовательность может быть короткой (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности для управления транспортом белка или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, гистидиновые метки, т.е. Hisn, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более). Другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области.

Полипептид согласно изобретению также может включать аминокислоты, расположенные ниже конечной аминокислоты последовательностей. Такие C-концевые удлинения могут быть короткими (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают последовательности для управления транспортом белков, короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, содержащие гистидиновые метки, т.е. Hisn, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более), или последовательности, которые повышают стабильность полипептида. Другие подходящие C-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов а данной области.

Термин "полипептид" относится к полимерам аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и он может прерываться неаминокислотными остатками. Термины также охватывают полимер аминокислот, который был модифицирован естественным образом или в результате вмешательства; например, образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой обработки, или такой модификации, как конъюгирование с метящим компонентом. Также в указанное определение включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Полипептиды могут быть в виде отдельных цепей или ассоциированных цепей.

Полипептиды согласно изобретению могут быть связаны или иммобилизованы на твердой подложке.

Полипептиды согласно изобретению могут содержать регистрируемую метку, например, радиоактивную метку, флуоресцирующую метку или биотиновую метку. Такие полипептиды особенно применимы в способах иммуноанализа.

Как описано в публикации 13, fHBP может быть расщеплен на три домена, называемых A, B и C. Если рассматривать последовательность SEQ ID NO: 1, то три домена представляют собой домены (A) 1-119, (B) 120-183 и (C) 184-274:

Зрелую форму домена "A" от Cys-20 на N-конце до Lys-119 называют "A_зрелый".

Известно множество последовательностей fHBP, и их можно легко выравнивать, используя стандартные способы. С помощью таких выравниваний специалист может идентифицировать (a) домены "A" (и "A_зрелый"), "B" и "C" в любой данной последовательности fHBP благодаря сравнению с координатами в последовательности MC58, и (b) отдельные остатки в различных последовательностях fHBP, например, для идентификации замен. Однако для упрощения ссылок домены определены ниже:

- Домен "A" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Met-1 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Lys-119 последовательности SEQ ID NO: 1.

- Домен "A_зрелый" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Cys-20 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Lys-119 последовательности SEQ ID NO: 1.

- Домен "B" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Gln-120 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Gly-183 последовательности SEQ ID NO: 1.

- Домен "C" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Lys-184 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Gln-274 последовательности SEQ ID NO: 1.

Предпочтительным алгоритмом попарного выравнивания для определения доменов является алгоритм глобального выравнивания Нидлемана-Вунша [15] с использованием параметров по умолчанию (например, с использованием штрафа за открытие пробела =10,0 и штрафа за удлинение пробела = 0,5, используя матрицу подсчета EBLOSUM62). Такой алгоритм осуществляется в программе NEEDLE из пакета EMBOSS [16].

В некоторых вариантах полипептид согласно изобретению укорочен с удалением его домена A, т.е. домен A исключен из последовательности.

В некоторых вариантах полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая описана выше, за исключением того, что до 10 аминокислот (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) на N-конце и/или до 10 аминокислот (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) на C-конце делетированы. Таким образом, в изобретении предлагается полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая включает фрагмент аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 и 77, при этом указанный фрагмент представляет собой аминокислоты a-b указанной последовательности, где a означает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11, и где b означает j, j-1, j-2, j-3, j-4, j-5, j-6, j-7, j-8, j-9 или j-10, где j означает длину указанной последовательности. Также можно использовать более длинные укорочения (например, до 15 аминокислот, до 20 аминокислот и т.д.).

Нуклеиновые кислоты

Изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид согласно изобретению, который определен выше.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть получены различными способами, например химическим синтезом (например, фосфорамидитным синтезом ДНК) полностью или частично, расщеплением более длинных нуклеиновых кислот с использованием нуклеаз (например, ферментов рестрикции), связыванием более коротких нуклеиновых кислот или нуклеотидов (например, с использованием лигаз или полимераз), из библиотек геномной или кДНК и т.д.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут иметь различные формы, например, однонитевые, двунитевые, векторы, праймеры, зонды, меченые, немеченые и т.д.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению предпочтительно находятся в изолированной или, по существу, изолированной форме.

Термин "нуклеиновая кислота" включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы, а также пептидонуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.

Нуклеиновую кислоту согласно изобретению можно метить, например, радиоактивной или флуоресцентной меткой.

Изобретение также относится в векторам (таким как плазмиды), содержащим нуклеотидные последовательности согласно изобретению (например, клонирующим или экспрессирующим векторам, таким как векторы, подходящие для иммунизации нуклеиновыми кислотами) и клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами.

Бактерицидные ответы

Предпочтительные полипептиды согласно изобретению могут вызывать гуморальный ответ в виде антител, которые являются бактерицидными по отношению к менингококкам. Образование бактерицидных антител обычно измеряют у мышей, и они являются стандартным показателем эффективности вакцины [например, см. сноска 14 в публикации 2]. Полипептиды согласно изобретению предпочтительно могут вызывать гуморальный ответ, который является бактерицидным против, по меньшей мере, одного штамма N. meningitidis из каждой из, по меньшей мере, двух из следующих трех групп штаммов:

(I) MC58, gbl85 (=M01-240185), m4030, m2197, m2937, iss1001, NZ394/98, 67/00, 93/114, bz198, m1390, nge28, Inp17592, 00-241341, f6124, 205900, m198/172, bz133, gb149 (=M01-240149), nm008, nm092, 30/00, 39/99, 72/00, 95330, bz169, bz83, cu385, h44/76, m1590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89, 14847.

(II) 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (=M01-240013), e32, m1090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, ell, m986, m2671, 1000, m1096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, L93/4286.

(III) M1239, 16889, gb355 (=M01-240355), m3369, m3813, ngp165.

Например, полипептид может вызывать бактерицидный ответ, эффективный против двух или трех штаммов N. meningitidis серогруппы В МС58, 961-5945 и М1239.

Полипептид предпочтительно может вызывать гуморальный ответ в виде антител, которые являются бактерицидными против, по меньшей мере, 50% клинически значимых менингококковых штаммов серогруппы В (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более). Полипептид может вызывать гуморальный ответ, который является бактерицидным против штаммов N. meningitidis серогруппы В и штаммов, по меньшей мере, одной (например 1, 2, 3, 4) из серогрупп А, С, W135 и Y. Полипептид может вызывать гуморальный ответ, который является бактерицидным против штаммов N. gonorrhoeae и/или N. cinerea. Полипептид может вызывать ответ, который является бактерицидным против штаммов, по меньшей мере, двух из трех основных ветвей дендрограммы, показанной на фигуре 5 в публикации 4.

Полипептид может вызывать гуморальный ответ, который является бактерицидным против штаммов N. meningitidis, по меньшей мере, 2 (например 2, 3, 4, 5, 6, 7) гипервирулентных линий ЕТ-37, ЕТ-5, кластера А4, линии 3, подгруппы I, подгруппы III и подгруппы IV-1 [17,18]. Полипептиды могут дополнительно индуцировать бактерицидные гуморальные ответы в виде антител против одной или нескольких гиперинвазивных линий.

Полипептиды могут вызывать гуморальный ответ в виде антител, бактерицидных против штаммов N. meningitidis, по меньшей мере, 2 (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7) из следующих типов многолокусных последовательностей: ST1, ST4, ST5, ST8, ST11, ST32 и ST41 [19]. Полипептид также может вызывать гуморальный ответ в виде антител, которые являются бактерицидными против штаммов ST44.

Полипептид не должен индуцировать бактерицидные антитела против всех без исключения штаммов МеnВ в пределах конкретных линий или MLST; а для любой данной группы из четырех или более штаммов менингококка серогруппы В в пределах конкретной гипервирулентной линии или MLST антитела, индуцированные композицией, предпочтительно являются бактерицидными против, по меньшей мере, 50% (например 60%, 70%, 80%, 90% или более) группы. Предпочтительные группы штаммов будут включать штаммы, выделенные, по меньшей мере, в четырех из следующих стран: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR и CU. Сыворотка предпочтительно имеет бактерицидный титр, по меньшей мере, 1024 (например, 2¹⁰, 2¹¹, 2¹², 2¹³, 2¹⁴, 2¹⁵, 2¹⁶, 2¹⁷, 2¹⁸ или выше, предпочтительно, по меньшей мере, 2¹⁴), т.е. сыворотка способна уничтожать, по меньшей мере, 50% тестируемых бактерий конкретного штамма при разведении 1:1024, например, как описано в пояснении 14 в публикации 2. Предпочтительные химерные полипептиды могут вызывать гуморальный иммунный ответ у мышей, который остается бактерицидным, даже когда сыворотку разводят 1:4096 или больше.

Иммунизация

Полипептиды согласно изобретению можно применять в качестве активного ингредиента иммуногенных композиций, и таким образом изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей полипептид согласно изобретению.

Изобретение также относится к способу, позволяющему вызывать гуморальный ответ у млекопитающего, включающему введение млекопитающему иммуногенной композиции согласно изобретению. Гуморальный ответ предпочтительно является защитным и/или бактерицидным гуморальным ответом. Изобретение также относится к полипептидам согласно изобретению для применения в таких способах.

Изобретение также относится к способу защиты млекопитающего от инфекции, вызванной Neisseria (например, менингококковой инфекции), включающему введение млекопитающему иммуногенной композиции согласно изобретению.

Изобретение относится к полипептидам согласно изобретению для применения в качестве лекарственных средств (например, в виде иммуногенных композиций или в виде вакцин) или в качестве диагностических реагентов. Изобретение также относится к применению нуклеиновой кислоты, полипептида или антитела согласно изобретению в производстве лекарственного средства для предотвращения инфекции, вызванной Neisseria (например, менингококковой инфекции), у млекопитающего.

Млекопитающим предпочтительно является человек. Человек может быть взрослым или предпочтительно ребенком. В том случае, когда вакцина предназначена для профилактического применения, человек предпочтительно является ребенком (например, ребенком раннего возраста или новорожденным); в том случае, когда вакцина предназначена для терапевтического применения, человек предпочтительно является взрослым. Вакцина, предназначенная для детей, также может быть введена взрослым, например, для оценки безопасности, дозы, иммуногенности и т.д.

Применения и способы особенно применимы для профилактики/лечения заболеваний, включая без ограничения менингит (в частности, бактериальный, такой как менингококковый менингит) и бактериемию.

Эффективность терапевтического лечения можно проверить посредством мониторинга вызванной Neisseria инфекции после введения композиции согласно изобретению. Эффективность профилактического лечения можно тестировать посредством мониторинга иммунных ответов против fHBP после введения композиции. Иммуногенность композиций согласно изобретению можно определить посредством их введения тестируемым субъектам (например, детям в возрасте 12-16 месяцев, или в моделях на животных [20]) и последующего определения стандартных параметров, включая сывороточные бактерицидные антитела (SBA) и титры ELISA (GMT). Такие иммунные ответы, как правило, можно определить примерно через 4 недели после введения композиции и сравнить со значениями, определенными до введения композиции. Предпочтительно увеличение SBA, по меньшей мере, в 4 раза или 8 раз. При введении более одной дозы композиции можно осуществить более одного определения после введения.

Предпочтительные композиции согласно изобретению могут приводить к титру антител у пациента, который превосходит критерий серологической защиты в отношении каждого антигенного компонента для приемлемой части людей. Антигены и ассоциированные титры антител, выше которых хозяина считают сероконвертированным против антигена, хорошо известны, и такие титры публикуются такими организациями, как ВОЗ. Предпочтительно сероконвертировано более чем 80% статистически значимой выборки субъектов, более предпочтительно более чем 90%, еще более предпочтительно более чем 93% и наиболее предпочтительно 96-100%.

Композиции согласно изобретению, как правило, можно будет непосредственно вводить пациенту. Прямую доставку можно осуществлять парентеральной инъекцией (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно или в интерстициальное пространство ткани) или посредством ректального, перорального, вагинального, местного, трансдермального, интраназального, глазного, ушного, легочного или другого введения через слизистую оболочку. Предпочтительным является внутримышечное введение в бедро или плечо. Инъекцию можно осуществлять через иглу (например, иглу для подкожных вливаний), но альтернативно можно использовать безыгольную инъекцию. Типичная внутримышечная доза составляет около 0,5 мл.

Изобретение можно использовать для того, чтобы вызвать системную иммунную защиту и/или иммунную защиту, обеспечиваемую слизистой оболочкой.

Дозированная обработка может быть осуществлена по схеме с использованием однократной дозы или по схеме с использованием многократных доз. Многократные дозы можно использовать в схеме первичной иммунизации и/или в схеме бустер-иммунизации. После схемы введения первичных доз может следовать схема введения бустер-доз. Подходящий период времени между примирующими дозами (например, от 4 до 16 недель) и между примированием и реиммунизацией можно определить обычными способами.

Иммуногенная композиция согласно изобретению обычно будет содержать фармацевтически приемлемый носитель, который может представлять собой любое вещество, которое само по себе не индуцирует продукцию антител, опасных для пациента, получающего композицию, и которое можно вводить, не опасаясь чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые носители могут включать жидкости, такие как вода, физиологический раствор соли, глицерин и этанол. Вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, вещества для pH-буферов и тому подобные, также могут присутствовать в таких наполнителях. Всестороннее обсуждение подходящих носителей приведено в публикации 21.

Инфекции, вызванные Neisseria, поражают различные системы организма и, следовательно, композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть приготовлены в виде инъекционных препаратов, либо в виде жидких растворов, либо суспензий. Также могут быть приготовлены твердые формы для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Композиция может быть приготовлена для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Композиция может быть приготовлена для перорального введения, например, в виде таблетки или капсулы, или в виде сиропа (необязательно с корригентами). Композиция может быть приготовлена для легочного введения, например в виде ингалятора, с использованием тонкодисперсного порошка или спрея. Композиция может быть приготовлена в виде суппозитория или пессария. Композиция может быть приготовлена для назального, ушного или глазного введения, например, в виде капель.

Композиция предпочтительно является стерильной. Предпочтительно композиция является апирогенной. Предпочтительно она забуферена, например, от pH 6 до pH 8, обычно около pH 7. В том случае, когда композиция содержит соль гидроксида алюминия, предпочтительно используют гистидиновый буфер [22]. Композиции согласно изобретению могут быть изотоничными для организма человека.

Иммуногенные композиции содержат иммунологически эффективное количество иммуногена, а также, при необходимости, любые другие определенные компоненты. Под "иммунологически эффективным количеством" подразумевают, что введение такого количества пациенту, либо в однократной дозе, либо в виде части серии доз, является эффективным для лечения или профилактики. Такое количество варьируется в зависимости от состояния здоровья и физического состояния пациента, подвергаемого лечению, возраста, таксономической группы пациента, подвергаемого лечению (например, примата, не являющегося человеком, примата и т.д.), способности индивидуальной иммунной системы синтезировать антитела, степени требуемой защиты, состава вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других важных факторов. Предполагается, что количество будет иметь относительно широкий диапазон, который может быть определен в обычных испытаниях. Дозированная обработка может быть осуществлена по схеме с использованием однократной дозы или по схеме с использованием многократных доз (например, включая бустер-дозы). Композицию можно вводить вместе с другими иммунорегулирующими средствами.

Адъюванты, которые можно использовать в композициях согласно изобретению, включают без ограничения:

A. Композиции, содержащие минеральные вещества

Содержащие минеральные вещества композиции, подходящие для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция. Изобретение предусматривает наличие минеральных солей, таких как гидроксиды (например, гидроокиси), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [например, см. главы 8 и 9 в публикации 23] или смеси различных минеральных соединений, при этом соединения имеют любую подходящую форму (например, гель, кристаллическое вещество, аморфное вещество и т.д.), и при этом предпочтительна адсорбция. Содержащие минеральные вещества композиции также могут быть приготовлены в виде частицы соли металла [24].

Применимый адъювант на основе фосфата алюминия представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением PO₄/Al от 0,84 до 0,92, включаемый в количестве 0,6 мг Al³⁺/мл.

B. Масляные эмульсии

Композиции в виде масляных эмульсий, подходящие для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают эмульсии типа "сквален в воде", такие как MF59 [глава 10 в публикации 23; см. также ссылку 25] (5% сквален, 0,5% твин-80 и 0,5% Span 85, приготовленные в виде субмикронных частиц с использованием микрофлюидизатора). Также можно использовать полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA).

Применимые эмульсии типа "масло в воде" обычно содержат, по меньшей мере, одно масло и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество, при этом масло (масла) и поверхностно-активное вещество (вещества) являются биоразрушаемыми (метаболизируемыми) и биосовместимыми. Капельки масла в эмульсии обычно имеют диаметр менее 1 мкм, при этом такие небольшие размеры достигаются с использованием микрофлюидизатора для того, чтобы получить стабильные эмульсии. Капельки размером менее 220 нм являются предпочтительными, так как их можно подвергать стерилизации фильтрованием.

Эмульсия может содержать такие масла, как масла, полученные из животного (например, рыб) или растительного источника. Источниками растительных масел являются орехи, семена и зерна. Арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло являются наиболее доступными примерами масел из орехов. Можно использовать, например, масло жожоба, получаемое из бобов жожоба. Масла из семян включают сафлоровое масло, масло из семян хлопка, масло из семян подсолнечника, масло из семян кунжута и тому подобные. В группе зерновых наиболее легко доступным является кукурузное масло, но также можно использовать масло из других зерновых культур, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тэфф, тритикале и тому подобные. Сложные эфиры 6-10-углеродных жирных кислот и глицерина и 1,2-пропандиола, хотя и не встречаются в природе в маслах из семян, могут быть получены в результате гидролиза, разделения и этерификации соответствующих веществ, исходно получаемых из масел орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих могут метаболизироваться, и поэтому их можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения. Способы разделения, очистки, омыления и другие способы, необходимые для получения чистых масел из животных источников, хорошо известны в данной области. Большинство рыб содержат метаболизируемые жиры, которые могут быть легко извлечены. Например, жир печени трески, жир печени акулы и китовый жир, такой как спермацет, являются примерами некоторых рыбьих жиров, которые можно использовать в настоящем изобретении. Несколько жиров с разветвленными цепями синтезируются биохимически в виде 5-углеродных изопреновых единиц, которые обычно называют терпеноидами. Жир печени акулы содержит разветвленные ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, который является особенно предпочтительным для настоящего изобретения. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также представляет собой предпочтительный жир. Рыбьи жиры, включая сквален и сквалан, легко доступны из коммерческих источников или могут быть получены способами, известными в данной области. Другими предпочтительными маслами являются токоферолы (см. ниже). Можно использовать смеси масел.

Поверхностно-активные вещества можно классифицировать по их "HLB" (гидрофильный/липофильный баланс). Предпочтительные поверхностно-активные вещества согласно изобретению имеют HLB, по меньшей мере, равный 10, предпочтительно, по меньшей мере 15 и более предпочтительно, по меньшей мере 16. В изобретении можно использовать поверхностно-активные вещества, включая без ограничения: поверхностно-активные вещества на основе сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (обычно называемых твинами), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO), продаваемые под торговой маркой DOWFAX^TM, такие как линейные блок-сополимеры EO/PO; октоксинолы, которые могут варьировать по количеству повторяющихся групп этокси(окси-1,2-этандиила), при этом особый интерес представляет октоксинол-9 (тритон X-100 или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); нонилфенолэтоксилаты, такие как серии NP Tergitol^TM; простые жирные эфиры полиоксиэтилена, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Brij), такие как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (обычно известные как SPAN), такие как триолеат сорбитана (Span 85) и монолаурат сорбитана. Предпочтительными являются неионогенные поверхностно-активные вещества. Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются твин-80 (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана), Span 85 (триолеат сорбитана), лецитин и тритон X-100.

Можно использовать смеси поверхностно-активных веществ, например смеси твин-80/Span 85. Также подходящим является сочетание сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (твин-80), и октоксинола, такого как трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (тритон X-100). Другое применимое сочетание содержит лаурет 9 плюс сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол.

Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ (% масс.) составляют: сложн