Сокращение ущерба от окислительного стресса в процессе и после физической нагрузки

Сокращение ущерба от окислительного стресса в процессе и после физической нагрузки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к сокращению обусловленного окислительным стрессом повреждения тканей в ходе или после физической нагрузки путем потребления полифенолов, конкретнее - путем потребления полифенолов какао, как, например, катехина и эпикатехина и родственных процианидинов, например, путем потребления темного шоколада, какао-массы или какао-порошка.

Уровень техники

Хорошо известно, что физическая нагрузка вызывает повреждение работающих мышц, обусловленное окислительным стрессом - образованием свободных радикалов и других активных форм кислорода (ROS). Эти соединения вызывают окисление белков, возможно, давая вклад в развитие мышечной усталости. Мышечные клетки могут быть защищены от этих ROS совместным действием собственных защитных механизмов, в которых играют роль антиоксиданты. Обусловленные окислительным стрессом феномены считались вредоносными и потому нежелательными, однако недавние исследования заставляют полагать, что в некоторой степени окислительный стресс нужен для нормальной физиологической адаптации к физической нагрузке и оптимизации тренировки (Gomez-Cabrera et al., 2005, 2008). Отсюда делается предположение, что регулярный прием антиоксидантных витаминов в высоких дозах может ослабить благоприятную адаптацию при физической тренировке (Padilla & Mickleborough, 2007). Но этот вопрос остается спорным, да и мало что известно о потенциальном эффекте регулярного приема полифенолов в сравнении с антиоксидантными витаминами С и Е.

Имеются некоторые свидетельства того, что антиоксидантные биологически активные добавки могут улучшать выполнение человеком физической работы/спортивного упражнения и уменьшать иммунодепрессию (т.е. подверженность таким состояниям, как инфекции дыхательных путей), которая может быть следствием интенсивной физической нагрузки; правда, в большинстве своем эти данные касаются лишь витаминов С или Е, а не тех антиоксидантов, которые обычно встречаются в природе.

Известно, что полифенолы обладают выраженными антиоксидантными свойствами; эти вещества присутствуют во многих растительных источниках: какао, чае, многих фруктах (в том числе в ягодах). Одним из богатейших источников различных антиоксидантных полифенолов является темный шоколад. Содержащиеся в какао-бобах полифенолы, в особенности катехин и эпикатехин, будучи амфипатическими, могут проявлять свое антиоксидантное действие как в липидном, так и в водном окружении, т.е. способны заменять как липофильные, так и гидрофильные эндогенные антиоксиданты, например витамины. Имеются также данные о том, что полифенолы могут вызывать расширение кровеносных сосудов, тем самым способствуя кровоснабжению мышц, что важно и для выполнения физической работы (спортивных упражнений), и для восстановления после нее; кроме того, полифенолы, во-видимому, отсрочивают окисление липопротеинов низкой плотности (LDL). По наблюдениям Kondo et al. (1996) после потребления 35 г обезжиренного какао снижается подверженность окислению липопротеинов низкой плотности (LDL) плазмы крови.

В других исследованиях продемонстрировано благотворное влияние постоянного потребления какао или темного шоколада у здоровых испытуемых (обычно потребление темного шоколада составляло 100 г/сут в течение 2 недель или более) на кровяное давление в состоянии покоя и на чувствительность к инсулину (Grassi et al., 2005) или на профиль холестерин (повышение концентрации липопротеинов высокой плотности - HDL) и понижение восприимчивости LDL к окислению ex vivo (Mursu et al., 2004).

В патенте US 6297273 В1 раскрываются экстракты какао и содержащиеся в них такие соединения, как полифенолы, предпочтительно полифенолы, обогащенные процианидинами, и их применение; например, в качестве агентов, противодействующих неоплазии, антиоксидантов, ингибиторов ДНК-топоизомеразы II, модуляторов циклооксигеназы и/или липоксигеназы, модуляторов оксида азота (NO) или NO-синтазы, в качестве нестероидных противовоспалительных средств, модуляторов апоптоза, модуляторов агрегации тромбоцитов, уровня глюкозы в крови in vivo, противомикробных агентов и ингибиторов окислительного повреждения ДНК.

В Примере 27 описано влияние полифенолов какао на пищевое насыщение; уровни глюкозы в крови использовались как показатели сигнальных процессов, происходящих in vivo для регуляции аппетита и насыщения; был осуществлен ряд простых опытов на испытуемых-добровольцах (здоровых мужчинах в возрасте 48 лет) с целью определить, влияют ли полифенолы какао на уровень глюкозы. В полифенолах какао отсутствуют кофеин и теобромин. Уровень глюкозы в крови натощак определяли в зависимости от времени после приема внутрь 10 унций напитка Dexicola 75 (не содержащего кофеина) из набора для определения толерантности к глюкозе с 75 мг полифенолов какао и без них. Уровень глюкозы в крови измеряли перед приемом тестового напитка и после него со следующими временными интервалами: 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 и 180 минут. Испытывали также контрольный тестовый раствор, который содержал 75 мг полифенолов какао, растворенных в 10 унциях дистиллированной воды (без глюкозы).

Фигура 32 демонстрирует, что имело место значительное повышение уровня сахара в крови, измеренного вскоре после приема испытываемой смеси, содержащей полифенолы какао и сахар, однако очевидно, что в случае напитка из набора для определения толерантности к глюкозе, содержащего полифенолы и сахар, уровень глюкозы в крови через 180 минут ниже, чем в двух контрольных группах.

Но в работе, описанной в патенте US 6297273 В1, в экспериментах использовались лишь малые количества полифенолов (75 мг) и не упоминались опыты, проделанные после физической нагрузки или в состоянии стресса.

Установлено также, что полифенолы влияют на транспорт глюкозы через транспортные структуры GLUT 1 и GLUT 4 (Strobel et al., 2005). И в противоположность этому показано, что полифенолы (особенно эпигаллокатехин-галлат и эпикатехин-галлат) увеличивают активность инсулина in vitro в экспериментах с потенцированием действия инсулина в жировых клетках яичка с адипоцитами крысы (Anderson & Polansky, 2002). Мало что известно о влиянии полифенолов на гормональный, цитокинный и иммунный ответы на физическую нагрузку, и лишь немногочисленные работы посвящены возможному модулированию окислительного стресса, связанного с физической нагрузкой, при помощи пищевых продуктов, содержащих какао.

Адекватное потребностям организма наличие доступных для утилизации углеводов имеет большое значение для выполнения физической работы, причем важным источником энергии служит содержащаяся в плазме крови глюкоза. Если в организме недостаточны запасы углеводов, быстрее наступает усталость. Было установлено, что потребление богатого углеводами шоколадного батончика до выполнения физических упражнений повышает уровень глюкозы в крови, измеряемый за 15 минут до физической нагрузки, поддерживает значительно более высокий уровень глюкозы в крови в ходе выполнения физической работы и после нее, чем наблюдается при потреблении плацебо - не содержащего углеводов диетического напитка (Biomedical and Environmental Sciences 9, 247-255 (1996), Chen et al.). Авторы этой работы относили наблюдаемый эффект на счет того, что в шоколадном батончике содержится немало углеводов (56-граммовый шоколадный батончик содержит 36 г углеводов, давая 281 ккал); такое объяснение весьма правдоподобно. Однако, поскольку в контрольном опыте углеводы не потреблялись, только и возможно говорить о роли углеводов, не углубляясь в свойства какао или шоколада. Вероятно также, что использовавшиеся в этой работе шоколадные батончики содержали очень мало какао; авторы не делают предположений о влиянии какао. Наблюдавшийся ими эффект, скорее всего, обусловлен содержанием сахаров.

В работе Cesar G.Fraga et al. (Clinical & Developmental Immunology, March 2005; 12 (I): 11-17) раскрывается, что регулярное потребление (в течение 14 суток) шоколада, а именно ежедневно по плитке молочного шоколада весом 105 г, содержащей 168 мг флавонолов (из которых 39 мг составляли эпикатехин и катехин) может ослабить эффект окислительного стресса и улучшить состояние сердечно-сосудистой системы у молодых тренированных футболистов. Однако в молочном шоколаде, который использовался в этой работе, содержалось немного флавонолов (полифенолов) и уровни глюкозы в крови через 14 дней потребления шоколада оказались ниже базовых значений. Не исследовалось влияние полифенолов какао на регуляцию содержания глюкозы в крови после продолжительной физической нагрузки и скорость восстановления после нее.

В последнее время не было публикаций, посвященных влиянию значительного потребления темного шоколада на регуляцию содержания глюкозы в крови или на окислительный стресс после продолжительной (более 2 часов) физической нагрузки. Ни в одном из вышеупомянутых документов не утверждается и не предполагается, что потребление полифенолов может уменьшить связанные с физической нагрузкой усталость и повреждение мышц, улучшить выполнение физических упражнений и ускорить восстановление после нагрузки; ничего не говорится и о том, что указанное потребление может подавить снижение уровня глюкозы в крови после физической нагрузки вне зависимости от потребления углеводов и жиров.

Темный шоколад также содержит кофеин, который повышает работоспособность, стимулируя мобилизацию жирных кислот из жировых запасов (путем активации липолиза) и сберегая гликоген, в то же время стимулируя также центральную нервную систему и увеличивая возбудимость мышц.

Большинству клеток организма основным источником энергии служит глюкоза, и глюкоза, содержащаяся в крови, является важным источником энергии для физической работы и для мозга. Уровень глюкозы в крови строго контролируется и поддерживается в пределах 70-140 мг/дл (3,9-7,8 ммоль/литр) в основном с помощью таких гормонов, как инсулин и глюкагон. Сразу после приема пищи уровень глюкозы в крови возрастает и превышает немедленные энергетические потребности организма. Избыток глюкозы запасается в организме в виде гликогена в печени и мышцах или в виде жировых отложений. В ходе продолжительной физической нагрузки снижение содержания глюкозы в крови часто ассоциировано с утомлением; известно, что в процессе и после выполнения физической работы уровень глюкозы в крови снижается. Таким образом, считается, что адекватная доступность углеводов важна для выполнения физической работы и потребление экзогенных углеводов улучшает выполнение упражнений в процессе напряженной и продолжительной физической нагрузки.

Однако, хотя потребление углеводов перед физической нагрузкой для повышения уровня глюкозы в крови может в некоторой степени ослабить утомление и повреждение мышц, улучшить выполнение упражнений и способствовать восстановлению после нагрузки, оно не может предотвращать ущерб от окислительного стресса, например, в мышцах.

Раскрытие изобретения

Обнаружено, что потребление по меньшей мере 25 мг полифенолов до или в процессе продолжительной или напряженной физической нагрузки может ослабить обусловленное окислительным стрессом повреждение тканей в ходе или после физической работы. Оно может также подавить снижение уровня глюкозы в крови после физической нагрузки независимо от потребления жиров и углеводов, что указывает на стимуляцию глюконеогенеза (образования новых молекул глюкозы) или гликогенолиза в печени (расщепления запасенного гликогена с высвобождением глюкозы для ее утилизации), которая в свою очередь влияет на выполнение спортивных упражнений или восстановление после физической нагрузки.

Соответственно, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере 25 мг полифенолов для изготовления продукта, предназначенного для потребления до или в процессе физической нагрузки для уменьшения ущерба от окислительного стресса в процессе или после нее.

Уменьшение ущерба от окислительного стресса может быть выражено как в ходе выполнения физической работы, так и после нее.

Настоящее изобретение также относится к использованию по меньшей мере 25 мг полифенолов для приготовления продукта, предназначенного для потребления до или в процессе физической нагрузки с целью подавления снижения уровня глюкозы в крови после нагрузки.

Осуществление изобретения

Положительный эффект продукта по настоящему изобретению наиболее выражен, когда физическая работа продолжительная или напряженная. Определение «продолжительная» означает, что нагрузка длится более 30 минут, обычно более 1 часа, предпочтительно более 2 часов. Определение «напряженная» означает, что частота сердечных сокращений достигает 100-150 ударов в минуту или более в зависимости от тренированности и возраста испытуемого. Положительный эффект композиции по данному изобретению может быть выражен на раннем этапе выполнения физической работы, когда она более тяжелая.

Продукт по настоящему изобретению можно принимать внутрь, предпочтительно через рот, перед выполнением физического упражнения или во время подхода. Хотя продукт по настоящему изобретению можно потреблять за несколько часов до начала выполнения физической работы, больший эффект может быть достигнут путем потребления его как можно ближе к началу выполнения упражнения, например менее чем за 30 минут до нагрузки, предпочтительно менее чем за 1 час, более предпочтительно за 1,0-2,5 часа до выполнения физической работы. Кроме того, продукт по настоящему изобретению можно потреблять регулярно, например, ежедневно в течение периода до двух недель или долее, перед выполнением физической работы. По желанию суточную дозу можно принимать за один раз или же в несколько приемов.

Полифенолы по настоящему изобретению могут быть полифенолами, присутствующими в различных растительных источниках, как, например, чай и другие настои, ягоды и проч., но в данном исследовании использовались предпочтительно полифенолы, присутствующие в какао-бобах, например (не ограничиваясь этим перечнем) катехин, эпикатехин или олигомеры эпикатехина (например, димер В2, димер В5, тример С или тетрамер D). Можно использовать индивидуальные полифенолы или смеси двух или более полифенолов.

Например, когда используется отдельно эпикатехин, его количество в продукте по данному изобретению может быть по меньшей мере 25 мг, обычно от 30 до 200 мг, предпочтительно от 40 до 150 мг, более предпочтительно от 50 до 100 мг.

Когда используется смесь полифенолов, суммарное количество полифенолов в продукте по настоящему изобретению (измеряемое с применением реактива Фолина и выражаемое в эквивалентах эпикатехина) может составлять по меньшей мере 50 мг, например, от 100 мг до около 2500 мг, предпочтительно от 200 мг до 2000 мг, более предпочтительно от 500 мг до 1500 мг, еще более предпочтительно от 750 мг до 1250 мг.

Предназначенный для приема через рот продукт по настоящему изобретению, содержащий полифенолы, может быть в твердой либо жидкой форме - раствор, суспензия или порошок. Например, его можно потреблять как какао-массу, какао-порошок, молочный шоколад или же темный (горький) шоколад. Его также можно потреблять в составе таких пищевых продуктов, как зерновые хлопья, молочные продукты (например, йогурт), энергетические батончики, желе, или в виде таких напитков, как какао или горячий шоколад. Продукт по настоящему изобретению также можно потреблять как биологически активную добавку в форме капсул, таблеток, пилюль, леденцов или пастилок для рассасывания, драже либо порошка.

Например, количество темного шоколада, потребляемое перед подходом физического упражнения, составляет - в зависимости от содержания полифенолов какао - обычно от 20 до 150 граммов, предпочтительно от 50 до 125 граммов, более предпочтительно от 90 до 110 граммов, например 100-граммовую плитку. Количество какао-массы, потребляемое перед подходом физического упражнения, составляет обычно от 10 до 90 граммов, предпочтительно от 30 до 80 граммов, более предпочтительно от 55 до 70 граммов. Низшие в указанных пределах количества этих продуктов, например 20-50 граммов темного шоколада или 10-30 граммов какао-массы могут дать удовлетворительный положительный эффект, когда содержание полифенолов в шоколаде велико, например около 1000-1600 мг или более полифенолов (определяемых с применением реактива Фолина-Чокальтеу) в 100 граммах шоколада.

Предпочтительно в продукте по настоящему изобретению, содержащем полифенолы, могут присутствовать до 1 г кофеина и/или до 2 г теобромина, которые повышают работоспособность. Например, количество кофеина может составлять от 0,1 до 0,5 граммов и количество теобромина может составлять от 0,1 до 1 грамма. Кофеин и теобромин являются нормальными ингредиентами какао.

Настоящее изобретение также предоставляет способ подавления снижения уровня глюкозы в крови после физической нагрузки путем потребления продукта, содержащего по меньшей мере 25 мг одного или более полифенолов, до или в процессе подхода физического упражнения. Этот продукт обычно потребляется менее чем за 30 минут до подхода физического упражнения, предпочтительно менее чем за 1 час, более предпочтительно за 1,5-2,5 часа до подхода физического упражнения. Кроме того, продукт по настоящему изобретению можно потреблять регулярно, например, ежедневно в течение периода до двух недель или долее перед выполнением физической работы. По желанию суточную дозу можно принимать за один раз или же в несколько приемов.

Мы полагаем, что механизмом, посредством которого достигается более высокий уровень глюкозы в крови, является, возможно, глюконеогенез (образование новых молекул глюкозы для ее утилизации в организме) или гликогенолиз в печени (расщепления запасенного гликогена с высвобождением глюкозы для ее утилизации) или сокращение общего оборота глюкозы в организме.

Потребление продукта, содержащего по меньшей мере 25 мг одного или более полифенолов, до или в процессе подхода физического упражнения также может повысить содержание полифенолов в крови после физической нагрузки и подавить снижение уровня инсулина в крови после физической нагрузки.

Потребление продукта, содержащего по меньшей мере 25 мг одного или более полифенолов, до или в процессе подхода на выполнение физической работы также может обеспечить одно или и более следующих дополнительных благотворных эффектов в процессе или после выполнения физической работы:

усиление мобилизации жиров после физической нагрузки,

усиление бета-окисления жирных кислот после физической нагрузки,

усиление глюконеогенеза в процессе и после физической нагрузки,

усиление гликогенолиза в печени в процессе и после физической нагрузки,

сокращение общего оборота глюкозы в организме в процессе и после физической нагрузки,

уменьшение иммунодепрессии после физической нагрузки,

ослабление изменений в уровнях некоторых гормонов (например, инсулина) после физической нагрузки,

снижение концентрации свободных F2-изопростанов в плазме крови после физической нагрузки,

подавление снижения уровня инсулина в плазме крови (инсулинемии) после физической нагрузки,

снижение уровня окисленных LDL в состоянии покоя и в процессе физической нагрузки,

повышение уровня IL-10, обладающего противовоспалительным действием,

снижение утомления или ощущаемого напряжения,

сокращение времени восстановления при утомлении или напряжении и после физической нагрузки и/или

улучшение выполнения физической работы/спортивного упражнения.

Второе воплощение настоящего изобретения относится к людям, регулярно, например ежедневно, занимающимся физическими упражнениями. Благотворный эффект может развиться на протяжении какого-то промежутка времени путем потребления одного или более полифенолов ежедневно в дозе от 5 до 200 мг/сут. Благотворный эффект может стать ощутимым за несколько дней и продолжаться неопределенно долго, если потребление полифенолов не прекращается.

Соответственно, второе воплощение настоящего изобретения относится к использованию одного или более полифенолов в количестве от 5 мг до 200 мг для изготовления продукта, предназначенного для ежедневного потребления с целью уменьшить ущерб от окислительного стресса в процессе или после физической нагрузки.

Второе воплощение настоящего изобретения также относится к использованию одного или более полифенолов в количестве от 5 мг до 200 мг для изготовления продукта, предназначенного для ежедневного потребления с целью подавить понижение уровня глюкозы в крови у лиц, регулярно занимающихся физическими упражнениями.

Положительный эффект применения продукта по второму воплощению настоящему изобретения также наиболее явен, когда физическая нагрузка продолжительная и/или напряженная. «Продолжительная» означает, что физическая работа/спортивное упражнение совершается долее 30 минут, обычно долее 1 часа, предпочтительно долее 2 часов. «Напряженная» означает, что частота сердечных сокращений превышает 100-150 ударов в минуту или более (в зависимости от тренированности или возраста человека).

Второе воплощение настоящего изобретения также предоставляет способ уменьшения ущерба от окислительного стресса у лиц, регулярно совершающих физические упражнения/работу, путем ежедневного потребления продукта, содержащего от 5 мг до 200 мг одного или более полифенолов.

Количество потребляемых полифенолов при ежедневном приеме может составлять от 25 мг до 150 мг в сутки, предпочтительно от 50 мг до 100 мг в сутки.

Количество потребляемого эпикатехина при ежедневном приеме может составлять от 6 мг до 80 мг, предпочтительно от 10 мг до 50 мг.

По желанию суточное количество можно принимать за один раз или же в несколько приемов течение дня.

При ежедневном потреблении продукта, содержащего большее количество этого полифенола или смеси полифенолов, например 100-200 мг, следует исключить из рациона другие продукты с такой же калорийностью. Потребителю должны предоставляться диетологические рекомендации, чтобы заменять сходные продукты, имеющиеся в рационе.

Во втором воплощении настоящего изобретения предназначенный для приема через рот продукт по настоящему изобретению, содержащий полифенол или полифенолы, может быть в твердой либо жидкой форме - раствор, суспензия или порошок. Например, его можно потреблять как какао-массу, какао-порошок, молочный шоколад или же темный (горький) шоколад. Его также можно потреблять в составе таких пищевых продуктов, как зерновые хлопья, молочные продукты (например, йогурт), энергетические батончики, желе, или в виде таких напитков, как какао или горячий шоколад. Продукт по настоящему изобретению также можно потреблять как биологически активную добавку в форме капсул, таблеток, пилюль, леденцов или пастилок для рассасывания, драже либо порошка.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение иллюстрируют приведенные ниже примеры.

Пример 1

В качестве испытываемого шоколада (DC) использовали 100-граммовую плитку темного шоколада (70% тертых какао-бобов), содержащую какао-массу, сахар, масло какао, молочный жир, лецитин и ваниль (общее содержание жиров 44%). В качестве контроля (CON) использовали шоколад с по возможности таким же содержанием жиров и углеводов и такой же калорийностью. В 71 г контрольного шоколада (CON) содержались все те же ингредиенты, что и в испытываемом шоколаде (DC) за исключением какао-массы (0%), но содержалось 41 г масла какао для того, чтобы содержание жиров составляло 62%, так что 71 г контрольного шоколада содержали столько же жиров, сколько 100 г DC.

Четырнадцать здоровых мужчин в возрасте 21-23 года и массой тела 70-73 кг на протяжении 48 часов перед первым испытанием (привыкание) вели дневник потребления пищевых продуктов натощак и от них требовалось придерживаться такого же рациона на протяжении 48 часов перед каждым основным испытанием. Все испытуемые были некурящими, и от них требовалось воздерживаться от потребления алкоголя, кофеина и от интенсивной физической нагрузки в течение 48 часов перед каждым испытанием, а накануне каждого испытания они весь день отдыхали. Испытуемые также не должны были принимать минеральные или витаминные добавки или любые другие препараты антиоксидантного действия в течение 4 недель перед испытанием и во время самого испытания. Испытуемых обеспечивали перечнем пищевых продуктов с высоким содержанием полифенолов, которые следовало исключать из рациона в течение 48 часов перед каждым основным испытанием.

Испытуемые получали контролируемым рандомизированным образом либо 100 г испытываемого темного шоколада (DC), либо 71 г контрольного шоколада (CON) с таким же содержанием жиров и углеводов, либо ничего не получали (NONE).

Через 2 часа каждый испытуемый работал на велотренажере в течение 2,5 часов при 60% VO₂max. Между различными испытаниями ни по одной переменной, физиологически важной для выполнения физической работы, не наблюдалось разницы (см. Табл. 1).

Таблица 1
Данные физической нагрузки: усредненные за период продолжительности испытания (2,5 часа)
	DC	CON	NONE
Частота сердечных сокращений (ударов в минуту)	143(4)	142(4)	140(4)
Степень ощущаемого напряжения (RPE)	12(0)	12(0)	12(0)
Максимальное потребление кислорода (VO2max), %	57(1)	57(1)	57(1)
Коэффициент дыхательного обмена (RER)	0,94(0,02)	0,93(0,01)	0,93(0,02)
Значения средние (SEM). CON (испытание с контрольным шоколадом), DC (испытание с темным шоколадом), NONE (испытание без воздействия).

Забор крови у испытуемых осуществляли до приема шоколада, 2 часа спустя непосредственно перед выполнением физической работы, сразу после физической нагрузки продолжительностью 2,5 часа и через 1 час отдыха. В образцах крови определяли инсулин, полифенолы (эпикатехин), глюкозу и свободные F2-изопростаны в плазме.

Испытуемые подвергались физической нагрузке рандомизированным образом с контрбалансировкой в трех различных условиях:

a) испытание NONE (отсутствие воздействия),

b) испытание DС(темный шоколад) или

c) испытание CON (контрольный шоколад без какао-массы).

Испытуемые приходили в лабораторию в 8.30 утра в дни основных испытаний натощак (>10 часов без приема пищи). За 2 часа до начала физической работы испытуемые съедали шоколад (или - в испытании NONE - ничего не ели) и выпивали 200 мл воды. Кроме того, они еще принимали воду в начале выполнения физической работы/упражнения, каждые 15 минут в процессе ее выполнения и по завершении подхода упражнения из расчета 2,5 мл на 1 кг массы тела.

Образцы венозной крови брали по следующей схеме:

a) до потребления шоколада (состояние покоя),

b) непосредственно перед началом физической работы (до нагрузки)

c) непоредственно после завершения подхода упражнения (после нагрузки) и

d) через 1 час отдыха (1 ч после нагрузки).

В каждом случае брали 25 мл крови из вены в сгибе локтя с помощью иглы-бабочки (21 g) и шприца. Взятую кровь разливали в три пробирки Vacutainer (Becton Dickinson, Oxford, UK): две пробирки с К₃ЕDТА и одна пробирка с гепарином. Для определения VO₂ и RER (коэффициента дыхательного обмена) выдыхаемый воздух собирали в мешки Дугласа (образец брали в течение 1 минуты) на 15-й и 30-й минуте и затем каждые 30 минут в процессе физической нагрузки. Частоту сердечных сокращений и степень ощущаемого напряжения определяли каждые 15 минут в ходе физической нагрузки.

Порядок, в котором каждый испытуемый находился в каждом из трех условий (DC, CON и NONE), был рандомизирован с контрбалансировкой с применением основного плана латинских квадратов. Возможны 6 различных последовательностей, в которых можно провести испытания DC, CON и NONE. Испытуемых относили случайным образом к каждой из возможных последовательностей, так что на каждую из них приходилось по два человека. Поскольку испытуемых было 14, на две из шести последовательностей приходилось по одному дополнительному участнику.

Образцы крови в двух пробирках Vacutainer с K₃EDTA использовали для определения изменений концентраций в плазме крови глюкозы, инсулина, полифенолов, свободных F₂-изопростанов, триглицеридов и жирных кислот; пробирки с гепарином использовали для определения изменений концентраций в плазме крови витаминов С и Е.

Чтобы сравнить результаты испытаний трех различных типов - DC, CON и NONE, применяли дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями по двум факторам (испытание × время). Данные, не имевшие нормального распределения, нормализовали путем логарифмического преобразования и преобразования квадратного корня. В тех случаях, когда это было возможно, проводили апостериорный анализ (Post Hoc), применяя двухвыборочный t-критерий с коррекцией вероятной ошибки по методу Холма-Бонферрони. Когда дисперсионный анализ ANOVA по двум переменным демонстрировал значимое взаимодействие испытание × время (что свидетельствовало о различных временных ответах в зависимости от испытания), применяли также дисперсионный анализ ANOVA с повторными измерениями по одной переменной, чтобы определить временной ответ в каждом испытании независимо). Ко всем значениям Р, полученным с помощью ANOVA, применяли поправку Гринхауза-Гейссера.

А. КОНЦЕНТРАЦИЯ ПОЛИФЕНОЛОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ

В аликвотах плазмы крови с K₃EDTA определяли концентрацию полифенолов (эпикатехина и катехина) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Плазму крови быстро оттаивали, центрифугировали при 4°С и 14000 об/мин в течение 5 минут и 200 мкл смешивали с 12 мкл раствора, содержащего 10% аскорбиновой кислоты - 40 мМ КН₂РO₄ - 0,1% EDTA, с 20 мкл раствора фосфата калия (50 мМ, рН 7,4), с 20 мкл раствора катехин-галлата (1,0 мкг/мл) в качестве внутреннего стандарта, с 500 Е β-d-глюкуронидазы типа Х-А из Е. coli (Sigma Chemical Co, St Louise, МО, USA) и 4 Е сульфатазы типа VIII из внутренностей морского уха (Sigma). Смесь инкубировали при 37°С в течение 45 минут. Реакцию останавливали, добавляя 2 мл этилацетата, после чего энергично перемешивали путем встряхивания в течение 20 минут и центрифугировали при 4°С и 2000 g в течение 5 минут. Супернатант переносили в чистую пробирку и повторяли экстракцию этилацетатом. К объединенной фракции супернатанта прибавляли 10 мкл 0,02%-ного раствора аскорбиновой кислоты с 0,005% EDTA и перемешивали круговыми движениями. Затем супернатант выпаривали досуха в токе азота в течение 2 часов при комнатной температуре. Образцы разводили в 200 мкл смеси метанол:вода (1:2 объем/объем), хорошо перемешивали круговыми движениями, подвергали воздействию ультразвука в течение 10 минут и центрифугировали при 4°С и 14000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант в количестве 20 мкл наносили в систему HPLC, состоявшую из системы подачи раствора ESA Model 582, устройства автоматического ввода проб (автосэмплера) ESA Model 542, электрохимического детектора ESA 5600 CoulArray (ESA, Bedford, MA, USA), снабженную программным обеспечением CoulArrayWin Software 1.12, нагревателем колонки Eppendorf СН-30, защитной колонки Cig Phonomenex (4,0 мм L × 3,0 мм) и колонки SUPELCO Ascentis RP-Amide column (15 см × 4,6 мм внутренний диаметр, размер частиц 5 мкм). Стандартные растворы флаванола и внутреннего стандарта (катехин-галлата) готовили на смеси метанола и воды (1:2 объем/объем) и хранили при -70°С. Колонку элюировали при 35°С начиная со скорости потока 1 мл/мин 70% буферного раствора А (40 мМ одноосновный фосфат аммония, рН доводили до 3,0 фосфорной кислотой) и 30% буферного раствора В (40 мМ одноосновный фосфат аммония 50%/л: 50% ацетонитрил/л, рН доводили до 3,0 фосфорной кислотой). Через 1 мин градиент изменяли линейно от 70% буферного раствора А и 30% буферного раствора В до 10% буферного раствора А и 90% буферного раствора В (1-10 мин), 70% А/30% В (10-12 мин). Сходящую с колонки жидкость анализировали путем электрохимической детекции при потенциале -30, 100, 230 и 400 мВ. Преобладал канал детекции 230 мВ.

Изменения концентрации эпикатехина в плазме крови показаны на Фигуре 1. Апостериорный (Post Hoc) анализ продемонстрировал, что концентрация эпикатехина в плазме крови до физической нагрузки (т.е. 2 часа спустя после приема шоколада) была значительно выше в испытании DC по сравнению с испытанием CON. За два часа после приема темного шоколада концентрация эпикатехина в плазме крови возрастала в 11 раз. В конце выполнения физической работы концентрация эпикатехина в плазме крови была в 6 раз выше, чем в состоянии покоя, а через 1 час после физической нагрузки она была примерно в 4 раза выше, чем в состоянии покоя. В испытаниях CON и NONE концентрация эпикатехина в плазме крови оставалась неизменной по сравнению с состоянием покоя на протяжении всего испытания. На концентрацию катехина в плазме крови потребление DC или CON не влияло.

В. КОНЦЕНТРАЦИИ ВИТАМИНОВ С И Е В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Концентрацию витамина С в плазме крови определяли в плазме, полученной из гепаринизированной крови по Liu et al. (1982), используя специфический спектрофотометрический метод с аскорбат-оксидазой (Е 1.10.3.3). В плазме, полученной из гепаринизированной крови, определяли антиоксидантную активность в эквивалентах тролокса (ТЕАС) при помощи автоматического анализатора (Cobas-Mira Plus, Roche, Basle, Switzerland), используя имеющийся в продаже готовый набор (Randox, County Antrim, UK) для измерения способности плазмы нейтрализовать катион-радикал ABTS - 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). В качестве стандарта использовали тролокс, так что общий антиоксидантный статус (TAS) выражали в единицах антиоксидантной активности в эквивалентах тролокса (мкмоль). Антиоксидантную емкость плазмы в эквивалентах витамина Е определяли в плазме, полученной из гепаринизированной крови с помощью хемолюминесцентного метода измерения способности плазмы нейтрализовать пероксинитрит (ABEL, Knight Scientific, Plymouth, UK).

В отношении концентрации витамина С наблюдался значимый эффект времени. Апостериорный (Post hoc) анализ показал, что сразу после физической нагрузки и через 1 час после нее концентрация витамина С была выше, чем перед физической нагрузкой. В отношении концентрации в плазме витамина Е в токофероловых эквивалентах наблюдался значимый эффект взаимодействия основное испытание × время и главный эффект времени (Таблица 2). Во всех трех испытаниях концентрация витамина Е в токофероловых эквивалентах была значительно выше сразу после физической нагрузки и через 1 час после нее, чем в состоянии покоя и перед физической нагрузкой. Однако концентрация витамина Е в токофероловых эквивалентах была значительно выше через 1 час после физической нагрузки в испытаниях DC и CON по сравнению с испытанием NONE.

С. КОНЦЕНТРАЦИЯ СВОБОДНЫХ F₂-ИЗОПРОСТАНОВ

Для определения концентрации свободных F₂-изопростанов образцы плазмы крови с K₃EDTA до анализирования хранили при -80°С в присутствии 0,005% 3,5-ди-трет-4-бутилгидрокситолуола. Концентрацию свободных F₂-изопростанов в плазме крови определяли с помощью набора для ELISA (Cayman Chemical Co., MI, USA) по инструкции производителя.

Как показывает Таблица 2, концентрация свободных F₂-изопростанов в плазме крови была значительно выше перед физической нагрузкой в испытаниях DC по сравнению с испытаниями NONE, но через 1 час после физической нагрузки она была значительно ниже в испытаниях DC по сравнению с испытаниями NONE. Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA для каждого испытания в отдельности показал, что в случае испытаний CON концентрация свободных F₂-изопростанов в плазме крови по сравнению с уровнем перед физической нагрузкой была значительно выше сразу после физической нагрузки, но не через 1 час спустя, а в случае испытаний NONE сразу после физической нагрузки и через 1 час после нее она была значительно выше, чем перед физической нагрузкой. Снижение уровня F₂-изопростанов считается положительным явлением при окислительном стрессе.

Таблица 2
Концентрации в плазме крови витаминов С и Е и свободных F2-изопростанов
	В покое	До нагрузки	Сразу после нагрузки	Через 1 час после нагрузки	Значения Р для основных эффектов (испытание; время; испытание × время)
Витамин С (мкМ)
DC	57 (4)	55 (4)	69 (4)	60 (4)	0,158; <0,001; 0,453
CON	56 (4)	53 (5)	68 (4)	58 (5)
NONE	57 (4)	56 (3)	74 (6)	65 (5)
Витамин Е (мкМ)
DC	588 (16)	609