Средство для антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной терапии

Средство для антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной терапии

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к средствам для профилактики и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Одной из причин смертности у больных с различными сердечнососудистыми патологиями и острыми нарушениями мозгового кровообращения (ОНМК) являются тромботические осложнения. Важнейшими участниками развития подобных осложнений являются тромбоциты, активация которых играет ключевую роль в запуске механизмов тромбообразования. Известно, что тромбоциты в условиях патологии приобретают способность спонтанно агрегировать и образовывать агрегаты малого размера, которые могут циркулировать в крови больных и являться центрами, на базе которых в участках повреждения эндотелия формируются тромбы. Образование подобных агрегатов зависит от целого ряда причин, важнейшими из которых являются воспаление и инициация образования тромбина, что ведет к повышению экспрессии клетками сердечно-сосудистой, иммунной и нервной систем рецепторов тромбина и других протеиназ, называемых рецепторами, активируемыми протеиназами (ПАР).

Известны четыре подтипа ПАР: ПАР-1, ПАР-2, ПАР-3 и ПАР-4. Согласно последним данным, блокада антагонистами ПАР функций этих рецепторов ингибирует активацию тромбоцитов, вызванную тромбином, и блокирует процессы воспаления и гибели клеток (апоптоз), в том числе нейронов. У человека опосредованная тромбином активация тромбоцитов происходит через ПАР-1 и ПАР-4, поэтому поиск и отбор антагонистов ПАР направлены на разработку препаратов, способных ингибировать именно эти рецепторы. Наиболее важен ПАР-1 - основной рецептор тромбина, опосредующий события, связанные с воспалением и активацией свертывания крови. Специфичность связывания ПАР-1 с тромбином почти на 2 порядка выше, чем у ПАР-3 и ПАР-4, поэтому ПАР-4 человека активируется тромбином в более высоких концентрациях, чем ПАР-1.

Воспаление и инициация образования тромбина является одной из причин развития атерогенеза и его осложнений - атеротромбоза, ОНМК (инсульта) и др. Следует отметить, что использование известных медикаментов аспирина, его комбинации с клопидогрелем или комбинации аспирина с дипиридамолом - для снижения тромбообразования и исключения повторных инсультов у больных с ишемическими инсультами артериального происхождения приводит к побочным эффектам (кровотечениям и расстройству системы пищеварения).

Разработка новых высокоэффективных средств антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной терапии в настоящее время является весьма актуальной.

В международной заявке WO/2004/098628, C07K 5/09 предлагается для подавления активации процесса агрегации тромбоцитов использовать синтетические аналоги пептида Arg-Pro-Pro-Gly-Phe, которые содержат одну или несколько аминокислотных замен. Недостатком предлагаемых пептидных аналогов является то, что они являются прямыми ингибиторами молекулы тромбина. Они блокируют протеолитическое расщепление тромбином всех его субстратов (в том числе амидных и белковых) и таким образом, замедляя агрегацию тромбоцитов, одновременно значительно удлиняют время свертывания крови, что является отрицательным побочным действием.

В работах [Andrade-Gordon Р. а. о. PNAS. 1999; v.96(22): р.12257-12262 и Дериан С.К и др. Биохимия 2002, т.67, с.66-76] был синтезирован и испытан в качестве антогониста ПАР-1 пептидомиметик RWJ-56110 следующей структуры:

RWJ-56110 - [(S)-N-[(1S)-3-амино-1-[[(фенилметил)амино)карбонил]-[[[[1-(2,6-дихлорфенил)метил]-3-(1-пирролидинилметил)-1Н-индол-6-ил]амино]карбонил]амино]-3,4-дифторбензолпропанамид.

Однако RWJ-56110 ингибирует агрегацию, вызванную только очень низкими концентрациями тромбина, а при их повышении оказывается несостоятельным, что ограничивает возможность его применения. Кроме того, синтез подобных соединений достаточно сложен.

В работе [Morley D. а.о. Pharm. Rev. 2002, v.54: p.203] был синтезирован пептид 3-меркаптопропионил-Phe-Cha-Cha-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NH₂, который проявляет активность как ингибитор ПАР-1. Как видно из приведенной структуры, последовательность этого пептида содержит два остатка β-циклогексилаланина (Cha). Следует отметить, что производное этой аминокислоты является дорогостоящим: стоимость необходимого для синтеза производного этой аминокислоты в 18 раз выше стоимости аналогичных производных природных бифункциональных аминокислот. Таким образом недостатком пептида является его дороговизна и низкая доступность.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного средства антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной терапии в виде пептида антагониста ПАР-1, отличающегося более низкой стоимостью и доступностью по сравнению с известными аналогами.

Поставленная цель была решена синтезом пептида следующей структуры: S-меркаптопропионил-Phe-Ile-Ile-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NHz (иПАР-1-I).

Неожиданно оказалось, что включение в структуру пептида вместо двух остатков β-циклогексилаланина, остатков изолейцина позволяет получить соединение, обладающее антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной активностью и в то же время значительно более дешевое, чем пептид-аналог. Испытания иПАР-1-I ex vivo показали, что использование иПАР-1-I позволяет в 3 раза снизить степень спонтанной агрегации тромбоцитов (СПА) больных ишемической болезнью сердца (ИБС). иПАР-1-I обладает также антивоспалительной и цитопротекторной активностью.

Нижеприведенные примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.

Пример 1.

Получение пептида 3-меркаптопропионил-Phe-Ile-Ile-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NH₂ (иПАР1-I).

Для твердофазного синтеза пептида (ТФС) использовали производные аминокислот L-ряда. Пептид синтезировали с использованием Fmoc-методологии, то есть в сочетании с N^α-Fmoc-защитой для блокирования боковых цепей аминокислот применяли кислотолабильные защитные группы: Воc - для ε-аминогруппы лизина, Bu^t-β-карбоксильной функции аспарагиновой кислоты, Trt - для карбоксамидной функции аспарагина и SH-группы меркаптопропионовой кислоты, а также Pmc - для гуанидиновой функции аргинина. Синтез проводили на нерастворимом полимерном носителе - сополимере стирола с 1% дивинилбензола с якорной группой, предназначенной для получения амидов пептидов - полимере Ринка с содержанием аминогрупп 0,64 ммоль/г. Синтез пептида проводили исходя из 0,2 г (0,125 ммоль) полимера, начиная с С-конца и наращивая пептидную цепь по одной аминокислоте. Для отщепления N^α-Fmoc-защиты использовали 25% раствор 4-метилпиперидина, для создания амидной связи применяли TBTU/HOBt в присутствии диизопропилэтиламина. Для контроля полноты реакций в процессе ТФС применяли тест Кайзера. По окончании ТФС целевой продукт отщепляли от полимера с одновременным удалением всех защитных групп боковых цепей аминокислот действием трифторуксусной кислоты. Полученный «сырой» пептид иПАР1-1 был очищен с помощью препаративной ВЭЖХ. Пептид охарактеризован данными спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии. В масс-спектре этого вещества присутствовал молекулярный ион, соответствующий корректной молекулярной массе целевого продукта (М=1217,53). Спектр ¹H-ЯМР подтверждает структуру синтезированного пептида.

Пример 2.

Испытание антиагрегатного действия пептида иПАР1-I.

Испытание полученного пептида проводили с использованием крови больных ишемической болезнью сердца ИБС, верифицированной с помощью коронарографии. Кровь больных ИБС получали самотеком из кубитальной вены в пробирку с 0,13 М раствором цитрата натрия (рН 7,3). Через 15 мин после отбора и транспортировки при комнатной температуре кровь центрифугировали для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Оценка агрегационной способности тромбоцитов в ОТП проводилась на лазерном агрегометре НПФ «Биола» (Россия), позволяющем оценивать спонтанное образование агрегатов (что соответствует кривым по показаниям среднего размера агрегатов, выражаемого в относительных единицах), и образование агрегатов в ответ на высокие концентрации индукторов (кривые, регистрирующие процесс светопропускания, выраженный в %). Обогащенную тромбоцитами плазму до записи процесса агрегации инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре с соответствующими иПАР. В качестве селективного агониста ПАР-1 (для запуска механизма спонтанной агрегации) использовали пептид-агонист ПАР-1 - SFLLRN.

Исследование антиагрегатного действия иПАР - 1-I показали, что иПАР - 1-I снижает спонтанную агрегацию тромбоцитов больного ИБС с высокими цифрами этого показателя почти до нормальных значений. Спонтанная агрегация тромбоцитов снижалась в 3 раза.

Пример 3.

Испытание антивоспалительного действия пептида иПАР1-I.

Среди клеток, участвующих в воспалительных ответах организма, важная роль принадлежит тучным клеткам. Тучные клетки экспрессируют множество рецепторов, в том числе рецепторы семейства ПАР. Наличие на тучных клетках рецепторов ПАР отвечает за их реактивность в отношении тромбина. Активированные тучные клетки освобождают широкий спектр провоспалительных медиаторов, в том числе гистамин. Методика оценки антивоспалительного действия иПАР1-I была основана на измерении секреции тучными клетками гистамина в присутствии иПАР-1-I.

Тучные клетки брали у белых самцов беспородных крыс весом 250-350 г. Острое воспаление у крыс вызывали внутрибрюшинным введением тиогликолата Na. Тучные клетки отделяли центрифугированием перитонеальной жидкости, суспендировали в HEPES-NaCl и очищали в градиенте фиколла. Гистамин, выделяемый тучными клетками, определяли с помощью его конденсации с ортофталевым альдегидом, в результате чего образуется флуоресцирующий комплекс. Флуоресценцию измеряли на плашечном спектрофлуориметре Thermo Fluoroscan Ascent при 460 нм, возбуждая при 355 нм.

Исследование антивоспалительного действия иПАР1-I, соответственно ингибирования им секреции тучными клетками гистамина, показало, что иПАР1-I способен ингибировать воспаление, значительно снижая секрецию гистамина.

Пример 4.

Испытание цитопротекторного действия пептида иПАР1-I.

Исследования проводили на первичных культурах нейронов гиппокампа (9-10 дней) мозга одно-трехдневных крысят линии Вистар. Полученную суспензию клеток переносили на покровные стекла, покрытые поли-D-лизином. Затем удаляли неприкрепившиеся клетки и добавляли культуральную среду. На 3-4 день добавляли арабинозид на сутки для подавления роста глиальных клеток. Клетки оставляли в течение 7-10 дней в инкубаторе. Смену 1/3 среды в клетках осуществляли каждые 3 дня. Полученная культура содержала не более 5% глиальных клеток.

Гибель/выживаемость нейронов в культуре определяли через 24 часа после 45-минутного действия тромбина или после совместной инкубации иПАР1-I с тромбином. Пептидом иПАР1-I (в концентрациях от 0,4 до 100 нМ/л) обрабатывали нейроны за 10 мин до добавления тромбина. В качестве контроля нейроны обрабатывали HEPES-солевым буфером (HBSS). Гибель/выживаемость нейронов оценивали биохимическим МТТ (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) методом. Водный раствор МТТ добавляли в культуральную среду до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировали клетки 1,5 часа при 37°С. Затем среду отбирали и добавляли DMSO для растворения формазанов. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически (590 нм) на универсальном микропланшетном спектрофотометре Anthos Lucy-1. Оценивали результаты в процентах по отношению к контролю.

Было обнаружено, что тромбин в концентрации 100 нМ/л вызывал гибель более 20% нейронов (снижение выживаемости по отношению к контролю). Прединкубация клеток с иПАР1-I до добавления тромбина защищала их практически полностью от нейротоксического действия тромбина (уровень живых клеток по сравнению с контрольными значениями составлял 98%).

Таким образом синтезированный пептид обладает антиагрегатным, антивоспалительным и цитопротекторным действием при большей доступности по сравнению с ближайшим аналогом.

Пептид 3-меркаптопропионил-Phe-Ile-Ile-Arg-Lys-Pro-Asp-Lys-NH₂ в качестве средства антиагрегатной, антивоспалительной и цитопротекторной терапии.