Идентификация молекул, модулирующих белок-белковое взаимодействие

Идентификация молекул, модулирующих белок-белковое взаимодействие

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к материалам и способам определения взаимодействия между рассматриваемыми молекулами. В частности, оно касается возможности установить, модулирует ли определенное соединение, например, «испытываемое соединение», взаимодействие двух или более рассматриваемых конкретных белков. Определение предполагает мониторинг активации репортерного гена, который может находиться в клетке, в растворе или в искусственном окружении или частице, содержащей один или более рассматриваемых реагентов, где активация или ее отсутствие вызывается модуляцией или отсутствием модуляции. Определение обычно проводят с использованием трансформированных или трансфицированных клеток, что также относится к одному из аспектов изобретения, как и агенты, применяемые для их трансформации или трансфекции. Можно также применять бесклеточную систему или систему, использующую искусственное окружение или частицы, содержащие один или несколько рассматриваемых реагентов, например, вирус, вирусоподобная частица, липосома и им подобные.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ И МАТЕРИАЛЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ПРИ ПОДГОТОВКЕ ЗАЯВКИ

Исследования белок-белковых взаимодействий, например, посредством идентификации лигандов для рецепторов, представляют большой интерес. Даже если лиганд или лиганды для определенного рецептора уже известны, сохраняется интерес к идентификации более эффективных или более селективных лигандов. Рецепторы, связанные с G-белком, GPCR, также называемые 7-трансмембранными рецепторами (7TMR), будут обсуждаться в настоящем документе как один из множества примеров класса белков, которые могут быть охарактеризованы указанным выше способом. Вместе с тем данный метод анализа может использоваться в отношении любых белков, которые вступают во взаимодействие, например, участников метаболического пути или каскада.

GPCR являются самым многочисленным классом рецепторов клеточной поверхности, известным для человека, а потому рассматриваются в качестве основного применения настоящего изобретения. К лигандам, которые модулируют сигналы GPCR, относятся гормоны, нейротрансмиттеры, пептиды, гликопротеины, липиды, нуклеотиды и ионы. GPCR также известны как сенсорные рецепторы, например, рецепторы света, запаха, феромонов и вкуса. В связи с разнообразными и многочисленными функциями GPCR являются объектами интенсивных исследований, например, для химической и биологической защиты и для лекарственных препаратов, применяемых для лечения различных патологических состояний. Удалось добиться успехов в создании многих лекарственных препаратов. Например, в работе Howard et al., Trends Pharmacol. Sci., 22:132 140 (2001) отмечается, что более 50% продаваемых лекарственных препаратов проявляют активность в отношении этих рецепторов.

Используемое в настоящем документе сокращение «GPCR» относится к любому члену суперсемейства рецепторов GPCR. Это суперсемейство характеризуется структурой, содержащей семь трансмембранных доменов (7TM). К примерам таких рецепторов, среди прочих, относятся рецепторы класса А или «родопсиноподобные» рецепторы; рецепторы класса В или «секретиноподобные» рецепторы; класса С или «метаботропные глутаматоподобные» рецепторы; рецепторы, относящиеся к классу Frizzled и Smoothened; семейство адгезионных рецепторов или рецепторов EGF-7TM/LNB-7TM; адипонектиновые рецепторы и родственные им рецепторы; а также хемосенсорные рецепторы, в том числе рецепторы запаха, вкуса, сошнико-носовые и феромонные рецепторы. Например, суперсемейство GPCR человека, среди прочих, включает рецепторные молекулы, описанные в работах Vassilatis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:4903 4908 (2003); Takeda et al., FEBS Letters, 520:97 101 (2002); Fredricksson et al., Mol. Pharmacol., 63:1256 1272 (2003); Glusman et al., Genome Res., 11:685 702 (2001); и Zozulya et al., Genome Biol., 2:0018.1 0018.12 (2001).

В сжатой форме общий механизм действия функции GPCR выглядит следующим образом: 1) GPCR связывает лиганд; 2) тем самым вызывает конформационные изменения; 3) стимулирует каскад клеточных событий, которые приводят к изменению физиологии клетки. GPCR передают сигналы посредством модулирования активности множества внутриклеточных белков, например, белков, связывающих гетеротримерный гуанин-нуклеотид (G-белков) и β-аррестинов. В случае G-белков лиганд-рецепторный комплекс стимулирует обмен гуанин-нуклеотида и диссоциацию гетеротримера G-белка на α- и βγ-субъединицы. В других обстоятельствах β-аррестин может выступать вместо G-белка, противодействовать передаче сигнала G-белком, синергически усиливать передачу сигнала G-белком и пр.

Для GTP-связанной α-субъединицы и βγ-гетеродимера регистрировались регулирования различных клеточных эффекторных белков, в том числе аденилатциклазы и фосфолипазы C (PLC). В стандартных клеточных методах анализа для GPCR рецепторная активность отслеживается посредством измерения выхода регулируемого G-белком эффекторного пути, например, по накоплению цАМФ, продуцируемого аденилатциклазой, или высвобождение внутриклеточного кальция, например, стимулированное активностью PLC.

По многим причинам было сложно разработать стандартные методы анализа для основанной на G-белке передаче сигнала для некоторых из мишеней. Например, во-первых, различные GPCR связаны с различными путями передачи сигнала, регулируемыми G-белками. Стандартные методы анализа, основанные на G-белках, зависят от знания специфичности G-белка к целевому рецептору, или же такие методы анализа требуют генно-инженерной клеточной системы, обеспечивающей участие целевого рецептора на эффекторном пути выбранного G-белка. Во-вторых, поскольку суперсемейство GPCR столь велико, все клетки экспрессируют множество эндогенных GPCR (а также другие рецепторы и сигнальные факторы). Поэтому регистрируемые эффекторные пути могут модулироваться эндогенными молекулами, не только целевыми GPCR. Следствием данного явления могут быть ложноположительные или ложноотрицательные результаты, например, при попытке идентифицировать селективные модуляторы целевого GPCR.

Регулирование активности G-белка не является единственным результатом связывания лиганд/GPCR. См., например, Luttrell et al., J. Cell Sci., 115:455 465 (2002) и Ferguson, Pharmacol. Rev., 53:1 24 (2001), где приводится обзор воздействий, которые в состоянии стать причиной подавления или прекращения передачи сигнала GPCR. Такие процессы подавления сигнала применяются для предотвращения чрезмерной стимуляции клеток, а также для обеспечения временной взаимосвязи между внеклеточным сигналом и соответствующим внутриклеточным путем.

В общем случае, связывание агониста с GPCR обеспечивает фосфорилирование остатков серина и треонина в С-терминальной части молекулы рецептора GPCR-киназой. Связанные в комплекс с агонистом фосфорилированные по С-терминальной части GPCR затем взаимодействуют с членами семейства аррестинов, например, α-аррестином, β-аррестином или β-аррестином-2, которые подавляют или прекращают передачу сигнала рецептором. Связывание может ингибировать взаимодействие рецептора с G-белками, тем самым направляя рецептор на интернализацию с последующим распадом и (или) регенерацией. Например, связывание аррестина, такого как β-аррестина-2, с фосфорилированным GPCR может различным образом снижать активность целевого GPCR. Простейший механизм ингибирования аррестином его мишени предполагает связывание с внутриклеточным доменом GPCR и, тем самым, блокирование сайта связывания для гетеротримерного G-белка, что препятствует активации пути за счет внеклеточных сигналов (десенсибилизация). Другой регуляторный механизм, используемый аррестинами, заключается в связывании рецептора с элементами аппарата мембранной интернализации (например, эндоцитозом, опосредованным клатрином), что инициирует интернализацию рецептора в везикуле с оболочкой для слияния с эндосомой. После попадания в эндосому рецептор может подвергаться распаду (например, лизосомами) или может регенерироваться в цитоплазматическую мембрану, где он снова может быть активирован.

Поэтому можно сказать, что связывание лиганда с GPCR «модулирует» взаимодействие между GPCR и аррестиновыми белками, поскольку связывание лиганда с GPCR приводит к связыванию аррестина с GPCR, тем самым модулируя его активность. В настоящем документе термин «модулирует» (или любая его производная форма) в отношении взаимодействия или связывания просто означает некоторое изменение в характере взаимодействия двух белков настоящего изобретения, например, в присутствии испытываемого соединения или лиганда, по сравнению с характером взаимодействия этих двух белков в его отсутствие. Таким образом, модуляция включает простое связывание двух молекул. Например, присутствие испытываемого соединения может усиливать или повышать степень взаимодействия двух белков, ослаблять взаимодействие, блокировать, ингибировать, переадресовывать, снижать или модифицировать его определенным образом, определенным способом или в определенной форме, которые поддаются детектированию, или же испытываемое соединение может способствовать повышению вероятности взаимодействия и пр.

В некоторых случаях передача сигнала 7TMR может происходить без участия G-белков. Так, при связывании лиганда с 7TMR β-аррестин, а не G-белок используется для вызывания или инициирования каскада передачи сигнала в клетке. См., например, Violin & Lefkowitz, Trends Pharm Sciences 28(8)416-422, 2007 и DeFea, Br J Pharm 1-12, doi:10.1038/sj.bjp.0707508, 2007, где приведена сводная информация о двух независимых и взаимозависимых путях передачи сигнала, которые начинаются с активированного 7TMR и в которых могут быть задействованы как G-белок, так и β-аррестин; или либо G-белок, либо β-аррестин.

Так, например, известные антагонисты 7TMR активируют передачу сигнала β-аррестином. Пропранолол, известный антагонист β₂-адренергического рецептора (ADRB2) и передачи сигнала G-белком, оказался частичным агонистом передачи сигнала β-аррестина, активирующим пути передачи сигнала, инициируемые β-аррестином, как это было установлено в ходе практических применений настоящего изобретения.

События передачи сигналов в клетке, реагирующие на внешние стимулы, обычно опосредованы белок-белковыми взаимодействиями. Поэтому белок-белковые взаимодействия представляют значительный интерес для клеточных физиологов. Одним из инструментов мониторинга таких взаимодействий является дополнительный рибосомный белок или пермутированный белок, активирующий репортер, например, протеаза вируса гравировки табака (TEV). Расщепленные части протеазы восстанавливают активность при совместной экспрессии в качестве слитой конструкции со взаимодействующими белками. Wehr et al., «Monitoring Regulated Protein-protein Interactions Using Split TEV», Nature Methods, 3:985-993 (2006). Это свойство использовалось в сочетании с репортерными системами, связанными с транскрипцией.

Понимание перечисленных механизмов позволило предложить альтернативные способы анализа активации и ингибирования GPCR. Один из таких способов предполагает мониторинг взаимодействия с аррестинами в интактной клетке, несущей в себе аппарат транскрипции. Преимущество такого подхода состоит в том, что отпадает необходимость в знаниях путей взаимодействия G-белка. См., например, патент США № 7049076: «Method for Assaying Protein-Protein Interaction», выданный Lee et al. Lee et al. сообщают о репортерной системе, которая нуждается в репортерных системах, связанных с транскрипцией. Согласно Lee et al. при взаимодействии двух белков от первого белка отщепляется пептидный фактор транскрипции. Второй белок является фактором транскрипции, который активирует репортерный ген. Затем фактор выполняет репортерную функцию за счет транспортировки к ядру, чтобы осуществить транскрипцию детектируемого репортера. Поскольку способ зависит от транскрипции, его невозможно применять, например, в тромбоцитах, искусственном окружении или частицах, например, липосомах, спиралевидных агрегатах, вирусоподобных частицах и частицах вирусов.

В работе Oakley et al., Assay Drug Dev. Technol., 1:21 30 (2002) и патентах США №№ 5891646 и 6110693, «Methods Of Assaying Receptor Activity and Constructs Useful in Such Methods», выданных Barak et al., описываются методы анализа, с помощью которых измеряется перераспределение флуоресцентно-меченных молекул аррестина в цитоплазме на активированные рецепторы на поверхности клетки. Указанные методы опираются на визуализацию клеток с высоким разрешением для измерения релокализации аррестина и активации рецепторов. Квалифицированным специалистам в области будет очевидно, что это сложная и трудоемкая процедура, которой могут помешать аффинность и воздействие комплементарных фрагментов фермента, используемого в настоящем изобретении, который может конкурировать с искомым взаимодействием, индуцированным модулятором. Поэтому недостатком данного метода является получение ложноположительных результатов, возникающих вследствие собственной реассоциации фермента, независимо от связывания лиганда. Было бы желательно разработать более простой, более стабильный метод анализа с меньшей частотой ложноположительных результатов, который можно было бы без труда адаптировать для высокопроизводительного скрининга.

Выдавалось и направлялось множество других патентов США и патентных заявок, касающихся перечисленных проблем. Например, патент США № 6528271, «Inhibition Of β-Arrestin Mediated Effects Prolongs and Potentiates Opioid Receptor-Mediated Analgesia», выданный Bohn et al., описывает методы анализа для скрининга болеутоляющих средств, в которых измеряется ингибирование связывания β-аррестина. В опубликованных патентных заявках США, например, 2004/0002119, 2003/0157553 и 2003/0143626; а также в патенте США № 6884870 предложены различные формы анализа с использованием GPCR. В патенте США № 7128915 описана аналогичная технология GPCR. В указанном выше патенте США № 7049076, который в общем касается функций GPCR или методов скрининга, продемонстрирована значимость исследований GPCR.

Таким образом, для решения насущных задач в области достаточно одной из особенностей настоящего изобретения, а именно, обеспечения более простого метода анализа для отслеживания и (или) определения модулирования специфических белок-белковых взаимодействий, например, опосредованных рецепторами физиологических процессов, таких как опосредованный GPCR клеточный отклик, где к белкам, среди прочих, относятся интегрированные в мембрану белки, в том числе рецепторы в целом, а также GPCR в качестве важного примера.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагаются способы, позволяющие определить, модулирует ли испытываемое соединение рассматриваемое специфическое белок-белковое взаимодействие. Белок-белковое взаимодействие является фундаментальным механизмом биологии, посредством которых клетка может взаимодействовать со своим окружением, внеклеточным событием, например, связыванием лиганда с рецептором, и может продуцировать внутренний ответ в условиях интернализации лиганда или без таковой. В интернализации может быть задействовано два или более белка, части которых находятся на мембране или за ее пределами. Поэтому образование димера, гетеродимера или мультимера может продуцировать внутренний ответ. Внутриклеточные белок-белковые взаимодействия могут быть также задействованы в сигнальных каскадах. Общая схема настоящего изобретения применима к белок-белковым взаимодействиям любого рода. Например, взаимодействие может осуществляться между двумя интегрированными в мембрану белками, между интегрированным в мембрану белком и цитоплазматическим белком, между цитоплазматическими белками и пр. В одном из примеров осуществления рассматривается цитоплазматический белок, который подвергается транслокации в другую органеллу, например, ядро, где происходит активация репортера для возникновения сигнала. Предпочтительно использование анализа на клеточной основе, но может применяться и бесклеточная система, например, с привлечением лизатов, мембранных фракций, ядерных фракций и пр. Сюда же относятся и системы с искусственным окружением или частицами, содержащие один или несколько рассматриваемых реагентов, например, липосомы, вирусоподобные частицы и пр. Настоящее изобретение является усовершенствованием обсуждавшегося выше патента Lee et al., поскольку в данном случае отпадает потребность в транскрипции. Поэтому результаты могут быть получены быстрее, и их можно получать в клеточной и бесклеточной системах. Ниже приводится общее описание некоторых особенно предпочтительных примеров осуществления изобретения. Приведенные примеры осуществления носят иллюстративный характер и ни в коей мере не ограничивают широту охвата изобретения, описанного в настоящем документе и в формуле изобретения.

Одна из особенностей, рассматриваемых в настоящем изобретении, включает контакт по крайней мере одного испытываемого соединения с поверхностью клетки, которая экспрессирует рассматриваемый белок. Испытываемое соединение может оцениваться по его способности модулировать активность рассматриваемого белка, например, рецепторного белка. Экспрессия рассматриваемого белка может быть результатом трансформации или трансфекции выбранной клетки, например, клеточной линии насекомых или млекопитающих, проводимой посредством: (1) молекулы нуклеиновой кислоты или молекул, состоящей (состоящих) из (a) полинуклеотида, который кодирует первый рассматриваемый белок, и (b) полинуклеотида, который кодирует активирующий репортер белок, содержащий сайт расщепления, чувствительный к протеазе, или активную или активируемую часть протеазы, и (2) молекулы нуклеиновой кислоты или молекул, состоящей (состоящих) из (a) полинуклеотида, который кодирует второй белок, взаимодействие которого с первым рассматриваемым белком изменяется в присутствии модулятора, например, положительно действующего испытываемого соединения, и (b) полинуклеотида, который кодирует протеазу или активную или активируемую часть протеазы, специфичную к сайту расщепления, кодируемому нуклеиновой кислотой (1). Молекулы, например, положительно действующего испытываемого соединения, которые модулируют рассматриваемые белок-белковые взаимодействия (между двумя рассматриваемыми белками), могут оцениваться или анализироваться при добавлении, например, при необходимости, субстратов активирующего репортер белка в клетках, экспрессирующих первый и второй рассматриваемые белки, и репортерной системы в соответствии с описанием настоящего изобретения.

Поэтому способом, предлагаемым в настоящем изобретении, может быть использование пермутируемого фермента для регистрации рассматриваемого белок-белкового взаимодействия. Пермутируемый активирующий белок, например фермент, используемый в качестве репортера или активирующего репортер белка, может находиться в инактивированном состоянии, которое можно активировать, например, расщеплением, посредством, к примеру, ферментативной активности, связанной со вторым рассматриваемым белком. В другом варианте используется инактивированный активирующий репортер белок, который активируется при взаимодействии первого и второго рассматриваемых белков. Таким образом, можно проводить скрининг соединений, которые модулируют взаимодействие первого и второго рассматриваемых белков. Одним из достоинств такой системы является то, что она обеспечивает высокопроизводительную идентификацию молекул, которые избирательно модулируют определенные белок-белковые взаимодействия.

Фермент, который в состоянии (в одиночку или с одной или несколькими связанными молекулами) продуцировать регистрируемый «белок А», присутствует в форме, активность которой можно изменять. За счет такого изменения можно активировать или инактивировать фермент. Например, в фермент можно встраивать сайт расщепления, с тем чтобы инактивировать его при расщеплении, к примеру, посредством второго фермента, связанного со вторым рассматриваемым белком.

В альтернативном варианте расщепление может приводить к активации. Выбранный фермент (или ферменты) можно встраивать в желаемую клетку-хозяина за счет использования одной или нескольких нуклеиновых кислот. Например, вектор может включать полинуклеотид, который кодирует выбранную молекулу в качестве инактивированного фермента, который может быть активирован посредством расщепления неактивного фермента по сайту расщепления. Сайт расщепления может иметь естественное происхождение, но предпочтительно, его вставляют в полинуклеотид, чтобы его, экспрессия приводила к пермутированному ферменту. Например, в клетку-хозяин могут трансфектировать сайт расщепления, который не является нативным для белка данной клетки, и (или) белок, который не является нативным для клетки-хозяина. Альтернативные примеры осуществления включают фермент, активируемый за счет расщепления либо посредством удаления блокирующего пептида, либо посредством стимуляции изменения конфигурации двух полипептидов для их перегруппировки с последующей активацией ферментативной активности.

Таким образом, один из примеров осуществления относится к активному полипептиду, например ферменту. «Фермент» можно инактивировать посредством расщепления. В целях специфичности, возможно, понадобится сформировать в ферменте сайт расщепления, распознаваемый протеазой, который не является нативным для клетки-хозяина. Сайт расщепления можно вводить в форме линкера, который связывает, то есть сохраняет в контакте, две части или два мотива «фермента», такой линкер может быть сайтом расщепления, нативным для «фермента», например, фермент с сайтом расщепления может происходить из другого типа клеток или другого вида организмов и отсутствовать в клетке-хозяине, или же сайт расщепления может получаться за счет консервативного замещения одной или нескольких аминокислот. Консервативные замещения хорошо известны специалистам в области. Например, заряд, размер, ароматичность или другие характеристики могут оставаться неизменными для сохранения активности. Активность необязательно должна совпадать с таковой для непермутированного «фермента», но должна изменяться при расщеплении по сайту расщепления. Сайт расщепления может быть вставлен между двумя частями фермента. Расщепление по сайту может разрушать фермент, вызывая, тем самым, инактивацию, или может допускать сохранение каталитической активности, например, за счет удаления пептидной части, которая блокирует связывание или каталитический сайт, или позволяя двум частям пермутированного фермента взаимодействовать таким образом, который обеспечивает восстановление активности.

Поэтому расщепление по сайту расщепления может инактивировать или активировать регистрируемый белок. Расщепление может проходить в присутствии испытываемого соединения, например, если продукт экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, которая включает полинуклеотид, кодирующий второй рассматриваемый белок, взаимодействует с первым рассматриваемым белком, тем самым инициируя активность протеазы, которая распознает и расщепляет последовательность, чувствительную к расщеплению протеазой в пермутированном белке, активирующем репортер.

Второй рассматриваемый белок взаимодействует с первым рассматриваемым белком в присутствии третьей молекулы или же, в альтернативном варианте, в ее отсутствие. Таким образом, считается, что такая третья молекула модулирует белок-белковое взаимодействие между полипептидами А и В. Поэтому белок-белковое взаимодействие или пептид-пептид (для целей настоящего обсуждения термины «белок» и «пептид» являются равнозначными), которое модулируется третьей молекулой, например, испытываемым соединением, эффективно выявляется системой настоящего изобретения. Молекулы, которые модулируют белок-белковое взаимодействие (между полипептидами, обозначаемыми 1 и 2, первый и второй, А и В, каковые выражения и определения в настоящем документе являются равнозначными), можно регистрировать по активной молекуле, активирующей репортер, или же при добавлении субстрата активного белка, активирующего репортер, к клеткам, экспрессирующим систему, включающую рассматриваемые белки.

Выбор белков А и В определяется в зависимости от поставленной цели, поскольку могут использоваться пары молекул, для которых известна или предполагается возможность ассоциации, взаимодействия и пр. Как обсуждалось в настоящем документе, подходящей парой является 7TMR с либо G-белком, либо β-аррестином. Другим примером является рецептор Frizzled и связывающий белок Dishevelled и пр. Еще одним примером будет белок, действующий во время и после взаимодействия клетка-клетка. Значит белки А и В находятся в клетке 1. Если клетка 1 вступает в контакт с клеткой 2, такое взаимодействие вызывает реакцию клетки 1 и в клетке 1, на что указывает ассоциация, взаимодействие и пр. белков А и В, что далее показывают реагенты настоящего изобретения, которые продуцируют четкий и детектируемый сигнал.

Еще одним примером является случай, когда белок А экспрессируется на клетке 1, а белок В экспрессируется на клетке 2. Это может достигаться, например, методами генной инженерии, так чтобы G-белок или β-аррестин имели внеклеточный домен, или так чтобы активирующий репортер белок имел внеклеточный домен, которые могла бы активировать, к примеру, клетка 1 после активации клетки 1 лигандом или потенциальным лекарственным препаратом. В альтернативном варианте возможна спонтанная ассоциация эндогенных молекул двух клеток. В другом примере осуществления протеаза и активирующая репортер молекула подбираются таким образом, чтобы экспрессироваться на поверхности клетки или частицы в виде внеклеточных доменов.

В еще одном примере осуществления к белкам, которые ассоциируются, агрегируются и пр. с образованием композитной структуры, относятся белки А и В. Рассматриваемый метод анализа может использоваться для идентификации молекул, которые способствуют ассоциации или агрегированию или препятствуют им. Примером может быть образование капсида вируса, частицы вирусоподобного агрегата или образование рибосомы.

В рамках общих механизмов для рецепторов, связанных с G-белками (GPCR также известны как 7TMR, каковые термины равнозначно используются в настоящем документе), активация GPCR агонистом приводит к вовлечению в процесс внутриклеточной молекулы, которая задействована в пути передачи сигнала, например, в инициировании, прекращении, синергическом усилении, противодействии и пр., например, в случае G-белка или β-аррестина. Поэтому киназа рецептора, связанного с G-белком, может действовать на активированный рецептор, приводя к его фосфорилированию. Фосфорилированный рецептор способствует связыванию β-аррестинов с рецептором. Этот механизм сохраняется для некоторых GPCR. В других случаях активированный рецептор вместо этого реагирует с β-аррестином.

Для оценки реакционной способности молекул, модулирующих белок-белковое взаимодействие, например, активацию GPCR, была разработана система анализа белок-белковых взаимодействий, которая была протестирована на системе GPCR-пермутированной репортерной молекулы. Например, системой молекулы репортера может быть система для анализа люцифераза/люциферин. Как правило, в качестве молекулы репортера выступает экзогенная молекула, чужеродная для клетки-хозяина или механизма передачи сигнала. За счет этого удается свести к минимуму спонтанную активацию молекулы репортера клеткой-хозяином и в клетке-хозяине и, тем самым, генерацию сигнала, а значит, и ложноположительные результаты. Активирующая репортер молекула может иметь доменную структуру или может пермутироваться так, чтобы продуцировать инактивированный белок, активирующий репортер, который может проявлять репортерную активность при определенных манипуляциях. Поэтому в настоящем применении подразумевается использование латентной молекулы, активирующей репортер. Пермутированная молекула, активирующая репортер, сводит к минимуму спонтанную активность молекулы, активирующей репортер, а значит, и ложноположительные результаты. Например, при анализе комплементации фрагментов фермента аффинность фрагментов фермента может доминировать над кинетикой реакции с молекулой-мишенью, лигандом или молекулой, которая проходит скрининг, так что происходит спонтанная реассоциация фрагментов фермента в функциональную молекулу, что способствует более высокому фону и (или) ложноположительным результатам. Рассматриваемый пермутированный белок, активирующий репортер, может быть сконструирован таким образом, чтобы содержать сайт, который под воздействием позволяет пермутированной молекуле, активирующей репортер, образовать функциональную молекулу. Таким сайтом может быть сайт протеазы. Сайтом протеазы предпочтительно является уникальный сайт, который редко присутствует или отсутствует в клетке-хозяине или частице, в которой находится компонент или компоненты рассматриваемого метода. За счет этого обеспечиваются дополнительные средства, позволяющие избежать спонтанной реассоциации интактной молекулы, активирующей репортер, а значит, сводятся к минимуму ложноположительные результаты. Специфический сигнал наблюдается, только если задействованные лиганды, в конечном счете, индуцируют протеазу в непосредственной близости от инактивированного белка, активирующего репортер, для его расщепления, и только в этом случае может образовываться объект, активирующий или генерирующий активный сигнал. Специалистам в области известен ряд протеаз, которые могут использоваться для практических приложений настоящего изобретения. Например, могут использоваться протеазы из вирусных источников, поскольку они, как правило, являются чужеродными для интактной клетки-хозяина. В одном из приложений используется ген пермутированного белка, активирующего репортер, в котором кодирующая последовательность люциферазы светлячка сцеплена с С-терминальным концом последовательности GPCR, а β-аррестин-2 (Ar2 или Arr2) связан с геном протеазы вируса гравировки табака (TEV). В другом примере осуществления пермутированная люцифераза сцеплена с β-аррестином (Ar или Arr), а ген TEV связан с белком на пути передачи сигнала, реагирующим с β-аррестином, или с рецептором, например, 7TMR, предположительно действующим независимо от G-белков. Если плазмида, сконструированная так, чтобы экспрессировать оба указанных выше белка, подвергается экспрессии в клетках, соединения, модулирующие взаимодействие GPCR-аррестин-2, привлекают слитый белок Arr2-протеазы в сайт распознавания протеазы в пермутированной люциферазе, и протеаза TEV расщепляет пермутированную люциферазу. Эффект воздействия испытываемых соединений можно измерять по изменению энзиматической активности, которая обеспечивается за счет реконструкции белка, активирующего репортер, в этом случае люцифераза становится активной и может генерировать детектируемый сигнал за счет воздействия на подходящий субстрат, например люциферин.

Охват изобретения не ограничивается люциферазой или даже ферментами. Активирование посредством расщепления относится к известным явлениям, таким как проэнзимы. Возможно применение также неэнзиматических репортерных систем. Например, может использоваться зеленый флуоресцентный белок (GFP). Пермутированный GFP, например GFP с перестановкой частей, может играть роль белка, активирующего репортер, и репортера. Действие протеазы, например, TEV или другой протеазы с ее сайтом распознавания, включенным в пермутированный пептид, приводит к расщеплению пермутированного белка, активирующего репортер/репортера, тем самым делая возможным реорганизацию, которая продуцирует сигнал. GFP сам по себе обладает преимуществами детектируемой молекулы, передающей сигнал репортеру. В альтернативном варианте в репортерные молекулы можно ввести сайты расщепления, которые не оказывают заметного возмущающего воздействия на сигнал. Расщепление, возникающее вследствие белок-белкового взаимодействия, затем приводит к снижению сигнала репортера. В конструкцию репортера может вводиться несколько сайтов расщепления.

Третичная структура белка может быть подспорьем для квалифицированного специалиста в области при определении места введения сайтов расщепления. Например, если две части полипептида находятся в тесном контакте, то можно ожидать, что разделение этих частей за счет нарушения последовательности снизит или устранит активность. Можно предположить, что после расщепления эти части будут взаимодействовать, что приведет к восстановлению активности.

Первым рассматриваемым белком может быть интегрированный в мембрану белок, например, трансмембранный рецептор, такой как GPCR. К примерам трансмембранных рецепторов относятся β-адренергический рецептор (ADRB2), рецептор аргинин-вазопрессина-2 (AVPR2 или V2), рецептор серотонина-1a (HTR1 A), мускариновый рецептор ацетилхолина m2 (CHRM2), рецептор хемокина-5 (C-C мотив) (CCR5), рецептор дофамина-D2 (DRD2), каппа-опиоидный рецептор (OPRK) или α1a-адренергический рецептор (ADRA1A) и пр. Интегрированные в мембрану рецепторы хорошо известны специалистам в области. Следует понимать, что во всех случаях охват изобретения не ограничивается рамками конкретных примеров осуществления, описанных в форме примеров настоящего изобретения. Например, такие молекулы, как рецептор инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1R), который представляет собой тирозинкиназу, и белки, которые в обычном состоянии не являются интегрированными в мембрану, подобно рецептору эстрогена-1 (ESR1) и рецептору эстрогена-2 (ESR2), могут также использоваться в настоящем изобретении. Протеаза или часть протеазы, связанная с белком В, может быть протеазой ядерного включения вируса гравировки табака A (TEV). TEV обладает сайтом распознавания, содержащим семь аминокислотных остатков, а потому более специфичен, чем протеазы с меньшими, статистически более распространенными сайтами распознавания. Другие протеазы также подходят для применения в настоящем изобретении. Например, энтерокиназа и протеаза фактора Xa, каждая из которых имеет последовательность распознавания с пятью аминокислотными остатками, тромбин и PureAct^TM или Clean Cut^TM, каждый из которых имеет последовательность распознавания из шести аминокислотных остатков, и PreScission^TM с последовательностью распознавания из семи аминокислотных остатков также являются протеазами, которые могут использоваться в настоящем изобретении. Настоящее изобретение не ограничивается использованием какой-либо конкретной протеазы. При этом протеаза должна обеспечивать расщепление на сайте, что приводит к генерации или изменению сигнала от репортера.

В качестве белка, который активирует репортер, может выступать любой фермент, который может действовать на субстрат для генерации детектируемого сигнала. Например, фермент может прямо или косвенно усиливать или ослаблять флуоресценцию или хемилюминесценцию, или может вызывать изменение цвета. Репортерный субстрат может иметь биологическую природу, например, белок, или может быть химическим соединением, реакцию которого катализирует репортерный фермент. Вторым рассматриваемым белком может быть ингибирующий белок, например аррестин. Аррестины обычно взаимодействуют с GPCR, чтобы модулировать активность в ответ на взаимодействие лиганда с рецептором. Клетка может быть эукариотом или прокариотом. В качестве репортера может выступать экзогенный компонент, например, β-галактозидаза или люцифераза. Для простоты термин «репортерный фермент» используется в качестве эквивалента молекулы, активирующей репортер; активатора репортера; молекулы, модулирующей репортер; белка, модулирующего репортер; или белка, активирующего репортер, а также в качестве сокращенного названия молекулы, которая приводит к изменениям в выходе репортера. Например, репортерный фермент может ферметативно вызывать изменение репортерного сигнала или, например, может ферметативно или неферметативно вызывать изменение сигнала, например, сигнала флуоресценции. Квалифицированный специалист в области имеет представление о различных репортерных системах и белках, которые модулируют или активируют репортерный сигнал.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая первый белок, может быть модифицирована, с тем чтобы увеличить взаимодействие со вторым белком. К таким модификациям, среди прочи