Очистка пегилированных полипептидов

Очистка пегилированных полипептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области способов хроматографического выделения, применимых для очистки полипептидов, в особенности пегилированного эритропоэтина.

Предпосылки к созданию изобретения

Белки играют важную роль в современном медицинском арсенале. Для применения на людях всякий терапевтический белок должен соответствовать определенным критериям. Дабы обеспечить безопасность биофармацевтических средств для людей, необходимо особо озаботиться удалением побочных продуктов, накапливающихся в ходе процесса изготовления. Для удовлетворения нормативным требованиям вслед за процессом изготовления должны следовать одна или несколько стадий очистки. Среди прочих параметров важную роль при выборе подходящего способа очистки играют чистота, производительность и выход.

Общепризнанны и широко применимы различные способы очистки белков, такие как аффинная хроматография с микробными белками (например, аффинная хроматография с А-белком или G-белком), ионообменная хроматография (например, катионообменная (сульфопропильные или карбоксиметильные смолы), анионообменная (аминоэтильные смолы) и в смешанном режиме), тиофильная адсорбционная хроматография (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH-лигандами), гидрофобная хроматография или адсорбционная хроматография с ароматическими группами (например, с фенилсефарозой, аза-аренофильными смолами или м-аминофенилбороновой кислотой), металлхелатная аффинная хроматография (например, с носителем со сродством к Ni(II)- и Cu(II)), эксклюзионная хроматография и электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). Сообщалось о конъюгации для, например, полиэтиленгликоля (ПЭГ) и интерлейкина-6 (Европейский патент ЕР 0442724), ПЭГ и эритропоэтина (международная заявка на изобретение WO 01/02017), содержащих эндостатин химерных молекул и иммуноглобулинов (заявка на патент США US 2005/008649), гибридных белков на основе секретируемых антител (заявка на патент США US 2002/147311), содержащих альбумин гибридных полипептидов (заявка на патент США US 2005/0100991; человеческого сывороточного альбумина - патент США US 5876969), пегилированных полипептидов (заявка на патент США US 2005/0114037) и гибридных интерферонов.

Necina, R. и др. (Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698) сообщали о захвате человеческих моноклональных антител прямо из надосадочных жидкостей клеточных культур с помощью ионообменных сред, характеризуемых высокой плотностью заряда. В международной заявке на изобретение WO 89/05157 сообщается о способе очистки получаемых иммуноглобулинов посредством непосредственной катионообменной обработки клеточной культуральной среды. Одностадийная очистка моноклональных антител IgG (иммуноглобулин G) из перитонеального выпота мышей описана в Danielsson, А., и др., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88. Способ очистки полипептида с помощью ионообменной хроматографии описан в международной заявке на изобретение WO 2004/024866, в которой для отделения искомого полипептида от одного или нескольких загрязнителей применяют градиентное элюирование. В Европейском патенте ЕР 0530447 описан способ очистки моноклональных антител IgG с помощью комбинации трех хроматографических стадий. Удобный способ очистки монопегилированного антагониста рецептора интерлейкина-1 описан в Yu, G., и др., в Process Biotechnol. 42 (2007) 971-977. Wang и др. (Wang, H., и др., Peptides 26 (2005) 1213-1218) сообщают об очистке белка hTFF3, экспрессируемого кишечной палочкой E.coli, с помощью двухстадийной катионообменной хроматографии. Yun и др. (Yun, Q., и др., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74) сообщают об очистке пегилированного рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека rhG-CSF с помощью двух последовательных ионообменных хроматографических стадий. В международных заявках на изобретение WO 2007/039436 и WO 01/087329 описаны эритропоэтин, связанный ковалентно с полиэтиленгликолевой группой(группами), и жидкая фармацевтическая композиция, содержащая эритропоэтиновый белок.

Краткое описание изобретения

Объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, включающий стадии получения раствора, содержащего моно-, поли- и непегилированный эритропоэтин, осуществления двух последовательных катионообменных хроматографических стадий и выделения очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии, причем для обеих катионообменных хроматографических стадий применяется один и тот же тип катионита.

В одном из вариантов осуществления данного способа две последовательные катионообменные хроматографические стадии осуществляют с применением различных способов элюирования. В другом варианте осуществления настоящего способа две последовательные катионообменные хроматографические стадии включают следующие шаги;

а) введение забуференного водного раствора, содержащего смесь моно-, поли- и непегилированного эритропоэтина, в первую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, пригодных для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с содержащимся в таковой колонке катионитом,

б) выделение монопегилированного эритропоэтина из первой катионообменной хроматографической колонки с помощью метода ступенчатого элюирования со ступенчатым увеличением ионной силы элюирующего буферного раствора, в результате чего содержание упомянутого монопегилированного эритропоэтина увеличивается по сравнению со смесью, задействованной на шаге а),

в) введение выделенного монопегилированного эритропоэтина во вторую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, пригодных для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с содержащимся в таковой второй колонке катионитом, где содержащийся в упомянутой второй колонке катионит относится к тому же типу, что и катионит в первой колонке,

г) выделение очищенного монопегилированного эритропоэтина из упомянутой второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, с помощью метода непрерывного элюирования с непрерывным увеличением ионной силы элюирующего буферного раствора.

В одном из вариантов данного способа катионит является сильным катионитом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сильный катионит является сульфопропильным катионитом. Особенно предпочтительным является Тойоперл® SP 650 М. В другом варианте осуществления монопегилированный эритропоэтин выделяют на шаге г) в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, с чистотой более 95% по площади хроматографического пика. Еще в одном варианте осуществления данного способа ступенчатое увеличение ионной силы на шаге б) способа является увеличением ионной силы в две ступени. Предпочтительно монопегилированный эритропоэтин выделяют на второй стадии способа ступенчатого элюирования, т.е. после второго повышения ионной силы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения его объектом является способ получения монопегилированного эритропоэтина, включающий следующие стадии:

а) пегилирование эритропоэтина с помощью пегилирующего агента,

б) очистку пегилированного эритропоэтина с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматографических стадиях задействован один и тот же тип катионита,

в) выделение монопегилированного эритропоэтина из второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной.

Подробное описание изобретения

Объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, включающий две катионообменные хроматографические стадии, где на обеих катионообменных хроматографических стадиях используется катионит одинакового типа.

Термин «ионообменное вещество» (ионит), как он употребляется в настоящей заявке, означает неподвижную матрицу высокой молекулярной массы, несущую ковалентно связанные заряженные заместители, применяемую в качестве неподвижной фазы в ионообменной хроматографии. Для общей электронейтральности с ней нековалентно связаны противоионы. «Ионообменное вещество» характеризуется способностью обменивать свои нековалентно связанные противоионы на сходным образом заряженные ионы из окружающего раствора. В зависимости от заряда своих обмениваемых противоионов «ионообменная смола» относится к катионообменной смоле или к анионообменной смоле. В зависимости от природы заряженной группы (заместителя) «ионообменная смола» относится, в случае, например, катионообменных смол, к сульфокислотной смоле (S), или сульфопропильной смоле (SP), или карбоксиметильной смоле (СМ). В зависимости от химической природы заряженной группы/заместителя «ионообменная смола» может быть дополнительно классифицирована как сильная или слабая ионообменная смола, что зависит от силы ковалентно связанного заряженного заместителя. Например, сильные катионообменные смолы содержат сульфокислотную группу, предпочтительно сульфопропильную группу, в качестве заряженного заместителя, а слабые катионообменные смолы содержат карбоксильную группу, предпочтительно карбоксиметильную группу, в качестве заряженного заместителя, слабые же анионообменные смолы содержат диэтиламиноэтильную группу в качестве заряженного заместителя.

Различные типы ионообменных материалов, т.е. неподвижных фаз, доступны под разными именами от многих компаний, включая, например, катиониты Bio-Rex® (например, тип 70), Chelex® (например, тип 100), Macro-Prep® (например, тип CM, High S, 25 S), AG® (например, тип 50W, МР), предоставляемые компанией BioRad Laboratories, WCX 2 от компании Ciphergen, Dowex® MAC-3 от компании Dow Chemical Company, Mustang С и Mustang S от компании Pall Corporation, целлюлоза CM (например, тип 23, 52), hyper-D, partisphere от компании Whatman plc., Амберлит® IRC (например, тип 76, 747, 748), Амберлит® GT 73, Тойоперл® (например, тип SP, CM, 650M), предоставляемые компанией Tosoh Bioscience GmbH, CM 1500 и CM 3000 от компании BioChrom Labs, SP-сефароза^ТМ, СМ-сефароза^ТМ от компании GE Healthcare, смолы Poros от компании PerSeptive Biosystems, Asahipak ES (например, тип 502С), CXpak P, IEC CM (например, тип 825, 2825, 5025, LG), IEC SP (например, тип 420N, 825), IEC QA (например, тип LG, 825), предоставляемые компанией Shoko America Inc., катионообменная смола 50W от компании Eichrom Technologies Inc. Предпочтительно катионит является сильным катионитом, таким как Macro-Prep® High S или 25S, или MacroCap SP, или Тойоперл® SP 650M, или Source S, или SP сефароза, или POLYCAT А. Примерами анионитов являются Dowex® 1 от компании Dow Chemical Company, AG® (например, тип 1, 2, 4), Bio-Rex® 5, ДЭАЭ (диметиламиноэтил) Bio-Gel 1, Macro-Prep® ДЭАЭ, предоставляемые кампанией BioRad Laboratories, анионообменная смола типа 1 от компании Eichrom Technologies Inc., Source Q, ANX сефароза 4, ДЭАЭ-сефароза (например, тип CL-6B, FF), Q сефароза, Capto Q, Capto S, предоставляемые компанией GE Healthcare, AX-300 от компании PerkinElmer, Asahipak ES-502C, AXpak WA (например, тип 624, G), IEC ДЭАЭ, предоставляемые кампанией Shoko America Inc., Амберлит® IRA-96, Тойоперл® ДЭАЭ, TSKgel ДЭАЭ, предоставляемые кампанией Tosoh Bioscience GmbH, Mustang Q от компании Pall Corporation. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения катионит является сульфопропильным катионитом.

Выражение «одинаковый тип катионита» относится к двум последовательным ионообменным хроматографическим стадиям, осуществляемым с использованием идентичного катионита. Это означает, что последовательные катионообменные хроматографические стадии осуществляют либо с использованием первой порции катионита для первой катионообменной хроматографической стадии и второй порции того же самого катионита для второй катионообменной хроматографической стадии, либо с использованием одного и того же катионита для обеих катионообменных хроматографических стадий. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй катионит является тем же типом катионита, что и первый катионит, но не той же самой его порцией.

Термины «ступенчатое элюирование» и «метод ступенчатого элюирования», употребляемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, обозначают способ, в котором, например, концентрацию вещества, вызывающего элюирование, т.е. растворение связанного соединения из вещества-носителя, скачкообразно повышают или понижают, т.е. непосредственно от одного значения/уровня до другого значения/уровня. При данном «ступенчатом элюировании» одно или несколько условий, например рН, ионную силу, концентрацию соли и/или скорость элюирования, скачкообразно изменяют от первой, например исходной, величины до второй, например конечной, величины, т.е. условия изменяют дискретно, т.е. ступенчато, в отличие от линейных изменений. В «методе ступенчатого элюирования» собирают новую фракцию после каждого повышения ионной силы. Эта фракция содержит соединения, выделенные из ионообменного вещества при соответствующем повышении ионной силы. После каждого повышения условия поддерживают до следующей стадии данного метода элюирования. При «ступенчатом элюировании» одно или несколько условий совместно скачкообразно изменяют от первой, например исходной, величины до второй, например конечной, величины. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина изменения составляет 10 или более процентов концентрации вызывающего элюирование вещества. Это означает, что в данном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация вызывающего элюирование вещества составляет 100% на первой ступени, 110% или более на второй ступени и 120% или более на третьей ступени. В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина изменения составляет 50 или более процентов концентрации вызывающего элюирование вещества. Еще в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина изменения составляет 120 или более процентов концентрации вызывающего элюирование вещества. Термин «ступенчатое элюирование» означает, что условия изменяют дискретно, т.е. ступенчато, в отличие от линейного изменения.

Термины «непрерывное элюирование» и «метод непрерывного элюирования», употребляемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, означают способ, в котором, например, концентрацию вещества, вызывающего элюирование, т.е. растворение связанного/адсорбированного соединения из хроматографического носителя, повышают или понижают непрерывно, т.е. концентрацию изменяют последовательными малыми шагами, на каждом из которых происходит не более чем двухпроцентное, предпочтительно однопроцентное, изменение концентрации вызывающего элюирование вещества. При данном «непрерывном элюировании» одно или несколько условий, например рН, ионная сила, концентрация соли и/или скорость элюирования, могут быть изменены линейно, или экспоненциально, или асимптотически. Предпочтительно изменение осуществляется линейно.

Термин «введение» и его грамматические эквиваленты, как он употребляется в настоящей заявке, означает подстадию способа очистки, на которой содержащий искомое вещество раствор вводят в контакт с неподвижной фазой. Это означает, что а) раствор вводят в хроматографическое устройство, в котором находится неподвижная фаза, или б) неподвижную фазу добавляют к раствору. В случае а) раствор, содержащий подвергаемое очистке искомое вещество, проходит через неподвижную фазу, обеспечивая взаимодействие между неподвижной фазой и веществами в растворе. В зависимости от условий, таких как, например, рН, проводимость, концентрация соли, температура и/или скорость элюирования, некоторые вещества из раствора связываются с неподвижной фазой и таким образом удаляются из раствора. Другие вещества остаются в растворе. Остающиеся в растворе вещества могут быть обнаружены в проточной фракции. Термин «проточная фракция» означает раствор, получаемый после прохождения хроматографического устройства, который может быть как введенным раствором, содержащим искомое вещество, так и буферным раствором, используемым для промывания колонки или элюирования одного или нескольких связанных с неподвижной фазой веществ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хроматографическое устройство является колонкой или кассетой. Искомое вещество может быть выделено из раствора после стадии очистки с помощью известных специалисту в соответствующей области способов, таких как, например, осаждение, высаливание, ультрафильтрация, диафильтрация, лиофилизация, аффинная хроматография или снижение объема растворителя, с целью получения искомого вещества в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. В случае б) к раствору, содержащему подвергаемое очистке искомое вещество, добавляют неподвижную фазу, например твердое вещество, обеспечивая взаимодействие между неподвижной фазой и веществами в растворе. После взаимодействия неподвижную фазу удаляют, например, посредством фильтрования, а искомое вещество либо оказывается связано с неподвижной фазой и удалено вместе с ней из раствора, либо не связывается с неподвижной фазой и остается в растворе.

Выражение «в пригодных для связывания условиях» и его грамматические эквиваленты, как оно употребляется в настоящей заявке, означает, что искомое вещество, например пегилированный эритропоэтин, связывается с неподвижной фазой при введении во взаимодействие с ней, например с ионообменным веществом. Это не обязательно означает, что связываются все 100% искомого вещества, но 100% искомого вещества связываются в существенном количестве, т.е. с неподвижной фазой связывается хотя бы 50% искомого вещества, связывается хотя бы 75% искомого вещества, связывается хотя бы 85% искомого вещества или связывается более 95% искомого вещества.

Термин «забуференный», как он употребляется в настоящей заявке, означает раствор, в котором изменения рН вследствие добавления или высвобождения кислотных или основных веществ выравниваются с помощью буферного вещества. Может быть задействовано любое буферное вещество, приводящее к такому эффекту. Предпочтительно используют фармацевтически приемлемые буферные вещества, такие как, например, фосфорная кислота или ее соли, уксусная кислота или ее соли, лимонная кислота или ее соли морфолин, 2-(N-морфолино)этансульфокислота или ее соли, гистидин или его соли, глицин или его соли или трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) или его соли. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве буферного вещества используют фосфорную кислоту или ее соли, или уксусную кислоту или ее соли, или лимонную кислоту или ее соли, или гистидин или его соли. Буферный раствор может необязательно содержать дополнительную соль, такую как хлорид натрия, сульфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, цитрат натрия или цитрат калия.

Общие методы хроматографии и их применение известны специалисту в соответствующей области. См., например, Chromatography (Хроматография), 5-е издание, часть A: Fundamentals and Techniques (Основы и методы), под ред. Heftmann, E., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences (Продвинутые хроматографические и электромиграционные методы в биологических науках), под ред. Deyl, Z., Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today (Хроматография сегодня), Poole, С.F., и Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Очистка белков: принципы и практика) (1982); под ред. Sambrook, J., и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство), 2-е издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; или Current Protocols in Molecular Biology (Современные методики в молекулярной биологии), под ред. Ausubel, F.М., и др., John Wiley & Sons, Inc., New York.

Пегилирование эритропоэтина приводит, как правило, к смеси различных соединений, таких как полипегилированный эритропоэтин, монопегилированный эритропоэтин, непегилированный эритропоэтин, продукты гидролиза активированного сложного эфира эритропоэтина, например пегилированная кислота в свободном виде, равно как и продукты гидролиза самого эритропоэтина. С целью получения монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся существенно гомогенной, эти соединения должны быть разделены, а искомое соединение должно быть очищено.

В связи с этим, объектом настоящего изобретения является способ получения монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, включающий следующие стадии:

а) пегилирование эритропоэтина с помощью активированного пегилирующего реагента с молекулярной массой от 20 кДа до 40 кДа,

б) очистку получаемого на стадии а) пегилированного эритропоэтина с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматографических стадиях задействован катионит одного и того же типа,

в) выделение монопегилированного эритропоэтина из второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной.

Этот способ особенно полезен для очистки пегилированных рекомбинантных полипептидов, являющихся гликозилированными, т.е. выработанных в клетках млекопитающих, предпочтительно в клетке яичников китайского хомячка (СНО), человеческой эмбриональной клетке почек (HEK293), клетке почек детеныша хомячка (BHK), клетке линии Per.С6® или раковой клетке HeLa, и впоследствии пегилированных химически.

На первой стадии способа эритропоэтин пегилируют. Полимерные молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ), применяемые в реакции пегилирования, характеризуются молекулярной массой приблизительно от 20 кДа до 40 кДа (под термином «молекулярная масса», как он здесь употребляется, следует понимать среднюю молекулярную массу ПЭГ, поскольку ПЭГ, являющийся полимерным соединением, нельзя получить с определенной молекулярной массой, на самом же деле он характеризуется молекулярно-массовым распределением. Термин «приблизительно» указывает на то, что в подобных образцах ПЭГ некоторые молекулы будут иметь большую, а некоторые меньшую массу по сравнению с указанной молекулярной массой, т.е. термин «приблизительно» относится к молекулярно-массовому распределению, в котором 95% молекул ПЭГ характеризуются молекулярной массой в пределах +/- 10% от указанной молекулярной массы. Например, молекулярная масса 30 кДа означает диапазон от 27 кДа до 33 кДа).

Термин «эритропоэтин» относится к белку, характеризуемому последовательностью за номером 1 или за номером 2 из приведенного ниже описания последовательностей, или к в существенной степени ему гомологичному белку или полипептиду, биологические свойства которого относятся к стимуляции выработки красных кровяных клеток и к стимуляции деления и дифференцировки коммитированных эритроидных клеток-предшественников в костном мозге. Рекомбинантный эритропоэтин может быть получен посредством экспрессии в эукариотических клетках, например в клетках СНО, или клетках ВНK, или клетках HeLa, с помощью технологии, основанной на рекомбинантной ДНК, или посредством эндогенной активации гена. Например, эритропоэтиновый гликопротеид экспрессируется посредством эндогенной активации гена, как это сообщается в Патентах США US 5733761, US 5641670, US 5733746 и международных заявках на изобретение WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эритропоэтин согласно настоящему изобретению основан на последовательности человеческого эритропоэтина (ЭПО). В другом варианте осуществления настоящего изобретения человеческий эритропоэтин характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной в приведенном ниже описании под номером 1 или под номером 2, предпочтительно человеческий эритропоэтин характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной в приведенном ниже описании под номером 1. Термин «эритропоэтин» также относится к таким вариантам белка согласно последовательностям под номером 1 или под номером 2, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены, удалены или вставлены и которые обладают той же биологической активностью, что и немодифицированный белок, как это, например, описано в Европейском патенте ЕР 1064951 или в патенте США US 6583272. Вариант может характеризоваться аминокислотной последовательностью человеческого эритропоэтина, содержащей от одного до шести дополнительных сайтов для гликозилирования. Специфическая активность пегилированного эритропоэтина может быть определена с помощью различных анализов, известных в соответствующей области. Биологическая активность очищенного пегилированного эритропоэтина по настоящему изобретению такова, что введение белка посредством инъекции пациентам-людям приводит к увеличению выработки клетками костного мозга ретикулоцитов и красных кровяных клеток по сравнению с не подвергнутыми инъекции или контрольными группами пациентов. Биологическая активность пегилированного эритропоэтина, полученного и очищенного в соответствии с настоящим изобретением, может быть исследована с помощью способов согласно Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2).

Термин «ПЭГ» или «ПЭГ-группа» согласно настоящему изобретению означает остаток, содержащий полиэтиленгликоль в качестве своей основной части. Подобный ПЭГ может содержать другие химические группы, необходимые для реакций связывания, т.е. конъюгации, образующиеся в результате химического синтеза молекулы или являющиеся спейсером для оптимального расстояния между частями молекулы. Эти дополнительные химические группы не учитываются при расчете молекулярной массы полимерной молекулы ПЭГ. Кроме того, подобный ПЭГ может включать одну или несколько боковых цепей ПЭГ, связанных друг с другом. Варианты ПЭГ с более чем одной цепью ПЭГ называются многолучевыми или разветвленными ПЭГ. Разветвленные ПЭГ могут быть получены, например, посредством добавления полиэтиленоксида к различным полиолам, включая глицерин, пентаэритрит и сорбит. Разветвленные ПЭГ описаны, например, в Европейском патенте ЕР 0473084 и Патенте США US 5932462. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве ПЭГ с молекулярной массой 20-35 кДа используют линейные молекулы ПЭГ, а в качестве полимеров ПЭГ с молекулярной массой свыше 35 кДа, в особенности 40 кДа, используют разветвленные варианты ПЭГ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве ПЭГ с массой 40 кДа используют ПЭГ с двумя цепями.

Термин «пегилирование» означает ковалентное связывание полиэтиленгликолевого остатка по N-концу полипептида и/или внутреннему лизиновому остатку. Пегилирование белков широко известно в соответствующей области, обзор ему дан, например, в Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. ПЭГ может быть присоединен с помощью различных функциональных групп и полиэтиленгликолей различной молекулярной массы, линейных и разветвленных вариантов ПЭГ, равно как и различных соединительных групп (см. также Francis, G.E., и др., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, С., и др., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304). Пегилирование эритропоэтина может быть осуществлено в одном растворе с помощью пегилирующих реагентов, как это описано, например, в международной заявке на изобретение WO 00/44785, в одном из вариантов осуществления - с использованием активированных N-гидроксисукцинимидом (НГС) линейных или разветвленных молекул ПЭГ с молекулярной массой между 5 кДа и 40 кДа. Пегилирование также может быть осуществлено в твердой фазе согласно Lu, Y., и др., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229. Нередко пегилированные по N-концу белки могут быть также получены согласно международной заявке на изобретение WO 94/01451.

Подобные способы приводят к эритропоэтину, пегилированному по одной или нескольким ε-аминогруппам лизиновых остатков и/или по N-концевой аминогруппе. Селективное пегилирование по N-концевой аминокислоте может быть осуществлено согласно Felix, A.M., и др., ACS Symp. Ser. 680 (полиэтиленгликоль) (1997) 218-238. Селективное пегилирование по N-концу может быть достигнуто в ходе твердофазного синтеза посредством сочетания N^α-пегилированного аминокислотного производного c N-1 концевой аминокислотой пептидной цепи. Пегилирование в виде боковой цепи может быть осуществлено в ходе твердофазного синтеза посредством сочетания N^ε-пегилированных производных лизина с растущей цепью. Комбинированное пегилирование по N-концу и с образованием боковой цепи осуществимо или как это описано выше в ходе твердофазного синтеза, или посредством синтеза в растворе, подвергая пептид со снятой защитой аминогруппы действию активированных пегилирующих реагентов.

Подходящими производными ПЭГ являются активированные молекулы ПЭГ со средней молекулярной массой от приблизительно 5 до приблизительно 40 кДа, а в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа, предпочтительно от приблизительно 30 кДа до приблизительно 35 кДа. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пегилированное производное является линейным или разветвленным ПЭГ. Большое разнообразие производных ПЭГ, подходящих для применения в получении ПЭГ-белковых и ПЭГ-пептидных конъюгатов, может быть получено от компании (Huntsville, AL, U.S.A.; www.nektar.com).

Активированные производные ПЭГ известны в соответствующей области и описаны, например, в Morpurgo, М., и др., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368, для случая ПЭГ-винилсульфона. Линейные и разветвленные виды ПЭГ пригодны для получения пегилированных фрагментов. Примерами реакционноспособных реагентов ПЭГ являются иодацетилметокси-ПЭГ или метокси-ПЭГ-винилсульфон (m предпочтительно является целым числом от приблизительно 450 до приблизительно 900, a R является (С₁-С₆)алкилом, линейным или разветвленным и содержащим от одного до шести атомов углерода, таким как метил, этил, изопропил и т.п. В соответствии с этим, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R является метилом):

или

Применение этих активированных иодом веществ известно в соответствующей области и описано, например, Hermanson, G. Т., в Bioconjugate Techniques (Методики биоконъюгатов), Academic Press, San Diego (1996), стр.147-148.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЭГ является активированным сложным эфиром ПЭГ, например N-гидроксисукцинимидилпропионатом, или N-гидроксисукцинимидилбутаноатом, или N-гидроксисукцинимидинами, такими как ПЭГ-НГС (Monfardini, С., и др., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сложный эфир N-гидроксисукцинимида является

или

с использованием алкокси-ПЭГ-N-гидроксисукцинимида, такого как метокси-ПЭГ-N-гидроксисукцинимид (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.), где R и m отвечают вышеприведенному определению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЭГ является сложным N-гидроксисукцинимидиловым эфиром метоксиполиэтиленгликольмасляной кислоты. Термин «алкоксигруппа» относится к группе простого алкилового эфира, где термин «алкил» означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, содержащую не более четырех атомов углерода, такую как метоксигруппа, этоксигруппа, н-пропоксигруппа и им подобные, предпочтительно метоксигруппа.

Выражение «в существенной степени гомогенная форма», как оно употребляется в настоящей заявке, означает, что полученный, содержащийся или применяющийся пегилированный эритропоэтин содержит определенное количество присоединенных групп ПЭГ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пегилированный эритропоэтин является монопегилированным эритропоэтином. Препарат может содержать непрореагировавший (т.е. не несущий группы ПЭГ) эритропоэтин, полипегилированный эритропоэтин, равно как и фрагменты полипептида, образованны в ходе реакции пегилирования. Термин «в существенной степени гомогенная форма» означает, что препарат монопегилированного эритропоэтина содержит в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хотя бы 50% (масс./масс.) монопегилированного эритропоэтина, хотя бы 75% монопегилированного эритропоэтина, хотя бы 90% монопегилированного эритропоэтина или более 95% монопегилированного эритропоэтина. Величины в процентах основаны на проценте площади хроматограммы, отвечающей результатам катионообменной хроматографической очистки, после которой получают монопегилированный эритропоэтин.

Объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, имеющий целью получение монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. Было неожиданно обнаружено, что сочетание двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, использующих одинаковый тип катионита, приводит к монопегилированному эритропоэтину в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, включающий стадии получения раствора, содержащего моно-, поли- и непегилированный эритропоэтин, осуществления двух последовательных катионообменных хроматографических стадий и выделения очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии, причем на обеих катионообменных хроматографических стадиях используется одинаковый тип катионита. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделение на первой катионообменной хроматографической стадии осуществляют с помощью другого способа элюирования, нежели выделение на второй катионообменной хроматографической стадии. В другом варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографическую колонку регенерируют после первой катионообменной хроматографической стадии и после второй катионообменной хроматографической стадии.

Выделение очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии осуществляют посредством элюирования монопегилированного эритропоэтина из задействованного на второй хроматографической стадии катионита. В одном из вариантов осуществлении способа согласно настоящему изобретению две катионообменные хроматографические стадии различаются задействуемым способом элюирования. В этом варианте осуществления первую катионообменную хроматографическую стадию осуществляют с помощью способа ступенчатого элюирования, т.е. ионную силу используемого буфера повышают ступенчато, т.е. скачкообразно, от одной величины ионной силы до следующей величины ионной силы, предпочтительно, посредством изменения на 10% или более. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ ступенчатого элюирования осуществляют в виде трехступенчатого элюирования. На первой ступени из катионообменной хроматографической колонки преимущественно элюируется полипегилированный эритропоэтин. При втором увеличении ионной силы в основном элюируется монопегилированный эритропоэтин с чистотой более 60% исходя из площади соответствующей эксклюзионной хроматограммы (% площади). При третьем повышении ионной силы из колонки преимущественно элюируется остающийся непегилированный эритропоэтин.

Вторую катионообменную хроматографическую стадию проводят в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с помощью способа непрерывного элюирования, т.е. ионная сила буфера повышается непрерывно, предпочтительно, посредством изменения на менее чем 5%. Элюируемые фракции, содержащие монопегилированный эритропоэтин, объединяют с целью получения монопегилированного эритропоэтин в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, и содержащего, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, менее 0,5% форм с низкой молекулярной массой по данным площадей пиков на соответствующей хроматограмме. Буфер предпочтительно присутствует в концентрации от 10 мМ до 250 мМ, а в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения от 50 мМ до 150 мМ, в другом же варианте осуществления настоящего изобретения - приблизительно 100 мМ. Таким образом, в способе согласно настоящему изобретению две последовательные катионообменные хроматографические стадии представляют собой следующую последовательность шагов:

а) введение забуференного водного раствора, содержащего смесь моно-, поли- и непегил