Способ получения продуктов ферментации

Способ получения продуктов ферментации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам получения продуктов ферментации из содержащего лигноцеллюлозу материала с использованием одного или нескольких ферментирующих организмов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Из-за ограниченных ресурсов горючих полезных ископаемых и опасений относительно выделения газов, создающих парниковый эффект, увеличивается внимание к использованию возобновляемых источников энергии.

Получение продуктов ферментации из содержащего лигноцеллюлозу материала известно в данной области и включает предварительную обработку, гидролиз и ферментацию содержащего лигноцеллюлозу материала.

Стадию ферментации проводят с использованием ферментирующего организма, способного превращать поддающиеся ферментации сахара в желаемый продукт ферментации. После того, как ферментирующий организм инокулируют в среду для ферментации, он проходит через ряд фаз. Начальную фазу обозначают как «латентная фаза», и она представляет собой период адаптации, когда не продуцируется значительного количества продукта ферментации. Во время следующих двух фаз, обозначаемых как «экспоненциальная фаза» с увеличивающимся ростом и «стационарная фаза», представляющая собой фазу после максимального роста, продуцируются значительные количества продукта ферментации. Циклы ферментации, как правило, могут проходить в течение вплоть до 96 часов или более, что делает каждый цикл требующим больших затрат времени и дорогостоящим.

Способ получения продуктов ферментации из содержащих лигноцеллюлозу материалов или целлюлозной «биомассы» является также ограниченным устойчивостью ферментирующего организма к множеству токсинов, обнаруженных в неочищенных гидролизатах, применяемых в способе ферментации. Удаление токсинов из гидролизата является сложным, требующим больших затрат времени и дорогостоящим. Чтобы исключить дорогостоящую стадию удаления токсинов, процентное содержание твердых веществ в гидролизатах обычно поддерживают ниже 10% общего содержания твердых веществ (масс./масс.), таким образом минимизируя эффект токсинов на ферментирующий организм. К сожалению, ограничение общей концентрации твердых веществ означает меньшее количество доступного для ферментации субстрата и меньший выход продукта ферментации на партию.

Таким образом, является очень желательным использовать неочищенные гидролизаты с высокой общей концентрацией и уменьшать время ферментации, необходимое для получения желаемого продукта ферментации из содержащего лигноцеллюлозу материала.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам получения продуктов ферментации из содержащего лигноцеллюлозу материала с использованием одного или нескольких ферментирующих организмов.

Изобретение относится к способам получения продуктов ферментации из содержащего лигноцеллюлозу материала, где способ включает:

i) предварительную обработку содержащего лигноцеллюлозу материала;

ii) гидролиз предварительно обработанного содержащего лигноцеллюлозу материала;

iii) ферментацию с использованием ферментирующего организма;

где ферментацию начинают и проводят при:

a) количестве клеток ферментирующего организма в диапазоне 10-250×10¹⁰ клеток на 1 л среды для ферментации; или

b) концентрации ферментирующего организма в диапазоне 2-90 г массы ферментирующего организма в сухом состоянии на 1 л среды для ферментации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг.1 показан эффект различных количеств растворов сахара и фильтрованного ферментного гидролизата предварительно обработанной кукурузной соломы (PCS) на продукцию этанола при периодической ферментации в двух различных штаммах дрожжей через 96 часов.

На Фиг.2 показан эффект высокой плотности клеток RED STAR™ на периодическую ферментацию этанола в фильтрованном ферментном гидролизате предварительно обработанной кукурузной соломы (PCS) при различных исходных концентрациях клеток дрожжей.

На Фиг.3 показан эффект высокой плотности клеток дрожжей RWB218 на периодическую ферментацию этанола в ферментном гидролизате предварительно обработанной кукурузной соломы (PCS) при различных исходных концентрациях клеток дрожжей.

На Фиг.4 показан эффект высокой плотности клеток RED STAR™ и повторного использования клеток при рН5 на продукцию этанола при периодической ферментации в фильтрованном ферментном гидролизате предварительно обработанной кукурузной соломы (PCS) при исходной концентрации клеток дрожжей 40 г/л.

На Фиг.5 показан эффект высокой плотности клеток RED STAR™ и повторного использования клеток при рН 6 на продукцию этанола при периодической ферментации в фильтрованном ферментном гидролизате предварительно обработанной кукурузной соломы (PCS) при исходной концентрации клеток дрожжей 40 г/л.

На Фиг.6а показан эффект высокой плотности клеток дрожжей RWB218 и повторного использования клеток на продукцию этанола при периодической ферментации с подпиткой в центрифугированном ферментном гидролизате предварительно обработанной кукурузной соломы (PCS) при концентрации клеток дрожжей 20 г/л.

На Фиг.6b показан эффект высокой плотности клеток дрожжей RWB218 на продукцию этанола при периодической ферментации с подпиткой в центрифугированном ферментном гидролизате предварительно обработанной кукурузной соломы (PCS) при концентрации клеток дрожжей 20 г/л от 0 до 24 часов.

На Фиг.7 показан эффект высокой плотности дрожжей RWB218 на продукцию этанола при периодической ферментации из кукурузной соломы (CS), предварительно обработанной с помощью различных способов предварительной обработки, в ферментном гидролизате предварительно обработанной кукурузной соломы (PCS) при различных исходных концентрациях клеток дрожжей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам получения продуктов ферментации из содержащего лигноцеллюлозу материала с использованием одного или нескольких ферментирующих организмов.

В соответствии с настоящим изобретением время ферментации можно значительно сократить посредством проведения ферментации при очень высоком количестве клеток во время ферментации. Даже несмотря на то, что скорость ферментации для ферментирующего организма может не быть выше, чем в общепринятых способах ферментации, тот факт, что абсолютное число ферментирующих организмов является высоким во время ферментации, приводит к быстрой продукции (определенной как абсолютное количество продукта ферментации в единицу времени) желаемого продукта ферментации.

Кроме того, согласно изобретению, ферментирующий организм можно выделять и использовать повторно, как описано ниже. Укороченное время ферментации и необязательное повторное использование ферментирующих организмов снижает общую стоимость способов по настоящему изобретению по сравнению с общепринятыми способами.

Следовательно, изобретение относится к способам получения продуктов ферментации из содержащего лигноцеллюлозу материала, где способ включает:

i) предварительную обработку содержащего лигноцеллюлозу материала;

ii) гидролиз предварительно обработанного содержащего лигноцеллюлозу материала;

iii) ферментацию с использованием ферментирующего организма;

где ферментацию начинают и проводят при:

a) количестве клеток ферментирующего организма в диапазоне 10-250×10¹⁰ клеток на л среды для ферментации; или

b) концентрации ферментирующего организма в диапазоне 2-90 г массы ферментирующего организма в сухом состоянии на л среды для ферментации.

В предпочтительном варианте осуществления нерастворимые твердые вещества (включая лигнин и непревращенные полисахариды) удаляют перед ферментацией. Например, нерастворимые твердые вещества можно удалять после предварительной обработки содержащего лигноцеллюлозу материала на стадии i). Предварительно обработанный полученный из лигноцеллюлозы материал, с удаленными нерастворимыми твердыми веществами, можно затем подвергать ферментации по изобретению. В другом варианте осуществления нерастворимые твердые вещества можно удалять после гидролиза предварительно обработанного содержащего лигноцеллюлозу материала на стадии ii). Гидролизованный предварительно обработанный полученный из лигноцеллюлозы материал, с удаленными нерастворимыми твердыми веществами, можно затем подвергать ферментации по изобретению.

Полученные из лигноцеллюлозы поддающиеся ферментации сахара, подлежащие ферментации, присутствуют в форме жидкости (например, фильтрата), поступающей со стадий предварительной обработки или гидролиза i) или ii), или с обеих стадий i) и ii). В предпочтительном варианте осуществления гидролиз на стадии ii) и ферментацию на стадии iii) проводят как отдельные стадии гидролиза и ферментации (SHF), как комбинированную стадию гидролиза и ферментации (HHF) или как стадию одновременного гидролиза и ферментации (SSF). Стадии SSF, HHF и SHF хорошо известны в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления ферментацию можно проводить при количестве клеток ферментирующего организма в диапазоне 20-250×10¹⁰ клеток на л среды для ферментации, более предпочтительно, в диапазоне 50-250×10¹⁰ клеток на л среды для ферментации, более предпочтительно, в диапазоне 100-250×10¹⁰ клеток на л среды для ферментации, более предпочтительно, в диапазоне 150-250×10¹⁰ клеток на л среды для ферментации, например, в диапазоне 200-250×10¹⁰ клеток на 1 л среды для ферментации.

В предпочтительном варианте осуществления ферментацию можно проводить при концентрации ферментирующего организма в диапазоне 3-90 г массы ферментирующего организма в сухом состоянии на 1 л среды для ферментации, 3-50 г массы ферментирующего организма в сухом состоянии на 1 л среды для ферментации, предпочтительно, в диапазоне 4-50 г массы ферментирующего организма в сухом состоянии на 1 л среды для ферментации, предпочтительно, в диапазоне 5-50 г массы ферментирующего организма в сухом состоянии на 1 л среды для ферментации, более предпочтительно, в диапазоне 10-50 г массы ферментирующего организма в сухом состоянии на 1 л среды для ферментации, более предпочтительно, в диапазоне 10-40 г массы ферментирующего организма в сухом состоянии на 1 л среды для ферментации; особенно в диапазоне 10-30 г массы ферментирующего организма в сухом состоянии на 1 л среды для ферментации.

Согласно изобретению ферментирующие организмы можно иммобилизовывать. Например, ферментирующие организмы можно иммобилизовывать на инертных подложках с высокой площадью поверхности, суспендированных в резервуаре/сосуде для ферментации, через который подают гидролизованный и/или предварительно обработанный полученный из лигноцеллюлозы материал, подлежащий ферментации. Любой способ иммобилизации можно использовать по изобретению. Способы иммобилизации ферментирующих организмов хорошо известны в данной области. Примеры пригодных способов иммобилизации можно найти, например, в Kesava et al., 1996, «Ethanol production by immobilized whole cells of Zymomonas mobilis in a continuous flow expanded bed bioreactor and a continuous flow stirred tank bioreactor», Journal of Industrial Microbiology 17:11-14; Gough et al., 1998, «Production of ethanol from molasses at 45 degrees C using Kluyvemmyces marxianus IMB3 immobilized in calcium alginate gels and poly(vinyl alcohol) cryogel», Bioprocess Engineering 19:87-90; Love et al., 1998, «Continuous ethanol fermentation at 45 degrees C using Kluyveromyces marxianus IMB3 immobilized in Calcium alginate and kissiris», Bioprocess Engineering 18:187-189; Abbi et al., 1996, «Bioconversion of pentose sugars to ethanol by free and immobilized cells of Candida shehatae (NCL-3501): Fermentation behaviour» Process Biochemistry 31:555-560; Krishnan et al., 2000, «Ethanol production from glucose and xylose by immobilized Zymomonas mobilis CP4(pZB5)», Applied Biochemistry And Biotechnology 84-6:525-541; Chibata et al., 1981, Ann. Rev. Microphys. Bioeng 10: 197-216; Fukui et al., 1982, Ann. Rev. Microbial 36: 145-172; John F. Kennedy, 1982, Nature, 299: 777-778 (содержание всех ссылок, таким образом, приведено в качестве ссылки).

В одном варианте осуществления ферментирующие организмы можно преимущественно выделять и использовать повторно. Например, ферментирующие организмы можно выделять их отделением от среды для ферментации в резервуаре/сосуде для ферментации. Альтернативно, ферментирующие организмы можно выделять их отделением от среды для ферментации после ферментации. Фракцию среды для ферментации, содержащую продукт ферментации, можно далее перерабатывать или очищать, например, перегонкой. Выделенные ферментирующие организмы можно использовать повторно в том же самом резервуаре/сосуде для ферментации или в одном или нескольких других резервуарах/сосудах для ферментации. Иными словами, ферментирующие организмы можно выделять и возвращать в среду для ферментации и таким образом использовать повторно в одном или нескольких дополнительных циклах ферментации по изобретению. Число циклов ферментации, в которых можно использовать возвращенные ферментирующие организмы, может зависеть от ряда факторов, включая, в качестве неограничивающих примеров, pH, тип ферментирующего организма, концентрацию продукта ферментации, например, концентрацию этанола, или общую концентрацию твердых веществ (TS). Специалисты в данной области могут изменять эти факторы согласно изобретению для оптимизации числа событий повторного использования.

В другом варианте осуществления стадию размножения можно добавлять в способ выделения и повторного использования ферментирующих организмов. Например, выделенный ферментирующий организм можно размножать в течение какого-либо периода времени перед возвращением в цикл или повторным использованием в последующем цикле ферментации.

Любой способ можно использовать для выделения ферментирующих организмов. Пригодные способы хорошо известны в данной области, включая фильтрацию, например, с использованием фильтр-пресса, и центрифугирование.

Согласно предпочтительному варианту осуществления фермент, способный превращать ксилозу в ксилулозу, может присутствовать во время гидролиза и/или ферментации. Такой превращающий ксилозу в ксилулозу фермент может в предпочтительном варианте осуществления представлять собой ксилозо-изомеразу (иногда обозначаемую как глюкозо-изомераза). Примеры пригодных ксилозо-изомераз можно найти в разделе «Ксилозо-изомераза» ниже. Превращение ксилозы в ксилулозу является преимущественным, поскольку оно позволяет некоторым общепринятым C6 ферментирующим организмам, таким как Saccharomyces cerevisiae, превращать ксилулозу в желаемый продукт ферментации, такой как этанол, одновременно с ферментацией C6 сахаров, особенно таких, как глюкоза.

В одном варианте осуществления ферментацию поддающихся ферментации C6 и C5 сахаров проводят одновременно. Одновременную ферментацию C5 и C6 сахаров можно проводить следующим образом:

Стадия ферментации iii) дополнительно включает:

a) одновременную ферментацию C5 и C6 сахаров, полученных на стадии предварительной обработки i) или стадии гидролиза ii);

b) выделение и повторное использование ферментирующих организмов.

Альтернативно, в другом варианте осуществления стадия гидролиза ii) и стадия ферментации iii) дополнительно включают:

1) одновременный гидролиз и одновременную ферментацию C5 и C6 сахаров, полученных на стадии предварительной обработки i).

В другом варианте осуществления стадия гидролиза ii) и стадия ферментации iii) дополнительно включают:

1) одновременный гидролиз и одновременную ферментацию C5 и C6 сахаров, полученных на стадии предварительной обработки i);

2) выделение и повторное использование ферментирующих организмов.

Альтернативно, в другом варианте осуществления, ферментацию поддающихся ферментации C5 сахаров проводят после ферментации поддающихся ферментации C6 сахаров. Последовательную ферментацию C6 и C5 сахаров можно проводить следующим образом:

Стадия ферментации iii) дополнительно включает:

a) ферментацию C6 сахаров, полученных на стадии предварительной обработки i) или стадии гидролиза ii);

b) выделение и повторное использование C6 ферментирующих организмов;

c) ферментацию C5 сахаров;

d) выделение и повторное использование C5 ферментирующих организмов.

Альтернативно, в другом варианте осуществления стадия гидролиза ii) и стадия ферментации iii) дополнительно включает:

1) одновременный гидролиз и ферментацию C6 сахаров, полученных на стадии предварительной обработки i);

2) ферментацию C5 сахаров.

Альтернативно, в другом варианте осуществления стадия гидролиза ii) и стадия ферментации iii) дополнительно включают:

1) одновременный гидролиз и ферментацию C6 сахаров, полученных на стадии предварительной обработки i);

2) удаление нерастворимых твердых веществ;

3) ферментацию C5 сахаров;

4) выделение и повторное использование ферментирующих организмов.

В одном варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал можно детоксифицировать. В одном варианте осуществления материал промывают перед гидролизом и/или ферментацией. В другом варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал может являться недетоксифицированным, например, непромытым.

Содержащий лигноцеллюлозу материал

«Лигноцеллюлоза» или «содержащий лигноцеллюлозу материал» обозначает материал, первоначально состоящий из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Такой материал часто обозначают как «биомасса».

Биомасса лигноцеллюлозы представляет собой комплексную структуру волокон целлюлозы, обернутых оболочкой из лигнина и гемицеллюлозы. Структура лигноцеллюлозы является такой, что она нечувствительна к ферментативному гидролизу. Чтобы усилить ферментативный гидролиз, лигноцеллюлозу необходимо предварительно обработать, например, кислым гидролизом в адекватных условиях давления и температуры, чтобы разрушить защитный слой лигнина, осахарить и солюбилизировать гемицеллюлозу и разрушить кристаллическую структуру целлюлозы. Затем можно проводить ферментативный гидролиз целлюлозы, например, обработкой целлюлолитическим ферментом для превращения углеводных полимеров в поддающиеся ферментации сахара, которые можно ферментировать до желаемого продукта ферментации, такого как этанол. Обработки гемицеллюлолитическим ферментом можно также применять для гидролиза всей оставшейся гемицеллюлозы в предварительно обработанной биомассе.

Содержащий лигноцеллюлозу материал может представлять собой любой материал, содержащий лигноцеллюлозу. В предпочтительном варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал содержит по меньшей мере 30 масс.%, предпочтительно, по меньшей мере 50 масс.%, более предпочтительно, по меньшей мере 70 масс.%, даже более предпочтительно, по меньшей мере 90 масс.%, лигноцеллюлозы. Следует понимать, что содержащий лигноцеллюлозу материал может также содержать другие составляющие, такие как белковый материал, крахмал и сахара, такие как поддающиеся ферментации или не поддающиеся ферментации сахара или их смеси.

Содержащий лигноцеллюлозу материал, как правило, обнаруживают, например, в стеблях, листьях, оболочке семян, листовой обертке и стержнях початков растений или в листьях, ветвях и древесине деревьев. Содержащий лигноцеллюлозу материал включает, но не ограничивается ими, травяной материал, сельскохозяйственные отходы, отходы лесной промышленности, коммунально-бытовые твердые отходы, макулатуру и пульпу и отходы целлюлозно-бумажной промышленности. Следует понимать, что содержащий лигноцеллюлозу материал может присутствовать в форме материала клеточной стенки растений, содержащего лигнин, целлюлозу и гемицеллюлозу в смешанном матриксе.

В предпочтительном варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал выбирают из одного или нескольких из кукурузных волокон, рисовой соломы, древесины хвойных пород, древесных стружек, древесины тополя, выжимок и отходов переработки бумаги и пульпы.

Другие примеры пригодного содержащего лигноцеллюлозу материала включают кукурузную солому, стержни кукурузных початков, древесину твердых пород, таких как тополь и береза, древесину мягких пород, солому злаков, такую как пшеничная солома, просо прутьевидное, мискант, рисовую шелуху, коммунально-бытовые твердые отходы (MSW), промышленные органические отходы, конторскую бумагу или их смеси.

В предпочтительном варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал представляет собой кукурузную солому или стержни кукурузных початков. В другом предпочтительном варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал представляет собой кукурузные волокна. В другом предпочтительном варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал представляет собой просо прутьевидное. В другом предпочтительном варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал представляет собой выжимки.

Предварительная обработка

Содержащий лигноцеллюлозу материал можно предварительно обрабатывать любым пригодным способом.

Предварительную обработку проводят перед гидролизом или ферментацией. Целью предварительной обработки является отделение или высвобождение целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина, и таким образом улучшение скорости или эффективности гидролиза. Способы предварительной обработки, включая влажное окисление и предварительную обработку щелочью, направлены на высвобождение лигнина, в то время как обработка разбавленной кислотой и автогидролиз направлены на высвобождение гемицеллюлозы. Паровой взрыв является примером предварительной обработки, направленной на высвобождение целлюлозы.

Согласно изобретению стадия предварительной обработки может представлять собой общепринятую стадию предварительной обработки с использованием способов, хорошо известных в данной области. В предпочтительном варианте осуществления предварительная обработка имеет место в водной суспензии. Содержащий лигноцеллюлозу материал может во время предварительной обработки присутствовать в количестве между 10-80 масс.%, предпочтительно, между 20-70 масс.%, особенно, между 30-60 масс.%, например, приблизительно 50 масс.%.

Химическая, механическая и/или биологическая предварительная обработка

Согласно изобретению содержащий лигноцеллюлозу материал можно предварительно обрабатывать химическим, механическим, биологическим способом или любым их сочетанием, до или во время гидролиза.

Предпочтительно, химическую, механическую или биологическую предварительную обработку проводят до гидролиза. Альтернативно, химическую, механическую или биологическую предварительную обработку можно проводить одновременно с гидролизом, например, одновременно с добавлением одного или нескольких целлюлолитических ферментов, или ферментов с другими видами активности, для высвобождения, например, поддающихся ферментации сахаров, таких как глюкоза или мальтоза.

В одном варианте осуществления изобретения предварительно обработанный содержащий лигноцеллюлозу материал можно промывать или детоксифицировать другими способом. Однако промывка или детоксификация не является необходимой. В предпочтительном варианте осуществления предварительно обработанный содержащий лигноцеллюлозу материал не является промытым или детоксифицированным.

Химическая предварительная обработка

Фраза «химическая предварительная обработка» относится к любой химической предварительной обработке, способствующей отделению или высвобождению целлюлозы, гемицеллюлозы или лигнина. Примеры пригодных способов химической предварительной обработки включают обработку, например, разбавленной кислотой, известью, щелочью, органическим растворителем, аммиаком, диоксидом серы или диоксидом углерода. Кроме того, влажное окисление и гидротермолиз с контролируемым pH также считают химической предварительной обработкой.

В предпочтительном варианте осуществления химическая предварительная обработка представляет собой обработку кислотой, более предпочтительно, непрерывную обработку разбавленной кислотой или кислотой умеренной концентрации, например, обработку серной кислотой или другой органической кислотой, такой как уксусная кислота, лимонная кислота, винная кислота, янтарная кислота, хлороводород или их смеси. Можно использовать также другие кислоты. Обработка кислотой умеренной концентрации означает, что pH при обработке находится в диапазоне pH 1-5, предпочтительно, pH 1-3. В конкретном варианте осуществления концентрация кислоты находится в диапазоне от 0,1 до 2,0 масс.% кислоты, и кислота предпочтительно представляет собой серную кислоту. Кислоту можно приводить в контакт с содержащим лигноцеллюлозу материалом, и смесь можно выдерживать при температуре в диапазоне 160-220ºC, например, 165-195ºC, в течение периодов, находящихся в диапазоне от минут до секунд, например, 1-60 минут, например, 2-30 минут или 3-12 минут. Добавление сильных кислот, таких как серная кислота, можно применять для удаления гемицеллюлозы. Такое добавление сильных кислот увеличивает способность целлюлозы к расщеплению.

Другие способы предварительной обработки также предусмотрены в рамках изобретения. Показано, что обработка целлюлозы растворителем превращает приблизительно 90% целлюлозы в глюкозу. Показано также, что ферментативный гидролиз можно значительно усилить, когда структура лигноцеллюлозы нарушена. Щелочной H₂O₂, озон, органические растворители (с использованием кислот Льюиса, FeCl₃, (Al)₂SO₄ в водных спиртах), глицерин, диоксан, фенол или этиленгликоль присутствуют среди растворителей, известных как разрушающие структуру целлюлозы и способствующие гидролизу (Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686).

Щелочная химическая предварительная обработка с помощью основания, например, NaOH, Na₂CO₃ и аммиака или т.п., также предусмотрена в рамках изобретения. Способы предварительной обработки с использованием аммиака описаны, например, в WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900, WO 2006/110901, содержание которых таким образом приведено в качестве ссылки.

Способы влажного окисления включают использование окисляющих агентов, таких как окисляющие агенты на основе сульфитов или т.п. Примеры предварительной обработки растворителем включают обработку DMSO (диметилсульфоксидом) или т.п. Химическую предварительную обработку, как правило, проводят в течение 1-60 минут, например, от 5 до 30 минут, но ее можно проводить в течение более коротких или более длинных периодов времени в зависимости от материала, подлежащего предварительной обработке.

Другие примеры пригодных способов предварительной обработки описаны в Schell et al., 2003, Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108, p. 69-85, и Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, и публикации патентной заявки США №2002/0164730, содержание каждого из которых таким образом приведено в качестве ссылки.

Механическая предварительная обработка

Фраза «механическая предварительная обработка» относится к любой механической или физической предварительной обработке, способствующей отделению или высвобождению целлюлозы, гемицеллюлозы или лигнина из содержащего лигноцеллюлозу материала. Например, механическая предварительная обработка включает различные типы измельчения, облучения, обработки паром/парового взрыва и гидротермолиза.

Механическая предварительная обработка включает тонкое измельчение, т.е. механическое уменьшение размера. Тонкое измельчение включает сухое измельчение, влажное измельчение и измельчение на вибрирующей шаровой мельнице. Механическая предварительная обработка может включать высокое давление и/или высокую температуру (паровой взрыв). В одном варианте осуществления изобретения высокое давление означает давление в диапазоне от 300 до 600 psi (от 2068423 до 4136847 Па), предпочтительно, от 400 до 500 psi (от 2757898 до 3447372 Па), например, приблизительно 450 psi (3102635 Па). В одном варианте осуществления изобретения высокая температура означает температуры в диапазоне от приблизительно 100 до 300ºC, предпочтительно, от приблизительно 140 до 235ºC. В предпочтительном варианте осуществления механическая предварительная обработка представляет собой периодический процесс, систему гидролиза с паровой пушкой, где используют высокое давление и высокую температуру, как определено выше. Для этого можно использовать гидролизатор Sunds (доступный из Sunds Defibrator AB (Sweden)).

Комбинированная химическая и механическая предварительная обработка

В предпочтительном варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал предварительно обрабатывают как химически, так и механически. Например, стадия предварительной обработки может включать обработку разбавленной кислотой или кислотой умеренной концентрации и обработку высокой температурой и/или давлением. Химическую и механическую предварительные обработки можно проводить последовательно или одновременно, как желательно.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления содержащий лигноцеллюлозу материал подвергают как химической, так и механической предварительной обработке, чтобы способствовать отделению или высвобождению целлюлозы, гемицеллюлозы или лигнина.

В предпочтительном варианте осуществления предварительную обработку проводят как стадию парового взрыва разбавленной кислоты или кислоты умеренной концентрации. В другом предпочтительном варианте осуществления предварительную обработку проводят как стадию разворачивания волокна аммиаком (или стадию предварительной обработки AFEX).

Биологическая предварительная обработка

Фраза «биологическая предварительная обработка» относится к любой биологической предварительной обработке, способствующей отделению или высвобождению целлюлозы, гемицеллюлозы или лигнина из содержащего лигноцеллюлозу материала. Способы биологической предварительной обработки могут включать применение солюбилизирующих лигнин микроорганизмов. Смотри, например, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P., and Singh, A., 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J.D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M.E., Baker, J.O., and Overend, R.P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C.S., Cao, N.J., Du, J., and Tsao, G.T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Veriag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L, and Hahn-Hagerdal, B., 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolyzates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; and Vallander, L., and Eriksson, K.-E. L., 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95.

Гидролиз

Перед ферментацией предварительно обработанного содержащего лигноцеллюлозу материала его можно гидролизовать для разрушения целлюлозы и гемицеллюлозы до поддающихся ферментации сахаров. В предпочтительном варианте осуществления предварительно обработанный материал гидролизуют, предпочтительно, ферментативным способом, перед ферментацией.

Содержание сухих твердых веществ во время гидролиза может находиться в диапазоне 5-50 масс.%, предпочтительно, 10-40 масс.%, предпочтительно, 20-30 масс.%. Гидролиз можно в предпочтительном варианте осуществления проводить как процесс с подпиткой, где предварительно обработанным содержащим лигноцеллюлозу материалом (т.е. субстратом) постепенно подпитывают, например, содержащий фермент раствор для гидролиза.

В предпочтительном варианте осуществления гидролиз проводят ферментативным способом. Согласно изобретению, предварительно обработанный содержащий лигноцеллюлозу материал можно гидролизовать посредством одного или нескольких целлюлолитических ферментов, таких как целлюлазы или гемицеллюлазы, или их сочетания.

В предпочтительном варианте осуществления гидролиз проводят с использованием препарата целлюлолитического фермента, содержащего один или несколько полипептидов, обладающих способностью усиливать целлюлолитическую активность. В предпочтительном варианте осуществления полипептид(ы), обладающий способностью усиливать целлюлолитическую активность, происходит(происходят) из семейства GH61A. Примеры пригодных и предпочтительных препаратов целлюлолитических ферментов и полипептидов, обладающих способностью усиливать целлюлолитическую активность, описаны в разделе «Целлюлолитические ферменты» и в разделе «Полипептиды, усиливающие целлюлолитическое действие» ниже.

Поскольку содержащий лигноцеллюлозу материал может содержать составляющие, отличные от лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы, гидролиз и/или ферментацию на стадиях ii) и iii) можно проводить в присутствии ферментов с дополнительными видами активности, такими как активность протеазы, активность амилазы, активность образующего углеводы фермента и активность эстеразы, такая как активность липазы.

Ферментативный гидролиз предпочтительно проводят в подходящей водной окружающей среде в условиях, которые может легко определить специалист в данной области. В предпочтительном варианте осуществления гидролиз проводят в подходящих, предпочтительно, оптимальных, условиях для рассматриваемого фермента(ферментов).

Пригодные время процесса, температуру и условия pH легко может определить специалист в данной области. Предпочтительно, гидролиз проводят при температуре от 25 до 70ºC, предпочтительно, от 40 до 60ºC, особенно, приблизительно 50ºC. Эту стадию предпочтительно проводят при pH в диапазоне pH 3-8, предпочтительно, pH 4-6, особенно, приблизительно pH 5. Гидролиз, как правило, проводят в течение от 12 до 96 часов, предпочтительно, 16-72 часов, более предпочтительно, от 24 до 48 часов.

Ферментация

Согласно изобретению поддающиеся ферментации сахара из предварительно обработанного и/или гидролизованного содержащего лигноцеллюлозу материала можно ферментировать посредством одного или нескольких ферментирующих организмов, способных ферментировать сахара, такие как глюкоза, ксилоза, манноза и галактоза, напрямую или опосредованно, в желаемый продукт ферментации. Условия ферментации зависят от желаемого продукта ферментации и ферментирующего организма, и их легко может определить обычный специалист в данной области.

Особенно в случае ферментации до этанола, ферментацию можно продолжать в течение 1-48 часов, предпочтительно, 1-24 часов. В одном варианте осуществления ферментацию проводят при температуре от 20 до 40ºC, предпочтительно, от 26 до 34ºC, в частности, приблизительно 32ºC. В одном варианте осуществления pH превышает 5. В другом варианте осуществления pH составляет pH 3-7, предпочтительно, 4-6. Однако некоторые, например, бактериальные ферментирующие организмы обладают более высоким оптимумом температуры ферментации. Таким образом, в одном варианте осуществления ферментацию проводят при температуре между 40-60°С, например 50-60°С. Специалист в данной области может легко определить подходящие условия ферментации.

Ферментацию можно проводить в реакторе периодического действия, в реакторе с подпиткой или реакторе непрерывного действия. Периодическая ферментация с подпиткой может происходить с подпиткой фиксированного объема или меняющегося объема. В одном варианте осуществления применяют периодическую ферментацию с подпиткой. Объем и скорость периодической ферментации с подпиткой зависит, например, от ферментирующего организма, идентичности и концентрации поддающихся, ферментации Сахаров и желаемого продукта ферментации. Такие скорости и объемы ферментации легко может определить обычный специалист в данной области.

SSF, HHF и SHF

В одном варианте осуществления настоящего изобретения гидролиз и ферментацию проводят как стадию одновременного гидролиза и ферментации (SSF). Как правило, это означает, что комбинированные/одновременные гидролиз и ферментацию проводят в условиях (например, при температуре и/или рН), подходящих, предпочтительно, оптимальных, для рассматриваемого ферментирующего организма(организмов).

В другом варианте осуществления стадию гидролиза и стадию ферментации проводят как комбинированную - стадию гидролиза и ферментации (HHF). HHF, как правило, начинается с отдельной стадии частичного гидролиза и заканчивается стадией одновременного гидролиза и ферментации. Отдельная стадия частичного гидролиза представляет собой стадию ферментативного осахаривания целлюлозы, как правило, проводимую в условиях (например, при более высоких температурах), подходящих, предпочтительно, оптимальных, для гидролиза рассматриваемым ферментом(ферментами). Последующую стадию одновременного гидролиза и ферментации, как правило, проводят в условиях, подходящих для ферментирующего организма(о