Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры

Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Вирус везикулярного стоматита (BBC), представляющий собой член семейства рабдовирусов, содержит несегментированный, одноцепочечный геном антисмысловой РНК (- РНК). Его геном размером 11 т.н. (11 тысяч нуклеотидов) включает пять генов, которые кодируют пять структурных белков вируса: нуклеокапсидный белок (N), который требуется в стехиометрических отношениях для инкапсулирования реплицированной РНК; фосфопротеин (Р), являющийся кофактором РНК-зависимой РНК-полимеразы (L); матричный белок (М) и гликопротеин прикрепления (G) (см., например: Gallione et al., 1981, J. Virol., 39:529-535; Rose and Gallione, 1981, J. Virol., 39:519-528; патент США No. 6033886; патент США No. 6168943).

В общем случае BBC не считается патогеном человека и поэтому естественный иммунитет к BBC у людей встречается крайне редко. Таким образом, разработка векторов на основе BBC оказалась целевым направлением в таких областях, как создание иммуногенных композиций (например, вакцин) и доставка генов, кодирующих терапевтические белки. Например, исследования показали, что BBC может служить эффективным вектором для экспрессии белка гемагглютинина вируса гриппа (Roberts et al., 1999 J. Virol., 73:3723-3732), белка Н вируса кори (Schlereth et al., 2000 J. Virol., 74:4652-4657) и белков env и gag ВИЧ-1 (Rose et al., 2001 Cell, 106(5):539-49). Другие характеристики BBC, которые обеспечивают его привлекательность как вектора, включают: (а) способность к эффективной репликации в клеточной культуре; (b) неспособность как интегрироваться в ДНК клетки-хозяина, так и участвовать в генетической рекомбинации; (с) существование нескольких серотипов, что позволяет применять стратегии иммунизации типа прайм-буст; (d) возможность вводить в геном BBC интересующие чужеродные гены, экспрессия которых будет эффективно происходить за счет вирусной транскриптазы; и (е) разработка специализированной системы получения инфекционного вируса из комплементарной ДНК, соответствующей вирусному геному (см., например: патент США No.6033886; патент США No.6168943).

Приготовление иммуногенных композиций на основе BBC вектора обычно включает заражение подходящей клеточной культуры (хозяина) рекомбинантным BBC, культивирование BBC на клеточной культуре, сбор жидкости клеточной культуры в подходящий момент и выделение (очистку) BBC из культуральной жидкости. Использование векторов на основе BBC и содержащих их иммуногенных композиций в клинических целях требует образцов BBC (или доз) подходящей чистоты, которая соответствует требованиям безопасности различных органов надзора за безопасностью лекарственных средств во всем мире (например, Управления по контролю за продуктами и лекарствами (США), Европейского агентства лекарственных средств, Канадского агентства по надзору за лекарственными продуктами и продуктами питания и т.д.).

Однако отделение BBC от загрязняющих веществ, происходящих от клеточной культуры (например, загрязняющих белков и ДНК клеточной культуры), и получение BBC подходящей чистоты и с требуемым выходом при помощи имеющихся в настоящее время способов очистки BBC (например, очисткой центрифугированием в градиенте плотности сахарозы) обычно вызывает затруднения. Например, применение доступных в настоящее время способов очистки обычно приводит к обратному отношению между чистотой и количеством (процентным выходом) получаемых образцов BBC, что усложняет получение достаточных количеств очищенного BBC. Кроме того, при использовании современных процессов с применением биореакторов, увеличение концентраций клеток и увеличение продолжительности культивирования приводит к более высоким титрам BBC с одновременным увеличением концентраций загрязняющих клеточных осколков и органических составляющих в жидкости биореактора, что еще более затрудняет очистку BBC.

С 1964 года стандартным способом очистки вирусов (включая очистку BBC) является ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы (Yamada et al., 2003 BioTechniques, 34(5): 1074-1078, 1080; Brown et al., 1967 J. Immun, 99(1):171-7; Robinson et al., 1965 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 54(1):137-44; Nishimura et al., 1964 Japan. J. Med. Sci. Biol., 17(6): 295-305). Тем не менее, по мере увеличения концентрации вируса, увеличивается концентрация загрязняющих остатков клеток и, кроме того, также появляются ДНК и белки клеток-хозяев, удаление которых при более высоких их концентрациях с использованием ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы достаточно затруднительно. Кроме того, адаптация способа ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы для крупномасштабного применения обходится недешево. При высоких концентрациях загрязняющих веществ концентрирование и очистка BBC способом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) (McSharry et al., 1970 Virol., 40(3):745-6) создает аналогичные проблемы.

Вирус относительно высокого качества был получен при помощи гель-хроматографии (Transfiguracion et al., 2003 Human Gene Ther., 4(12):1139-1153; Vellekamp, et al., 2001 Human Gene Ther., 12(15): 1923-36; Rabotti et al., 1971; Comptes Rendus des Seances de I'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles, 272(2):343-6; Jacoli et al., 1968 Biochim. Biophys. Acta, GenI Subj., 165(2):99-302). Тем не менее себестоимость этого способа и трудности при его осуществлении делают его непригодным для крупномасштабного получения вирусов. Для очистки вирусов иногда применяют аффинную хроматографию, например, с гепарином (Zolotukhin et al., 1999 Gene Ther., 6(6):973-985), лектином (Kaarsnaes et al., 1983 J. Chromatog., 266:643-9; Kristiansen et al., 1976 Prot. Biol. Fluids, 23:663-5) и Matrex(Cellufine(сульфатом (Downing et al., 1992 J. Virol. Meth., 38(2):215-228). Гепарин и пектин не являются предпочтительными лигандами (или не используются) при получении цГМФ-вирусов (cGMP-viruses) из-за возможных проблем с их вымыванием, из-за которых перед выпуском продукта обычно следует проводить дополнительные испытания.

Очистка способом аффинной хроматографии с использованием Matrex(Cellufine(сульфата не является однозначным решением и требует учета эффективности очистки вируса, качества вируса и регенерации колонки. Для очистки BBC нужны очень большие колонки, предназначенные для проведения аффинной хроматографии (например, 0,2 л Matrex(Cellufine(сульфатной смолы на 1 литр клеточной культуры; неопубликованные результаты Wyeth Vaccine). Низкий выход вируса был получен при очистке, как только способом ионообменной хроматографии, так и при ее сочетании с другими типами хроматографической очистки, применяемыми для очистки вирусов (Международная заявка на патент No. WO 2006/011580; Specht et al., 2004 Biotech. Bioeng., 88(4):465-173; Yamada et al., 2003, cited above; Vellekamp et al., 2001 cited above; Zolotukhin et al., 1999, указанные выше; (Международная заявка на патент No. WO 1997/06243; Kaarsnaes et al., 1983, указанные выше).

Таким образом, в данной области техники имеется настоятельная необходимость разработки способов очистки, при помощи которых можно получать BBC необходимой чистоты с необходимой степенью извлечения (выходом).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы и композиции, рассматриваемые в настоящем описании, в целом относятся к области вирусологии, микробиологии, иммунологии и технологических разработок. В частности, описаны новые способы очистки, предназначенные для получения вируса везикулярного стоматита (BBC) повышенной степени чистоты и с высоким выходом.

В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки BBC из жидкости клеточной культуры, полученной из культуры клеток млекопитающего, зараженных BBC, включающему следующие стадии: (а) первичное осветление, (b) вторичное осветление, (с) адсорбцию на анионообменной мембране, (d) проточную фильтрацию вдоль направления потока и (е) фильтрацию. В одном примере реализации стадия (а) включает осветление жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования с получением BBC в надосадочной жидкости. В еще одном примере реализации стадия (b) включает фильтрование полученной после центрифугирования надосадочной жидкости через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, с получением BBC в отфильтрованном растворе. В другом примере реализации стадия (с) включает загрузку отфильтрованного раствора, содержащего BBC, на анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором, элюирование BBC из анионообменного мембранного адсорбера вторым буферным солевым раствором и сбор элюированных фракций, содержащих BBC. В еще одном примере реализации стадия (d) включает очистку выделенного BBC посредством проточной фильтрации вдоль направления потока (ПФ, tangential flow filtration (TFF)) с использованием мембраны из полого волокна, предел пропускания по молекулярной массе которого составляет от 300 килодальтон до 1000 килодальтон (кДа), и получение BBC в концентрате. В одном примере реализации стадия (е) включает фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе.

В некоторых примерах реализации клетки культуры клеток млекопитающего выбирают из эмбриональных клеток почки человека (human embryonic kidney (HEK)), клеток HEK 293, клеток яичников Китайского хомячка (Chinese hamster ovary (CHO)), клеток почки новорожденных хомячков (baby hamster kidney (BHK)) и клеток почки Африканской зеленой мартышки (African green monkey kidney (AGMK)), также известных под названием клеток Vero.

В некоторых примерах реализации операцию низкоскоростного центрифугирования в указанном способе очистки проводят при ускорении от 4400×g до 8000×g. В одном из конкретных примеров реализации операцию низкоскоростного центрифугирования проводят при ускорении 6238×g.

В другом примере реализации фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм представляет собой фильтровальное устройство Millipore Millex®-GV, фильтровальное устройство Millipore Millex®-GP, фильтровальное устройство Pall Supor®, фильтровальное устройство Sartorius Sartobran^TM или фильтровальное устройство Sartorius Sartopore^TM 2. В одном из конкретных примеров реализации фильтр представляет собой фильтровальное устройство Sartorius Sartobran^TM с отверстиями размером 0,2 мкм.

В других примерах реализации анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartorius Sartobind^TM Q или мембранный адсорбер Pall Mustang^TM Q. В одном из конкретных примеров реализации анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Pall Mustang^TM Q.

В некоторых других примерах реализации соль в первом буферном солевом растворе, используемом на стадии (с), представляет собой NaCl или KCl. В другом примере реализации ионная сила NaCl или KCl составляет от 0,1 М до 0,4 М. В одном из конкретных примеров реализации соль представляет собой NaCl, и ионная сила NaCl составляет 0,3 М.

В другом примере реализации соль во втором буферном солевом растворе, используемом на стадии (с), представляет собой NaCl или KCl. В одном из конкретных примеров реализации соль во втором буферном солевом растворе представляет собой NaCl. В одном из конкретных примеров реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет от 0,5 М до 0,75 М.

В другом конкретном примере реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,6 М. В некоторых других примерах реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,75 М. В некоторых других примерах реализации скорость расхода второго буферного солевого раствора при элюировании составляет от 10 объемов капсулы в минуту (ОК/минуту) до 30 ОК/минуту. В других примерах реализации расход при элюировании составляет 20 ОК/минуту.

В некоторых других примерах реализации ионную силу NaCl во втором буферном солевом растворе линейно увеличивают от 0,001 М до 0,75 М при скорости расхода при элюировании, составляющей от 10 ОК/минуту до 30 ОК/минуту. В одном из конкретных примеров реализации линейный градиент скорости расхода при элюировании составляет 20 ОК/минуту.

В некоторых других примерах реализации pKa первого и второго буферных растворов, применяемых на стадии (с), составляет от 6,0 до 8,5. В некоторых других примерах реализации pH первого буферного солевого раствора, применяемого на стадии (с), составляет от 6,5 до 8,0. В одном из конкретных примеров реализации pH первого буферного солевого раствора, применяемого на стадии (с), составляет 7,5. В других примерах реализации, pH второго буферного солевого раствора, применяемого на стадии (с), составляет от 6,5 до 8,0. В одном из конкретных примеров реализации, pH второго буферного солевого раствора равно 7,5.

В некоторых примерах реализации первый и второй буферные растворы, применяемые на стадии (с), представляют собой фосфатные буферы, буферы, на основе N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) или трис(гидроксиметил)аминометана (TRIS). В другом примере реализации указанные первый и второй буферные солевые растворы, применяемые на стадии (с), также содержат сахарозу в концентрации от 1,5% до 5%. В одном из конкретных примеров реализации концентрация сахарозы составляет 2%.

В других примерах реализации предел пропускания по молекулярной массе материала мембраны при ПФ составляет 300 кДа. В некоторых других примерах реализации, предел пропускания по молекулярной массе материала мембраны при ПФ составляет 750 кДа. В некоторых других примерах реализации, предел пропускания по молекулярной массе материала мембраны при ПФ составляет по меньшей мере 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 850, 900, 950 или 1000 кДа. В одном из конкретных примеров реализации мембрана ПФ представляет собой мембранный модуль из полого волокна. В другом примере реализации ПФ включает концентрирование BBC, полученного на стадии (с), по меньшей мере в 5 раз, с последующим проведением по меньшей мере однократной замены буфера. В еще одном примере реализации ПФ включает концентрирование BBC, полученного на стадии (с), проводимое по меньшей мере 5 раз, с последующим проведением по меньшей мере пяти операций замены буфера. В одном из конкретных примеров реализации буферный раствор, применяемый для замены буфера, представляет собой фосфатный буфер, буфер, содержащий HEPES, или буфер, содержащий TRIS, причем концентрация указанного буфера составляет от 5 мМ до 15 мМ, а pH составляет 7,2 до 7,5. В другом примере реализации буфер, применяемый для замены буфера, также содержит от 0,10 М до 0,20 М NaCl и от 3,5% до 4,5% сахарозы.

В других примерах реализации стадии очистки (а)-(е) осуществляют при комнатной температуре; при этом комнатную температуру определяют как значение или значения температуры, составляющее или находящиеся в диапазоне от приблизительно 15°С до приблизительно 25°С. В одном из конкретных примеров реализации стадии очистки (а)-(е) осуществляют при 20°С.

В еще одном примере реализации осветление культуральной жидкости клеточной культуры, проводимое на стадии (а), осуществляют при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, и из стадии (а) исключают проведение операцию низкоскоростного центрифугирования. В конкретных примерах реализации модуль объемного фильтрования представляет собой модуль Whatman^® Polycap^TM HD, модуль Sartorius Sartoclear™ P или модуль Millipore® Millistak+®HC.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, из культуры клеток млекопитающего получают BBC повышенной степени чистоты. В некоторых примерах реализации очищенный BBC по меньшей мере на 90,0% освобожден от загрязняющих его белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В других примерах реализации, очищенный BBC по меньшей мере на 99,0% освобожден от загрязняющих его белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В одном из конкретных примеров реализации очищенный BBC по меньшей мере на 99,8% освобожден от загрязняющих его белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры.

В соответствии с некоторыми другими примерами реализации получают BBC повышенной степени чистоты, который очищают и выделяют в соответствии с новыми способами очистки, раскрытыми в настоящем описании. В некоторых примерах реализации, очищенный BBC имеет одну или несколько из перечисленных ниже характеристик: выбранный серотип или сочетание серотипов BBC; геномную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну мутацию или по меньшей мере две мутации, которые ослабляют патогенные свойства BBC, геномную последовательность, которая содержит последовательность, содержащую открытую рамку считывания (ОРС) чужеродной полинуклеотидной последовательности, кодирующую один или несколько различных белков (терапевтических или иммуногенных), более подробно раскрытую в подробном описании настоящего изобретения.

Другие особенности или преимущества рассматриваемых в настоящем описании композиций и способов более подробно изложены в нижеследующем подробном описании и более очевидны при рассмотрении предпочтительных примеров реализации и Формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1 изображена блок-схема способа очистки (обведенная черными рамками), применяемого для получения BBC повышенной чистоты из культуральной жидкости культуры клеток млекопитающего.

На Фиг.2А изображен гель-электрофорез, показывающий разделение белков BBC при помощи окрашивания серебром, после очистки на мембранном адсорбере Mustang™ Q в присутствии 2% сахарозы, добавленной в буфер для элюирования (10 мМ фосфата натрия, 1,0 М NaCl). Дорожки 1-10 представляют собой следующее: (1) перед центрифугированием (клеточная культура), (2) загрузка, (3) элюирование и промывка, (4) 5%-ный буфер В (фракции 1-5), (5) 60%-ный буфер В (фракции 6-7), (6) 60%-ный буфер В (фракции 8-10), (7) 60%-ный буфер В (фракции 11-25), (8) 100%-ный буфер В (фракции 26-35), (9) регенерация колонки и (10) проведение стандартизации Bio-Rad® Precision Plus Protein™. Скорость потока для модуля Mustang™ Q составлял 3,5 мл/минуту с линейным градиентом элюирования. Анализ SDS-PAGE проводили при помощи 4-20%-ного Трис-глицинового геля; детектирование белков проводили при помощи окрашивания серебром.

На Фиг.2В изображен гель-электрофорез, показывающий разделение белков BBC при помощи вестерн-блоттинга (Western blot), в соответствии с описанием Фиг.2А. Вестерн-блоттинг проводили с использованием анти-BBC политональных антител.

На Фиг.3А изображен электрофорез на геле, показывающий разделение белков BBC при помощи окрашивания серебром и вестерн-блоттинга после очистки на мембранном адсорбере Mustang™ Q без добавления сахарозы в буфер для элюирования (10 мМ фосфата натрия, 1,0 М NaCl). Дорожки 1-9 представляют собой следующее: (1) загрузка, (2) элюирование и промывка, (3) 5%-ный буфер В (фракции 1-5), (4) 60%-ный буфер В (фракции 6-11), (5) 60%-ный буфер В (фракции 12-25), (6) 100%-ный буфер В (фракции 26-35), (7) проведение стандартизации Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (8) проведение стандартизации BBC (т.е. BBC, очищенного способом с градиентом плотности сахарозы) и (9) получение объединенной среды после регенерации колонки. Скорость потока для модуля Mustang™ Q составлял 3,5 мл/минуту при ступенчатом градиенте элюирования. Анализ SDS-PAGE проводили при помощи 4-20%-ного геля с Трис-глициновым буфером; детектирование белков проводили при помощи окрашивания серебром.

На Фиг.3В изображен гель-электрофорез, показывающий разделение белков BBC при помощи вестерн-блоттинга после очистки, описанной для Фиг.3А. Вестерн-блоттинг проводили с использованием анти-BBC поликлональных антител. Буфер В (также называемый «буфером для элюирования») содержал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0) и 1 М NaCl.

На Фиг.4А представлен SDS-PAGE анализ (4-20%-ный гель с Трис-глициновым буфером) BBC, проводимый при помощи окрашивания серебром + коллоидного окрашивания (colloidal staining) на каждой стадии способа очистки, показанного на Фиг.1. Дорожки 1-12 представляют собой следующее: (1) перед центрифугированием, (2) после центрифугирования (1° осветления), (3) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр, (4) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (2° осветления), (5) объединенная среда после прохождения и промывки мембранного адсорбера Mustang™ Q, (6) объединенные фракции после элюирования BBC в мембранном адсорбере Mustang™ Q, (7) концентрат BBC, полученный после ПФ ультрафильтрации/диафильтрации, (8) объединенная среда после концентрирования и диафильтрации, (9) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр (конечным), (10) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (конечного) (общий концентрат очищенного BBC), (11) стандартизации проведение Bio-Rad® Precision Plus Protein™ и (12) контроль BBC (серия #3, очищенный общий концентрат).

На Фиг.4В представлен SDS-PAGE анализ (4-20%-ный Трис-глициновый гель) BBC при помощи вестерн-блоттинга в соответствии с методикой, описанной для Фиг.4А.

На Фиг.5А представлен SDS-PAGE (4-20% Трис-глициновый гель) сравнение BBC, очищенного при помощи окрашивания серебром + коллоидного окрашивания, описанного в пояснениях к Фиг.1, с BBC, очищенным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (дорожка 11). Дорожки 1-12 представляют собой следующее: (1) культуральная жидкость клеточной культуры, (2) после центрифугирования (осветление 1°), (3) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр, (4) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (осветление 2°), (5) объединенная среда после прохождения и промывки мембранного адсорбера Mustang™ Q, (6) объединенные фракции после элюирования BBC в мембранном адсорбере Mustang™ Q, (7) концентрат BBC, полученный после ПФ ультрафильтрации/диафильтрации, (8) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр (конечным), (9) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (конечного) (общий концентрат очищенного BBC), (10) проведение стандартизации Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (11) BBC, очищенный центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (добавляли лишь половину объема от объема дорожки 9) и (12) контроль BBC (серия #1, очищенный общий концентрат).

На Фиг.5В представлено SDS-PAGE (4-20% Трис-глициновый гель) сравнение BBC, очищенного при помощи Вестерн-блоттинга в соответствии с методикой, описанной для Фиг.1, с BBC, очищенным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (дорожка 11), в соответствии с пояснением к Фиг.5А.

На Фиг.6 приведена гистограмма, показывающая процентный титр выхода BBC, полученный в четырех экспериментальных сериях адаптации методики к крупномасштабному применению (объем клеточной культуры 4,5 л). CR #1 представляет собой экспериментальную Серию 1, CR #2 представляет собой экспериментальную Серию 2, CR #3 представляет собой экспериментальную Серию 3 и ТТ 01 представляет собой экспериментальную Серию 4.

На Фиг.7 приведена гистограмма, показывающая удаление загрязняющих белков в операции очистки при помощи Mustang^TM Q для конструкции BBC_INN4CT₁-gag1.

На Фиг.8А изображена гистограмма, показывающая получение BBC_NJN4CT1-gag1 при скрининге в ТМАЕ (триметиламиноэтиловая смола) при pH 6,5.

На Фиг.8В изображена гистограмма, показывающая получение BBC_NJN4CT1-gag1 при скрининге в ТМАЕ при pH 7,0.

На Фиг.8С изображена гистограмма, показывающая получение BBC_NJN4CT1-gag1 при скрининге в ТМАЕ при pH 7,5.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Из-за того, что вирус везикулярного стоматита (BBC) имеет множество характеристик, которые делают привлекательным его применение в качестве вектора в описанных выше иммуногенных композициях и/или для доставки генов, кодирующих терапевтические белки, в данной области техники имеется потребность в разработке способов очистки, при помощи которых из культур клеток млекопитающих можно получать рекомбинантный BBC повышенной степени чистоты. Указанную потребность удовлетворяют композиции и способы, раскрытые в настоящем описании. В нижеследующих Примерах 3-8 описаны усовершенствованные способы очистки и выделения BBC из культуры клеток млекопитающих (см., например, Фиг.1) и BBC, очищенный при помощи таких способов.

I. Получение BBC в культуре клеток млекопитающих

Процедура получения BBC в культуре клеток млекопитающих хорошо известна специалистам в данной области техники, и она обычно включает заражение клеточной культуры (клетки-хозяина) рекомбинантным BBC, культивирование BBC в клеточной культуре и сбор клеточной культуры в подходящий момент. Поскольку BBC выделяется из клеток-хозяев в среду, получаемый BBC собирают в жидкости клеточной культуры.

В способе приготовления BBC из культуры клеток млекопитающего и, следовательно, в новых способах выделения BBC из этой культуры применяют подходящие культуры клеток млекопитающего, используемые для размножения (или роста) BBC (вирус с несегментированной антисмысловой одноцепочечной PHK), известные в данной области техники. Неограничивающие примеры таких клеточных культур включают эмбриональные клетки почки человека (HEK), клетки HEK 293, клетки почки Африканской зеленой мартышки (AGMK), например клетки Vero, клетки яичников Китайского хомячка (СНО) и клетки почки новорожденных хомячков (BHK).

Кроме того, материалы клеточных культур, способы и методики известны специалистам в данной области техники. Например, исходный материал рекомбинантного BBC (например, «спасенный» BBC, см. ниже раздел II) применяют для заражения популяции монослоя клеток-хозяев или популяции клеток-хозяев, имеющей определенную плотность (например, культуры клеток Vero) в биореакторе при заданной множественности заражения; BBC культивируют в клеточной культуре в течение заданного времени и при заданной температуре, и образующееся потомство BBC собирают в составе культуральной жидкости клеток. Как указано далее, термины «культуральная жидкость», «жидкость клеточной культуры», «среда для клеточной культуры», «среда» и/или «жидкость из биореактора» взаимозаменяемы и относятся к среде или раствору, в котором культивируют клеточную культуру.

II. Очистка (получение) BBC из культуры клеток млекопитающих

Рассматриваемые в настоящем описании новые способы получения BBC из культуральной жидкости культуры клеток млекопитающих, зараженных BBC, включают несколько операций очистки. На блок-схеме, показанной на Фиг.1, представлена общая схема способа, который включает следующие операции: (а) первичное осветление, (b) вторичное осветление, (с) адсорбцию на анионообменной мембране, (d) проточную фильтрацию вдоль направления потока и (е) фильтрование. Более конкретно, указанные операции включают (а) осветление жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования, (b) дальнейшее осветление надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования, фильтрованием через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, (с) очистку отфильтрованного раствора, содержащего BBC, в анионообменном мембранном адсорбере, (d) замену буфера и концентрирование BBC при помощи проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) и (е) конечное фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм. В некоторых других примерах реализации стадии очистки (а)-(е) осуществляют при комнатной температуре. Как указано выше, «комнатная температура» означает температуру или температуры, составляющие или находящиеся в диапазоне от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C. Таким образом, например, подходящая температура проведения операций (а)-(е) включает температуру, составляющую по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и включая 25°C, или дробные значения температуры, находящиеся между указанными значениями. В одном из конкретных примеров реализации, операции очистки (а)-(е) проводят при 20°С.

(а) Первичное осветление

В некоторых примерах реализации, культуральную жидкость культуры клеток млекопитающего, зараженных BBC, осветляют при помощи низкоскоростного центрифугирования (или, в альтернативном случае, объемным фильтрованием), и BBC получают в надосадочной жидкости - в настоящем описании эту операцию также называют «первичным (или 1°) осветлением» жидкости клеточной культуры. В некоторых примерах реализации, первичное осветление жидкости клеточной культуры проводят при комнатной температуре.

Способы и оборудование для центрифугирования, применяемые для первичного осветления жидкости клеточной культуры, хорошо известны специалистам в данной области техники. Ниже указано, что «низкоскоростное» центрифугирование представляет собой центрифугирование со скоростью менее 10000 об/мин. В некоторых примерах реализации, скорость низкоскоростного центрифугирования, которое применяют для осветления жидкости клеточной культуры, составляет скорость центрифугирования, находящуюся в диапазоне от 4000×g(±100×g) до 8000×g(±100×g). В других примерах реализации скорость низкоскоростного центрифугирования, применяемого для осветления жидкости клеточной культуры, представляет собой скорость центрифугирования, составляющую по меньшей мере 4000×g, 4500×g, 5000×g, 5500×g, 6000×g, 6500×g, 7000×g, 7500×g или 8000×g или любое количество об./мин, лежащее в указанных диапазонах. В одном из конкретных примеров реализации первичное осветление жидкости клеточной культуры низкоскоростным центрифугированием производят при 6238×g в течение 30 минут при комнатной температуре (Пример 3, Таблица 2).

Как указано выше, в некоторых примерах реализации, культуральную жидкость культуры клеток млекопитающего, зараженных BBC, в альтернативном случае осветляют (1°) объемным фильтрованием (вместо низкоскоростного центрифугирования). Объемное фильтрование может быть использовано, если на стадии (а) первичного осветления не применяют низкоскоростное центрифугирование. Объемное фильтрование (в отличие от поверхностного фильтрования) обычно проводят при помощи «толстых» фильтров, которые иммобилизуют загрязнения внутри своей структуры. Материалы и способы объемного фильтрования хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, материал фильтра обычно представляет собой толстую структуру из целлюлозного волокна, заполненного неорганическими фильтрующими добавками, например частицами диатомитовой земли (кизельгура), заполняющими отверстия волокон. Такой материал фильтра имеет большую площадь внутренней поверхности, которая является фактором, определяющим характеристики улавливания частиц и фильтрации. Диаметры пор указанных модулей для объемного фильтрования равны по размеру или находятся в диапазоне от 1,0 мкм до 4,5 мкм, включая размеры отверстий, составляющие по меньшей мере 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 и 4,5 мкм, а также дробные значения, находящиеся между указанными величинами. Неограничивающие примеры модулей, применяемых для объемного фильтрования, включают модули Whatman® Polycap™ HD (Whatman Inc.; Florham Park, NJ), модули Sartorius Sartoclear™ P (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и модули Millipore® Millistak+® HC (Millipore; Billerica, MA). В одном из конкретных примеров реализации культуральную жидкость очищают при помощи объемного фильтрования (проводимого при комнатной температуре) и BBC получают в составе фильтрата (Пример 3, Таблица 1).

(b) Вторичное осветление

После первичного осветления, проводимого посредством центрифугирования (или объемного фильтрования), жидкость, содержащую BBC (или фильтрат), осветляют далее (2°) при помощи фильтрования или микрофильтрации через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,25 мкм, и BBC извлекают в отфильтрованный раствор. В одном из конкретных примеров реализации, микрофильтрацию производят при комнатной температуре, как указано выше. Средства для фильтрования/микрофильтрации изготавливают из различных материалов, и они доступны в различном исполнении и известны специалистам в данной области техники. Неограничивающие примеры установок для микрофильтрации включают установки для фильтрования Millipore Millex®-GV (Millipore; Billerica, MA), установки для фильтрования Millipore Millex®-GP, установки для фильтрования Pall Supor® (Pall Corp.; East Hills, NY), установки для фильтрования Sartorius Sartobran™ (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и установки для фильтрования Sartorius Sartopore^TM 2. В некоторых примерах реализации размеры отверстий фильтров указанных установок для фильтрования составляют от 0,2 до 0,45 мкм. Размеры пор указанных установок для фильтрования составляют по меньшей мере 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4 и 0,45 мкм, а также дробные значения, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации фильтр представляет собой установку для фильтрования Sartorius Sartobran^TM с размером отверстий, равным 0,2 мкм. Отфильтрованный BBC получают в отфильтрованном растворе.

(с) Адсорбция на анионообменной мембране

После проведения осветления продукта BBC (т.е. стадий осветления 1° и 2°, описанных выше), BBC далее очищают в анионообменном мембранном адсорбере. Материалы, применяемые в мембранных адсорберах, хорошо известны специалистам в данной области техники и поставляются такими производителями, как Sartorius Corp. (Edgewood, NY), Pall Corp. (East Hills, NY) и Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, МО). Неограничивающие примеры анионообменных мембранных адсорберов включают мембранный адсорбер Sartobind^TM Q (Sartorius Corp.) и мембранный адсорбер Mustang™ Q (Pall Corp.). В одном из конкретных примеров реализации анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Pall Mustang™ Q. В общем случае, в мембранной адсорбционной хроматографии могут быть непосредственно использованы способы и буферные растворы, применяемые для традиционной ионообменной хроматографии, которые известны специалистам в данной области техники. В некоторых примерах реализации анионообменную мембранную адсорбционную хроматографию проводят при комнатной температуре, как указано выше.

Таким образом, в некоторых примерах реализации, BBC очищают в анионообменном мембранном адсорбере, в котором отфильтрованный раствор BBC, получаемый после вторичного осветления, загружают в анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором (также называемым «уравновешивающим буфером» или «буфером, связывающим BBC»). BBC элюируют с анионообменного мембранного адсорбера с помощью второго буферного солевого раствора («буфером элюирования») с получением фракций, которые содержат BBC (например, см. нижеследующий Пример 6).

В некоторых примерах реализации первый буферный солевой раствор или равновесный буфер представляет собой солевой раствор NaCl или KCl. NaCl или KCl присутствуют в растворе в концентрации, создающей ионную силу, значения которой составляют приблизительно от по меньшей мере 0,1 М до приблизительно 0,4 М. Таким образом, значения ионной силы раствора составляют по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 М, включая дробные значения, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации, соль представляет собой NaCl, а ионная сила раствора NaCl составляет 0,3 М. Буферный раствор может представлять собой фосфатный буфер, буфер, который содержит N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES), или буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS). В некоторых примерах реализации pH указанных буферных растворов составляет приблизительно от 6,0 до 8,0, т.е. значения pH составляют по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 и 8,0 или значения pH, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации значение pH первого буферного солевого раствора составляет 7,5. В некоторых других примерах реализации значение pKa первого буферного раствора при проведении адсорбции на анионообменной мембране составляет от 6,0 до 8,5, т.е. значение pKa составляет по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4 и 8,5 или равно значениям pKa, лежащим между указанными значениями.

В конкретных примерах реализации, равновесный буфер также содержит приблизительно от 1% сахарозы до 5% сахарозы. В некоторых примерах реализации, равновесный буфер содержит приблизительно 1% сахарозы. В одном из конкретных примеров реализации, концентрация сахарозы составляет 2%. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 3% сахарозы. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 4% сахарозы. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 5% сахарозы. Тем не менее могут быть использованы и другие значения концентрации сахарозы, находящиеся между указанными целыми значениями.

Второй буферный солевой раствор («буфер элюирования») также может содержать те же буферные компоненты, что и первый (равновесный) буфер. В некоторых примерах реализации второй буферный солевой раствор или буфер элюирования представляет собой солевой раствор NaCl или KCl. В одном из конкретных примеров реализации соль, находящаяся во втором буферном солевом растворе, представляет собой NaCl. NaCl или KCl присутствуют в растворе в концентрации, создающей ионную силу, значения которой составляют приблизительно от по меньшей мере 0,1 М и приблизительно до 0,4 М. Таким образом, значения ионной силы раствора составляют по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 М, включая дробные значения, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации соль представляет собой NaCl, а ионная сила раствора NaCl составляет 0,3 М. Буферный раствор может представлять собой фосфатный буфер, буфер, который содержит N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES), или буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS). В некоторых примерах реализации значение pH указанных буферных растворов составляет приб