Стабилизированные полипептиды инсулиноподобного фактора роста

Стабилизированные полипептиды инсулиноподобного фактора роста

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Инсулиноподобные факторы роста (IGF) являются частью комплексной системы, которую клетки используют для связи с их физиологическим окружением. Эта комплексная система (которую часто называют осью инсулиноподобных факторов роста) состоит из двух расположенных на клеточной поверхности рецепторов (IGF-1R и IGF-2R), двух лигандов (IGF-1 и IGF-2), семейства, состоящего из шести обладающих высокой аффинностью к связыванию IGF белков (IGFBP 1-6), и ассоциированных с IGFBP расщепляющих ферментов (протеаз). Эта система важна не только для регуляции нормальной физиологической функции, она участвует также в некоторых патологических состояниях (Glass, Nat Cell Biol 5, 2003, с.87-90).

Установлено, что ось IGF играет роль в усилении клеточной пролиферации и ингибировании клеточной гибели (апоптоз). IGF-1 секретируется главным образом печенью в результате стимуляции человеческим гормоном роста (hGH). IGF-1 оказывает воздействие почти на все клетки в человеческом организме, прежде всего на клетки в мышцах, хрящах, костях, печени, почках, нервах, коже и легких. Помимо инсулиноподобного действия, IGF-1 может регулировать также рост клеток. IGF-1 и IGF-2 регулируются семейством генных продуктов, которые известны как IGF-связывающие белки. Эти белки способствуют модуляции действия IGF сложными путями, которые включают как ингибирование действия IGF в результате предотвращения связывания с IGF-рецепторами, так и усиление действия IGF благодаря «помощи» в переносе к рецепторам и удлинению времени полужизни IGF в кровотоке. Существует по меньшей мере шесть обладающих способностью к связыванию с IGF белков (IGFBP1-6).

В своей зрелой форме человеческий IGF-1 (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa; SEQ ID NO:1), который называют также соматомедином, представляет собой небольшой состоящий из 70 аминокислот белок, который, как установлено, стимулирует рост широкого разнообразия клеток в культуре. Кодирование зрелого белка инициируется тремя известными полученными в результате сплайсинга вариантами мРНК. Открытая рамка считывания каждой мРНК кодирует белок-предшественник, содержащий 70 аминокислот IGF-1 и конкретный Е-пептид на С-конце, в зависимости от конкретной мРНК IGF-1. Эти Е-пептиды, которые обозначены как Еа-пептид (rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEQ ID NO:2), Eb-пептид (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk; SEQ ID NO:3) и Ес-пептид (rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk; SEQ ID NO:4), состоят из 35-87 аминокислот и содержат общую последовательность на N-конце и вариабельную последовательность на С-конце. Например, открытая рамка считывания дикого типа IGF-1-Ea кодирует состоящий из 105 аминокислот полипептид (gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssrrapqtgivde cfrscdirrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm; SEQ ID NO:5). При экспрессии в физиологических условиях Е-пептиды отщепляются от предшественника с помощью эндогенных протеаз с образованием зрелого состоящего из 70 аминокислот IGF-1, который, как известно, обладает биологической активностью. Установлено, что в определенных ситуациях 1-3 N-концевых аминокислот IGF-1 отщепляются в физиологических условиях с образованием активного IGF-1, который состоит из 67-70 аминокислот. Экспрессия и процессинг гена IGF-2 характеризуются сходными особенностями за исключением наличия только одного Е-пептида (rdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggap pemasnrk; SEQ ID NO:6), который был идентифицирован в состоящем из 156 аминокислот предшественнике IGF-2 (ayrpsetlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiveeccfrscdlalletycatpakserdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk; SEQ ID NO:7). Как IGF-1, так и IGF-2, по-видимому, обладают неудовлетворительными свойствами в качестве лекарственных средств-кандидатов, поскольку эти белки быстро расщепляются эндогенными протеазами в сыворотке пациентов. Одной из возможных стратегий является стабилизация IGF-1 с получением лекарственного средства путем образования комплекса с одним из связывающихся с ним белков.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что белок-предшественник IGF-1 или IGF-2, который содержит практически соответствующий ему Е-пептид, является биологическим активным и стабилизированным в присутствии сыворотки, что приводит к образованию полипептида IGF-1 или IGF-2, который можно применять в качестве фармацевтического средства. В композициях, предлагаемых в изобретении, не происходит имеющее место в естественных условиях (нормальное) отщепление Е-пептида от IGF-1, например, в результате мутации или делеции либо аргинина в положении 1, либо серина в положении 2 Е-пептидов (что соответствует положениям 71 и 72 в предшественнике IGF-1 дикого типа). В IGF-2 отщепление не происходит, например, в результате мутации или делеции или аргинина в положении 1, или аспарагиновой кислоты в положении 2 Е-пептида (что соответствует положениям 68 и 69 в предшественнике IGF-2 дикого типа). Другие модификации в белке-предшественнике IGF могут приводить к аннулированию или снижению указанного расщепления.

Кроме того, дополнительные модификации аминокислотой последовательности предшественника IGF-1 могут придавать дополнительные ценные фармацевтические свойства. Например, полипептиды, предлагаемые в изобретении, могут обладать повышенной аффинностью к рецептору IGF-1 или пониженной способностью к связыванию с ингибирующим IGF-1 или IGF-2 связывающимся белком.

Для ясности и единообразия нумерация аминокислотных остатков в предшественниках или зрелых белках IGF-1 или IGF-2 в контексте настоящего описания и в формуле изобретения основана на нумерации в последовательности белка-предшественника дикого типа без сигнального пептида.

Таким образом, изобретение относится к полипептиду, содержащему человеческий белок-предшественник IGF-1, в котором отщепление Е-пептида от IGF-1 протеазой снижено в результате модификации белка-предшественника. Е-пептид может представлять собой Еа-, Eb- или Ес-пептид. На N-конце предшественника аминокислоты G1, P2 или Е3 белка-предшественника могут быть удалены в результате делеции или изменены в результате мутации, например, могут представлять собой R36 (например, R36A) и R37 (например, R37A).

Белок-предшественник может дополнительно включать консенсусную последовательность N-связанного гликозилирования NXS/T, например, в результате встраивания аминокислот 93-102, характерных для Еа-пептида, между аминокислотами N95 и Т96 Eb-пептида. В целом, белок-предшественник может включать олигосахарид, ковалентно связанный с боковой цепью аминокислоты белка-предшественника, такой как боковая цепь аргинина белка-предшественника.

Кроме того, остатки белка-предшественника можно заменять на не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты (например, на аминокислоты, которые содержат ацетиленовую группу или азидогруппу). Такие не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты могут облегчать связывание поли(этиленгликольного) звена с боковой цепью белка-предшественника, хотя в данной области хорошо известны общепринятые стратегии пэгилирования белков.

Белок-предшественник может включать также один или несколько дополнительных Е-пептидов, сцепленных с С-концом белка-предшественника. Например, полипептид может включать в направлении от N-конца к С-концу (1) белок-предшественник IGF-1, который несет первый Eb-пептид, в котором G1, Р1 и Е1 удалены в результате делеции либо R36, либо R37, либо обе аминокислоты изменены в результате мутации, R71 и S72 удалены в результате делеции и последние семь С-концевых аминокислот первого Eb-пептида удалены в результате делеции; (2) второй Eb-пептид, при этом R71, S72 и последние семь С-концевых аминокислот второго Eb-пептида удалены в результате делеции; (3) третий Eb-пептид, при этом R71, S72 и последние семь С-концевых аминокислот третьего Eb-пептида удалены в результате делеции; и (4) четвертый Eb-пептид, в котором R71 и S72 удалены в результате делеции.

Эффективным путем предупреждения отщепления Е-пептида от IGF-1 является делеция или мутация R71 или S72.

Аналогично этому изобретение относится к человеческому белку-предшественнику IGF-2, в котором отщепление Е-пептида от IGF-2 протеазой снижают путем модификации белка-предшественника. В частности, делеция или мутация R68 или D69 могут представлять собой эффективные пути аннулирования протеазного расщепления белка-предшественника GF-2.

Кроме того, любой Е-пептид IGF-1 можно объединять с IGF-2 и любой Е-пептид IGF-2 можно объединять с IGF-1 с получением указанных в настоящем описании благоприятных действий.

Изобретение относится также к способу лечения заболеваний костно-мышечной системы, диабета, гибели нейронов, заключающемуся в том, что вводят в эффективном количестве полипептид, предлагаемый в изобретении. Изобретение относится также к применению полипептида, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, которое предназначено для лечения заболеваний костно-мышечной системы, диабета, гибели нейронов или анемии.

Другим вариантом осуществления изобретения является пэгилированный IGF-1, который не содержит Е-пептид, но в который интродуцирована не встречающаяся в естественных условиях аминокислота в качестве сайта пэгилирования. Под объем изобретения подпадает также любой модифицированный, пэгилированный IGF-1, который содержит не встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, указанную в настоящем описании, без Е-пептида.

В изобретении описаны также применяемые в ветеринарии способы и варианты введения полипептида, предлагаемого в изобретении, в эффективном количестве для получения требуемого действия.

Применение в ветеринарии включает (I) увеличение скорости роста и/или размера животного, (II) повышение эффективности превращения корма в ткани организма, (III) увеличение производства молока у животных на стадии лактации, (IV) лечение животного, имеющего симптомы, связанные с кахексией, травмой или другими ассоциированными с истощением заболеваниями, и (V) лечение находящихся на стадии лактации животных для улучшения здоровья новорожденных.

Все процитированные ссылки или документы включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1А-1В - результаты Вестерн-блоттинга полипептидов, предлагаемых в изобретении, и предшественника IGF-1 дикого типа после отсутствия инкубации (0 ч) или 16-часовой инкубации в присутствии 10% человеческой сыворотки или без нее при 37°С. Экспрессионными векторами, кодирующими различные конструкции IGF-1, трансфектировали клетки линии Cos7 и получали кондиционированную среду. Обозначение «3mut» относится к предшественнику, представляющему собой hIGF-1-Е-пептид, который имеет следующие три набора модификаций: делецию G1, P2 и Е3; мутацию, приводящую к замене Arg 37 на Ala (R37A); и делецию R71 и S72. На фиг.1А показаны результаты Вестерн-блоттинга (с использованием антитела к IGF-1) полипептида дикого типа и 3mut-предшественника, который содержит Еа. На фиг.1Б показаны результаты Вестерн-блоттинга (с использованием антитела к hIGF-1) полипептида дикого типа и 3mut-предшественника, который содержит Eb. На фиг.1В показаны результаты Вестерн-блоттинга (с использованием антитела к hIGF-1) полипептида дикого типа и 3mut-предшественника, который содержит Ее;

на фиг.2А-2Г - линейные графики, демонстрирующие биологическую активность различных полипептидов IGF-1 («лиганды»). Биологическую активность оценивали путем стимуляции миобластов С2С12 полипептидами, экспрессируемыми Cos7-клетками. Затем в стимулированных С2С12-клетках анализировали относительные количества общей АКТ и фосфорилированной АКТ. Long-R3-IGF-1 представляет собой поступающий в продажу реагент (фирма Sigma, продукт №1-1271), который состоит из зрелой человеческой аминокислотой последовательности IGF-1 с мутацией E3R и с добавлением N-концевого состоящего из 13 аминокислот удлиняющего пептида. На фиг.2А показаны данные об активности IGF-1-Ea3mut. На фиг.2Б показаны данные об активности IGF-1-Eb3mut. На фиг.2В приведены данные об активности IGF-1-Eab3mut, представляющего собой несущую 3mut конструкцию, в которой аминокислоты 93-102 Еа встроены между аминокислотами 95 и 96 Eb. На фиг.2Г показаны данные об активности IGF-1-Ec3mut;

на фиг.3А-3Г и 4А-4Г - линейные графики, позволяющий определять сохраняют ли полипептиды-предшественники IGF-1, предлагаемые в изобретении, селективность по отношению к соответствующему рецептору при анализе фосфорилирования рецептора в ответ на связывание с лигандом. На фиг.3А и 3Б представлены результаты оценки селективности к рецептору IGF-1-Ea3mut по сравнению с рецептором IGF-1 (фиг.3А) и инсулиновым рецептором (фиг.3Б). На фиг.3В и 3Г представлены результаты оценки селективности к рецептору IGF-1-Eb3mut по сравнению с рецептором IGF-1 (фиг.3 В) и инсулиновым рецептором (фиг.3Д). На фиг.4А и 4Б представлены результаты оценки селективности к рецептору IGF-1-Ec3mut по сравнению с рецептором IGF-1 (фиг.4А) и инсулиновым рецептором (фиг.4Б). На фиг.4В и 4Г представлены результаты оценки селективности к рецептору IGF-1-Eab3mut по сравнению с рецептором IGF-1 (фиг.4В) и инсулиновым рецептором (фиг.4Д). «IGF1-R3» обозначает описанный выше Long-R3-IGF-1. Полипептид, обозначенный как «IGF1Eab», представляет собой конструкцию, в которой аминокислоты 93-102 Еа встроены между аминокислотами 95 и 96 Eb;

на фиг.5 - результаты Вестерн-блоттинга, демонстрирующие относительное фосфорилирование АКТ после стимуляции мышечных трубочек линии С2С12 (в результате дифференцировки в течение 3-4 дней миоцитов С2С12) различными лигандами. Понятие «мультимеры IGF-1Eb» используют для обозначения конструкции, изображенной схематически на фиг.6А;

на фиг.6А и 6Б - схематические изображения двух полипептидов, предлагаемых в изобретении. На фиг.6А показан полипептид-предшественник IGF-1-Eb с 4 наборами модификаций: делеция G1, P2 и Е3; мутация, приводящая к замене R37 на А; делеция R71 и S72 и делеция последних семи С-концевых аминокислот. Кроме того, полипептид удлинен путем добавления еще двух Eb-пептидов (но без R71 и S72 и без последних семи С-концевых аминокислот) и добавления последнего Eb-пептида (но без R71 и S72) на С-конец полипептида. Эту конструкцию часто обозначают как мультимер IGF-1-Eb. На фиг.6Б показан полипептид-предшественник IGF-1-Eab с 4 наборами модификаций: делеция Gl, P2 и Е3; мутация, приводящая к замене R37 на А; делеция R71 и S72 и инсерция аминокислот 93-102 Еа между аминокислотами 95 и 96 Eb;

на фиг.7А - сравнительный анализ последовательности человеческого IGF-1 (SEQ ID NO:1) и последовательности IGF-1 соответствующего животного. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. G1, P2, Е3 являются консервативными для всех проанализированных видов, кроме стерляди (в последовательности этого вида S2 заменен на P2). R36 и R37 являются консервативными для всех проанализированных видов;

на фиг.7Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого IGF-1 (SEQ ID NO:1). Под филогенетическим деревом изображена шкала, на которой указано количество «аминокислотных замен» на 100 остатков белковых последовательностей. Для расчета величин расстояний используют предназначенную для этой цели формулу Кимура (Kimura), полученную на основе данных о количестве не входящих в брешь ошибочных спариваний и скорректированную с учетом молчащих замен. Полученные с помощью компьютерной обработки величины представляют собой среднее значение различий на сайт и находятся в диапазоне от 0 до 1. Ноль обозначает полную идентичность, а 1 обозначает отсутствие идентичности. На шкале филогенетического дерева эти величины умножены на 100;

на фиг.8А - сравнительный анализ последовательностей человеческого Еа-пептида (SEQ ID NO:2) и Еа-пептидов различных животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. R71 и S72 являются консервативными для всех проанализированных видов;

на фиг.8Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого Еа-пептида IGF-1 (SEQ ID NO:2);

на фиг.9А - сравнительный анализ последовательностей человеческого Eb-пептида (SEQ ID NO:3) и Eb-пептидов различных животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. R71 и S72 являются консервативными для всех проанализированных видов;

на фиг.9Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого Eb-пептида IGF-1 (SEQ ID NO:3);

на фиг.10А - сравнительный анализ последовательностей человеческого Ес-пептида (SEQ ID NO:4) и Ес-пептидов различных животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей, R71 и S72 являются консервативными для всех проанализированных видов;

на фиг.10Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого Ес-пептида IGF-1 (SEQ ID NO:4);

на фиг.11А - сравнительный анализ последовательности человеческого IGF-2 (SEQ ID NO:7) и соответствующих последовательностей IGF-2 различных видов животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. R68 является консервативным для всех проанализированных видов; D69 является консервативным для всех видов, кроме шимпанзе, в последовательности этого вида в этом положении находится остаток гистидина;

на фиг.11Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого IGF-2 (SEQ IDNO:7);

на фиг.12А - сравнительный анализ последовательности человеческого Е-пептида IGF-2 (SEQ ID NO:6) и Е-пептидов IGF-2 различных видов животных. Представлены все проанализированные виды животных и регистрационные номера в GenBank соответствующих им последовательностей. R68 является консервативным для всех проанализированных видов; D69 является консервативным для всех видов, кроме шимпанзе, в последовательности этого вида в этом положении находится остаток гистидина;

на фиг.12Б - график, демонстрирующий филогению проанализированных аминокислотных последовательностей относительно человеческого Е-пептида IGF-2 (SEQ ID NO:6).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к новым полипептидам-предшественникам IGF-1 и IGF-2, которые содержат практически соответствующий им Е-пептид, модифицированный для предупреждения, снижения или аннулирования типичного протеазного расщепления, ответственного за отделение активной формы IGF-1 или IGF-2 от ее Е-пептидов. Возможность применения полипептидов, предлагаемых в изобретении, основана на неожиданно установленном при создании изобретения факте, что такие полипептиды-предшественники обладают биологической активностью, стабильностью и благоприятным действием в качестве фармацевтических средств.

Скрининг полипептидов-предшественников IGF в отношении биологической активности

Возможность применения любого полипептида, предлагаемого в изобретении, можно оценивать с помощью следующих анализов.

Стабильность - Полипептид, предлагаемый в изобретении, должен обладать достаточной стабильностью в присутствии эндогенных протеаз, таких как протеазы, входящие в состав человеческой сыворотки, для того чтобы представлять собой эффективное лекарственное средство. Для оценки стабильности экспрессионным вектором, который кодирует полипептид, можно трансфектировать клетки линии Cos7 (ATCC) в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культуральную среду, содержащую секретируемые полипептиды, можно применять для дополнительных анализов, или в другом варианте экспрссионный вектор может кодировать легко доступные метки, такие как гекса-гистидиновую метку, вместе с полипептидом для облегчения эффективной очистки экспрессируемых полипептидов в культурах Cos7-клеток. Вне зависимости от пути получения образец полипептида инкубируют в сыворотке здорового человека (фирма Sigma) или в ЗФР в течение различных промежутков времени (например, 0, 1, 5, 10 и 16 ч), анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, блоттируют на нитроцеллюлозу и соответствующие белки, визуализируют с помощью первичного антитела к IGF-1 или IGF-2 и вторичного антитела, например, конъюгированного с пероксидазой из хрена. Можно использовать любые многочисленные аналогичные методы блоттинга и обнаружения, в некоторых из которых используются флуоресцентные красители или даже радионуклиды. Интенсивность полосы, соответствующей предшественнику, по сравнению с интенсивностью полосы, соответствующей IGF-1 или IGF-2, должна свидетельствовать о степени расщепления предшественника в различных условиях. Полипептид, предлагаемый в изобретении, обработанный человеческой сывороткой в течение 16 ч при 37°С, может характеризоваться соотношением нерасщепленного предшественника и расщепленного зрелого IGF, составляющим примерно от 1:2 до 1:0,1, например примерно от 1:1 до 1:0,5, в частности соотношением примерно 1:1 или соотношением примерно 1:0,5. Как правило, предшественник должен присутствовать в соотношении, составляющем по меньшей мере 1:1.

Фосфорилирование АКТ - Полипептид, предлагаемый в изобретении, должен сохранять способность передавать сигнал через рецептор IGF-1 (сигналы и IGF-1, и IGF-2 передаются через рецептор IGF-1). Для определения указанной способности осуществлять передачу сигнала можно оценивать фосфорилирование находящейся по ходу передачи сигнала внутриклеточной мишени, т.е. АКТ, в ответ на связывание лиганда на поверхности клетки. Для анализа фосфорилирования АКТ биобласты линии С2С12 выращивают в условиях «голодания» в бессывороточной среде, а затем стимулируют различными лигандами. Клетки лизируют и осветляют центрифугированием. Фосфорилирование АКТ и уровни общей АКТ анализируют с помощью ELISA с использованием набора для двухвалентного (сэндвич) ELISA PathScan phospho АКТ (Ser473) и набора для двухвалентного ELISA PathScan АКТ (фирма Cell Signaling) соответственно.

Специфичность в отношении рецептора IGF-1 - Полипептид, предлагаемый в изобретении, предпочтительно сохраняет специфичность в отношении рецептора IGF-1 и должен связываться с родственным инсулиновым рецептором с низкой аффинностью. Для оценки специфичности в отношении рецептора образцы полипептида добавляют к выращенным в бессывороточной среде NIH3T3-клеткам, сверхэкспрессирующим рецептор IGF-1 или инсулиновый рецептор, и уровни фосфорилирования рецептора IGF-1 или фосфорилирования инсулинового рецептора определяют, лизируя клетки и подвергая лизаты анализу с помощью ELISA с использованием человеческого фосфорилированного IGF-1-рецептора и ELISA-набора для инсулинового рецептора (фирма R&D Systems).

Оценка гипертрофии in vivo на мышиных моделях - Для решения вопроса о том, может ли полипептид, предлагаемый в изобретении, повышать массу скелетных мышц в условиях, которые уже приводят к мышечной гипертрофии, можно подвергать обработанных и необработанных животных физической нагрузке и определять будет ли у обрабатываемых полипептидом животных образовываться больше мышечной массы по сравнению с необработанными животными.

Модели физической нагрузки

Одна из известных в данной области моделей основана на применении вращающегося колеса, движение которого определяется той нагрузкой, которую прикладывает к нему животное без дополнительного принуждения (см., например, Konhilas и др. Am J Physiol Heart Circ Physiol 289, 2005, с.455-465). Находящееся в клетке колесо, которое животное вращает без дополнительного принуждения, позволяет устранять инсульты, связанные с физическим и психологическим состоянием, которые характерны для моделей с принудительной нагрузкой, и поэтому является приемлемой моделью для оценки лекарственных средств-кандидатов, которые можно применять для относительно здоровых особей, для которых повышение мышечной массы является желательным.

Можно применять любую пригодную линию мышей. Например, можно произвольно разделять самцов мышей линии C57B1/6J на экспериментальную (например, получающую полипептид-предшественник IGF) и контрольную группы. Животных помещают по отдельности в клетку с колесом для физических упражнений; ведущих «малоподвижный образ жизни» контрольных животных помещают в идентичные клетки без колеса. Колесо для физических упражнений описано у Allen и др. J Appl Physiol 90, 2001. с.1900-1908. В целом, система состоит их колеса диаметром 11,5 см с поверхностью для пробега шириной 5,0 см (модель 6208, фирма Petsmart, Феникс, шт. Аризона), которая снабжена цифровым магнитным счетчиком (модель ВС 600, фирма Sigma Sport, Олни, шт. Иллинойс), который активируется при вращении колеса. Кроме того, каждое колесо снабжено обеспечивающим сопротивление механизмом, который позволяет регулировать нагрузку. Для этой цели присоединяют леску из нержавеющей стали к верхней части клетки и наматывают проволоку на неподвижный шкив, который закрепляют на находящемся в клетке колесе на оси вращения, так что это не влияет на прилагаемую к колесу нагрузку. Проволоку снова закрепляют в верхней части клетки с помощью пружины и винта. Такая конструкция позволяет осуществлять точную регулировку нагрузки на колесо, которая равномерно распределяется во время вращения колеса. Ежедневно регистрируют продолжительность физической нагрузки и расстояние, которое пробегает каждое животное, находящееся в условиях, позволяющих осуществлять физическую нагрузку, в течение всего периода выдерживания в указанных условиях. Все животные имели свободный доступ к воде и стандартному твердому корму для грызунов. Во всех группах пробег без дополнительного принуждения (нахождение в клетке с колесом) можно начинать с использованием мышей, возраст которых составляет в среднем примерно 12 недель. Каждая группа животных продолжала бегать в условиях различного сопротивления в зависимости от экспериментальной группы в течение 50 дней до достижения животными возраста примерно 19 недель. Нагрузку колеса определяли путем подвешивания на колесо грузов известной массы до тех пор, пока колесо слегка не смещалось. Все группы, находящиеся в условиях физической нагрузки, сначала в течение первой недели имели колесо в клетке без дополнительной нагрузки. Однако условия «без нагрузки» фактически представляли собой нагрузку в 2 г, которую определяли как нагрузку, необходимую для поддержания в колесе силы инерции и трения. Учитывая, что период акклиматизации к колесу составлял 1 неделю, нагрузку колеса можно было изменять с интервалами в одну неделю за исключением более высоких нагрузок, которые можно было изменять через 2 недели. Изменение нагрузок может составлять от 2 г вплоть до 12 г. Находящихся в условиях нагрузки и контрольных ведущих «малоподвижный образ жизни» животных умерщвляли под ингаляционным наркозом путем смещения шеи сразу после окончания конкретного периода нахождения в условиях нагрузки. Определяли вес тела и определенные мышцы быстро вырезали, промывали и замораживали для гистологического или биохимического анализа, которые осуществляли позднее.

Специалистам в данной области известны также альтернативные модели связанной с физической нагрузкой гипертрофии (см., например, модель физической нагрузки с использованием педального вращающегося устройства, которое описано у Lerman и др. J Appl Physiol 92, 2002, с.2245-2255).

Модель, созданная путем инъекции кленбутерола

Кленбутерол представляет собой β₂-адренергический агонист, обладающий усиливающими рост свойствами, который, как установлено, вызывает увеличение мышечной массы. Точный механизм действия кленбутерола пока не известен, хотя предполагается снижение расщепления мышечных белков при его применении. В клинических условиях кленбутерол применяют в качестве противоастматического средства, но им, по-видимому, наиболее широко злоупотребляют в качестве структурообразующего агента (агента для бодибилдинга) для повышения мышечной массы как у людей, так и у шоу-животных.

Пяти мышам вводили ежедневно путем инъекции кленбутерол (3 мг/кг, подкожно (s.c.)) в течение 3, 7 или 14 дней для индукции мышечной гипертрофии. Мыши, которым инъецировали ЗФР, служили в качестве отрицательного контроля. Животных обследовали ежедневно (визуальный осмотр) в отношении любых побочных реакций (т.е. неопрятность шерстяного покрова, сонливость) на обработку. Обработка кленбутеролом потенциально может делать мышей более пугливыми или агрессивными, поэтому за мышами, если они помещены в клетки группами, необходимо особенно тщательно следить с позиций из драк друг с другом. Мыши могли свободно двигаться и могли нормально есть и пить. Мышей обследовали ежедневно до их умерщвления в день 3, 7 или 14 и отбирали ткани для дополнительного анализа.

Оценка на моделях мышечной атрофии in vivo - Способность полипептида-предшественника IGF, предлагаемого в изобретении, поддерживать мышечную массу в условиях, которые обычно приводят к снижению мышечной массы, можно оценивать на различных моделях атрофии скелетных мышц. При использовании примеров моделей, описанных ниже, специалист в данной области легко может создавать и осуществлять контролируемые эксперименты, включающие введение и применение полипептидов-предшественников IGF для решения вопроса о том, могут ли указанные полипептиды приводить к увеличению мышечной массы.

Например, самцов мышей линии С57 В16/2 покупали у фирмы The Jackson Laboratories. В начале каждого эксперимента мыши должны были иметь возраст примерно 9 недель. Как правило, мышей помещали в клетки-микроизоляторы с обычным кормом для грызунов. В начале каждого эксперимента мышей взвешивали. В конце каждого эксперимента мышей обычно умерщвляли ингаляционным наркозом с последующим смещением шеи и мышечные ткани собирали для дополнительной обработки. Мышей взвешивали для определения «конечного веса тела». Скелетные мышцы, которые можно получать, представляли собой переднюю большеберцовую мышцу, длинный разгибатель пальцев стопы, камбаловидную мышцу и икроножную мышцу. Произвольно собирали другие ткани, такие как сердце, печень, селезенка, почки, яички и головной мозг. Все мышцы и ткани полностью иссекали и взвешивали на весах, нижний предел которых составлял 0,0001 г. Затем ткани быстро замораживали в жидком азоте для последующей экстракции РНК и белков или быстро замораживали погружением в ОСТ (орто-хлортолуол) на корковом диске. Мышцы, замороженные на корковом диске для последующего получения криосрезов, погружали в изопентан, охлажденный с помощью жидкого азота до образования густой суспензии. Все образцы хранили при -80°С.

Обработка дексаметазоном

Фармакологический метод индукции мышечной кахексии у мышей предусматривает ежедневную внутрибрюшинную инъекцию дексаметазоном в дозе 20 мг/кг. Дексаметазон является синтетическим представителем класса глюкокортикоидных гормонов. Он обладает противовоспалительной и иммуносупрессорной активностью, превышающей по активности гидрокортизон примерно в 40 раз. Дексаметазон применяют для лечения воспаления и аутоиммунных состояний, например ревматоидного артрита. Его дают также страдающим раком пациентам, подвергающимся химиотерапии, для снижения некоторых побочных действий противоопухолевого лечения. Дексаметазон вызывает мышечную атрофию как у мышей, так и у людей.

Мышам инъецировали внутрибрюшинно (ip) дексаметазон в течение 3, 7 или 14 дней. В день окончания опыта животных умерщвляли с помощью CO₂ и выделяли мышцы лап. Животных обследовали ежедневно (визуальный осмотр) в отношении любых побочных реакций (т.е. неопрятность шерстяного покрова, сонливость) на обработку. Мыши, как правило, были подвижными и могли нормально есть и пить. Для создания отрицательного контроля мышам инъецировали ЗФР.

Иммобилизация с помощью повязки

Физическое неупотребление различных групп мышц приводит к атрофии этих мышц. Доказано, что фиксация голеностопного сустава («закрепленная пятка» или наложение повязки) является очень эффективным и позволяющим получать воспроизводимые результаты средством индукции физической иммобилизации мускулатуры задних конечностей крыс и мышей.

Для иммобилизации мышей анестезировали изофлуораном. Голеностопный и коленный сустав фиксировали под углом 90° путем наложения повязки из легкого перевязочного материала (VET-LITE) вокруг суставов. Материал замачивали в теплой воде и затем оборачивали конечность, оставляя свободными суставы пальцев стопы и тазобедренный сустав. Суставы поддерживали в положении под углом 90° до высыхания перевязочного материала. Контралатеральные конечности служили в качестве контроля. Мышам давали отойти от наркоза и помещали в обычные клетки-микроизоляторы. Как установлено, перевязка не приводила к повышенному стрессу и животные свободно передвигались в клетке к корму и питью. Однако мышей ежедневно обследовали в отношении побочных действий, которые могут влиять на вес тела, активность и возбудимость.

После наложения на мышей повязки животных ежедневно обследовали для получения гарантий того, что повязка сохраняется на месте, поскольку мыши могут ее изжевывать. Животные могли двигаться, пить и есть после отхода от наркоза, и они не нуждались в специальном ложе, клетках или другой помощи.

Денервация

Как правило, мышей для осуществления денервации анестезировали с помощью газа изофлуорана. С помощью асептических хирургических процедур (три промывки бетадином и конечная промывка этанолом) обнажали правый седалищный нерв в середине бедра и вырезали кусок размером 2-5 мм. Контралатеральная конечность служила в качестве контроля.

Более конкретно, разрез на коже закрывали с помощью кожного зажима и животным инъецировали одну дозу бупренорфина перед тем, как дать им отойти от наркоза. Через 3, 7 или 14 дней после операции животных умерщвляли ингаляционным наркозом с последующим смещением шеи и мышцы (комплекс икроножных мышц, переднюю большеберцовую мышцу, длинный разгибатель пальцев стопы, камбаловидную мышцу) выделяли для гистологических и биохимических анализов.

Поскольку седалищный нерв был рассечен, то соответствующая иннервируемая им конечность становилась неподвижной, индуцируя атрофию скелетных мышц. Несмотря на это, животные могли двигаться, пить и есть после отхода от наркоза, и они не нуждались в специальном ложе, клетках или другой помощи.

Тем не менее, животных обследовали сразу после операции и их отхода от наркоза (1-2 ч). Кроме того, области разреза и общее состояние здоровья животных оценивали в течение 3 дней после операции. Кожный зажим удаляли через 7-10 дней после операции.

Генетические модели

В качестве моделей мышечной атрофии можно использовать также генетически измененных трансгенных мышей. Например, так называемые мини-мыши (Mini Mice) (фирма The Jackson Laboratory, линия №003258) содержат выключающую мутацию («knock out»-мутацию) в гене IGF-1, которая приводит к аномально пониженному постнатальному росту, а также низкому весу тела и росту. Дополнительную информацию можно почерпнуть у Powetl-Braxton и др. Genes Dev 7, 1993, сс.2609-2617. Кроме того, так называемые миди-мыши (Midi Mice) (фирма The Jackson Laboratory, линия №003259) содержат другую мутацию в гене, которая приводит к получению гипоморфного гена, обусловливающего низкий вес взрослых особей и другие сердечно-сосудистые фенотипы. Дополнительную информацию можно почерпнуть у Lembo и др. J Clin Invest 98, 1996, с.2648-2655.

Имеющие решающее значение и необязательные мутации или модификации предшественников IGF

Имеющие решающее значение мутации - Настоящее изобретение основано, в частности, на полученных данных о том, что полипептид-предшественник IGF, который содержит практически соответствующий ему Е-пептид, сохраняет биологическую активность и стабильность в присутствии сыворотки. Для гарантии того, что Е-пептид не отщепляется эндогенными протеазами, мишенью которых является двухосновный протеазный сайт, обычно любую из двух N-концевых двухосновных аминокислот Е-пептида в предшественнике удаляют путем делеции, изменяют путем мутации или маскируют иным образом. В случае MGF-1 эти две аминокислоты представляют собой R71 и S72, а в случае MGF-2 эти первые две аминокислоты представляют собой R68 и D69.

Указанное расщепление могут предупреждать различные модификации:

(1) делеция одного или обоих двухосновных остатков,

(2) мутация одного или обоих двухосновных остатков, приводящая к зам