Наноантитела, связывающие антиген chlamydia trachomatis, способ подавления инфекции, вызванной chlamydia trachomatis

Наноантитела, связывающие антиген chlamydia trachomatis, способ подавления инфекции, вызванной chlamydia trachomatis

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к областям биотехнологии и медицины, в частности к получению и использованию однодоменных наноантител для детекции и блокирования инфекции, вызванной патогенными микроорганизмами, в частности Chlamydia trachomatis.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

C.trachomatis - патогенная для человека грамотрицательная бактерия с облигатным внутриклеточным типом паразитирования. Характерный для хламидий двухфазный цикл развития включает две формы существования патогена: внеклеточные элементарные тельца и внутриклеточные ретикулярные тельца.

Урогенитальная инфекция (УГИ), вызванная С.trachomatis, является наиболее распространенной ИППП бактериальной природы как у мужчин, так и у женщин.

Среди болезней, обусловленных видом С.trachomatis, насчитывается более 20 нозологических форм, особое место среди которых занимают, так называемые, урогенитальные хламидиозы (УГХ), поражающие мочеполовой тракт человека, передающиеся половым путем. Урогенитальные хламидиозы - цервицит, уретрит, проктит, эндометрит, сальпенгит, перегепатит - у женщин; уретрит, эпидедимит, проктит, простатит - у мужчин - наиболее распространены среди населения активного полового возраста.

При бесплодии хламидии обнаруживают в 50-57% случаев. При этом наблюдают не только функциональные нарушения репродуктивной деятельности, но и вовлечение в процесс систем регуляции гомеостаза, иммунокомпетентных клеткок и др. Частота хламидийного инфицирования при трубном бесплодии составляет 41-54%. После первого случая хламидиоза риск трубного бесплодия возрастает на 10%, а после третьего - на 50%. В бесплодных браках 50-55% мужчин стерильны, из них у 64% стерильность обусловлена УГХ. Хламидии могут вызвать бесплодие в результате прямого воздействия на сперматозоиды вследствие плотного прилипания хламидии к мужским гаметам, что препятствует оплодотворению яйцеклетки. Некоторыми авторами отмечено, что развитие вторичного бесплодия у женщин при восходящей хламидийной УГИ наблюдается в 6 раз чаще, чем при гонорее.

При эктопической беременности С.trachomatis обнаруживают в 9-30% случаев. За последние годы отмечено увеличение числа хламидиоза беременных (10-40%) и новорожденных. Инфицированные женщины в 40-60% случаев передают инфекцию новорожденным.

В возрасте 15-19 лет УГХ диагностируется у 46%, в 20-24 лет - у 30%. Уровень заболеваемости достаточно высок не только среди взрослого населения и подростков, ведущих активную половую жизнь, но и среди детей младшего возраста, не живущих половой жизнью. Так, при обследовании мальчиков до 12 лет, обратившихся в детский кабинет УГИ, у 67,4% была выявлена С.trachomatis. При этом клиническая картина УГХ соответствовала уретриту, а у 7,9% детей по УЗИ имелись следы перенесенного простатита.

Очень важно, что у 75% женщин и 40% мужчин отмечено асимптомное течение заболевания, а у подростков в 30-40% случаев имеет место скрытая хламидийная инфекция, которая протекает в течение 2-5 лет. Бессимптомное течение характерно не только для урогенитальной локализации, но также для инфекций других органов. Эпидемиологическая значимость бессимптомных хламидиозов доказана еще в работах основоположника хламидиологии в России, А.А.Шаткина. Хламидии не являются представителями нормальной микрофлоры человека. Их обнаружение указывает на наличие инфекционного процесса, а отсутствие клинических симптомов заболевания определяет лишь временное равновесие, возникшее между паразитом и хозяином в условиях, ограничивающих, но не препятствующих размножению патогенного внутриклеточного микроорганизма. В этой связи хламидийная инфекция с клиническим бессимптомным течением является не менее опасной, чем ее манифестные формы и требует проведения лечебных и профилактических мероприятий. Наибольшую ответственность за распространение инфекции в настоящее время несут не выявленные, не лечащиеся или неправильно лечащиеся больные с острыми, подострыми или вяло текущими хламидийными воспалительными процессами.

Во многих развитых европейских странах и США уже более 25 лет проводятся национальные программы по контролю за УГХ, основанные на скрининговом обследовании населения групп риска, своевременном лечении, обследовании и лечении партнеров. Несмотря на эти меры, заболеваемость первичным хламидиозом и случаи повторного инфицирования продолжают возрастать.

В течение последних лет в Российской Федерации заболеваемость урогенитальной хламидийной инфекцией вышла на первое место среди всех бактериальных инфекций, передаваемых половым путем, и уступает по частоте только трихомонозу.

По данным ФГУ ЦНИИОИЗ Росздрава г.Москвы в 2004 г. заболеваемость УГХ по сравнению с 1994 г выросла в 1,7 раза (61,4 против 101,7). В 2005 г. общее количество случаев заболеваний ИППП составили 503,6 на 100000 населения, в 2006 году уменьшилось на 4,1%. Однако УГХ в 2005 году составил 95.9 на 100000 (взрослые) и 3,1 на 100000 (дети); в 2006 году 97,2 на 100000; в 2007 году 91,1 на 100000 (взрослые) и 3,2 на 100000 (дети).

В 2008 году зарегистрировано 611634 случая заболеваний инфекциями, передаваемыми половым путем, что составило 403,5 на 100000 населения. Хламидийная инфекция составила 20,8%. За последние 3 года в целом по России прослеживается снижение числа больных ИППП, в том числе хламидийной инфекцией на 8,4%. Заболеваемость хламидийной инфекцией в России в 2008 году составила 89,5 на 1000000 взрослого населения и 2,8 на 100000 (дети).

Таким образом, медико-социальное значение хламидийной инфекции обусловлено, в первую очередь, высоким уровнем заболеваемости и часто возникающими осложнениями, а также влиянием на демографические показатели в связи с тем, что УГХ - самая частая причина женского и мужского бесплодия.

Лечение урогенитального хламидиоза представляет собой наиболее сложный аспект рассматриваемой проблемы, что связано и с особенностями возбудителя инфекции и с циклом его развития, а также с тем, что в 70% случаев хламидиоз сочетается с другой инфекцией: уреаплазмой, вирусом простого герпеса, гарднереллой и др. Этиотропная терапия основана на чувствительности хламидий к антибиотикам. Вполне обоснованно широкое распространение в лечении хламидиоза получили антибиотики тетрациклинового ряда: доксициклин, метациклин, миноциклин, тетрациклин. Согласно рекомендациям ВОЗ: доксициклин 100 мг перорально 2 раза в день или тетрациклин 500 мг перорально 4 раза в день, курс лечения 7 дней. Необходимо отметить, что за последнее время количество случаев неэффективного лечения значительно возросло, что, возможно, связано с развитием устойчивости возбудителя к антибиотику в популяции. По-видимому, дозы и длительность лечения необходимо корректировать в зависимости от течения урогенитального хламидиоза (острое или хроническое, восходящая инфекция, рецидив и т.д.). Наибольшие разногласия исследователей связаны с применением антибиотиков фторхинолонового ряда: офлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин. Одни авторы сообщают об успешной терапии офлоксацином в 81-100% случаев (200-300 мг перорально 2 раза в день в течение 7 дней); другие отмечают высокий процент неудач и худшие отдаленные результаты.

Лечение хронических, осложненных форм хламидиоза представляет очень серьезную и нерешенную в настоящее время проблему. Это, в первую очередь, связано с тем, что при хронизации инфекционного процесса в организме образуются, так называемые, персистирующие формы хламидий - формы патогена, адаптированные к длительному выживанию и утратившие чувствительность к антибиотикам. Поэтому лечение антибиотиками хронических форм урогенитального хламидиоза, как показали многочисленные клинические и микробиологические исследования, неэффективно. Такая ситуация диктует необходимость разработки новых антибактериальных препаратов, механизм действия которых будет принципиально отличаться от воздействия антибиотиков.

В качестве ближайшего аналога технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести мышиные моноклональные антитела к основному белку наружной мембраны (МОМР) C.trachomatis. Антитела были получены по стандартной методике получения моноклональных антител на основе гибридомной технологии при иммунизации мышей. Полученные антитела связывались с МОМР C.trachomatis, распознавая эпитопы, локализованные на поверхности хламидийной клетки. В опытах in vivo антитела снижали токсичность возбудителя для мышей.

Zhang, Y.-X., S.J.Stewart, and H.D.Caldwell. Protective monoclonal antibodies to Chlamydia trachomatis serovar- and serogroup-specific major outer membrane protein determinants. / Протективные моноклональные антитела к Chlamydia trachomatis, специфичные в отношении к сероваро- и серогруппоспецифических детерминант основного белка наружной мембраны. Infect. Immun. 1989, 57:636-638 (ПРИЛОЖЕНИЕ 1)

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества фармацевтической композиции и способу его использования, выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.

Недостатками прототипа являются:

1) Относительно дорогостоящее производство антител, сложность поддержания и хранения продуцента, очень высокие требования к качеству используемых реактивов и условий культивирования.

2) Относительно большой размер, что влечет за собой пониженную проницаемость тканей.

3) Структурные особенности накладывают ограничение на узнавание некоторых «скрытых» эпитопов, таких как находящихся в углублениях, щелях малого размера в структуре белков.

4) Ограниченность и относительная трудоемкость генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, сложность создания многовалентных и многофункциональных производных.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке новых антител - антиген-узнающих молекул, лишенных указанных выше недостатков и специфически узнающих хламидии трахоматис (C.trachomatis).

Задачей настоящего изобретения является создание новых антител, способных эффективно связывать антигены хламидии C.trachomatis и ингибировать развитие хламидийной инфекции. Их получение, производство и хранение должны быть экономичны, эффективны и относительно просты. Размер должен быть существенно меньше, чем у классических антител.

Поставленная задача решается за счет того, что создано наноантитело, специфически связывающее поверхностный антиген Chlamydia trachomatis и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Создано также наноантитело, специфически связывающее поверхностный антиген Chlamydia trachomatis и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Наноантитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, подавляет развитие хламидийной инфекции, вызванной хламидией C.trachomatis. Наноантитело, имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, подавляет развитие хламидийной инфекции, вызванной хламидией C.trachomatis. Заявлен способ подавления развития хламидийной инфекции in vitro, вызванной хламидией C.trachomatis, включающий в себя предварительную обработку элементарных телец хламидии C.trachomatis терапевтически эффективным количеством наноантитела, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, перед их добавлением к инфицируемым клеткам-мишеням. Заявлен также способ подавления развития хламидийной инфекции in vitro, вызванной хламидией C.trachomatis, включающий в себя предварительную обработку элементарных телец хламидии C.trachomatis терапевтически эффективным количеством наноантитела, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, перед их добавлением к инфицируемым клеткам-мишеням.

В основе настоящего изобретения находятся не классические бивалентные антитела, кои рассматриваются в качестве прототипа, а малые наноантитела, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими моноклональными антителами для практического применения в области терапии заболеваний. Поскольку наноантитела с молекулярной массой около 12-15 кДа на порядок меньше по размеру традиционных антител, они приобретают ряд новых положительных качеств, имеющих практическую значимость. Существует эффективные способы получения и селекции таких антител в отношении различных антигенов, а благодаря своей низкой иммуногенности наноантитела могут применятся для лечения инфекций, вызванных патогенами данной группы.

Полным эквивалентом термина "наноантитела" для целей настоящего изобретения является вошедшее в широкое употребление обозначение «нанотело», введенное фирмой ABLYNX «NANOBODY», а также «однодоменное мини-антитело» и «однодоменное наноантитело».

Рекомбинантные наноантитела получают на основе особых неканонических одноцепочечных антител, существующих в норме наряду с классическими антителами у животных семейства Верблюдовых (и у некоторых видов хрящевых рыб). Эти особые антитела состоят из димера только одной укороченной (без первого константного района СН1) тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен (VHH, «наноантитело», «nanobody» или однодоменное наноантитело) этого антитела. Организация вариабельных доменов (VHH) неканонических антител в значительной степени подобна той, что у вариабельных доменов (VH) классических антител (у человека VH-домены иммуноглобулинов подкласса lgG3 имеют особо выраженную гомологию с VH и VHH верблюдовых). В обоих случаях V-домены состоят из четырех консервативных каркасных участков (FR, «framework regions»), окружающих три гипервариабельных участка (определяющие комплементарность, CDR, от «complementarity determining regions»). В обоих случаях домены формируют типичную для V-домена иммуноглобулина пространственную структуру из двух бета-слоев (-листов), один - из четырех аминокислотных цепочек, и второй - из пяти [Padlan Е.А. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem. 1996; 49: 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. / «Узнавание антигенов фрагментами однодоменных антител: избыточная роскошь спаренных доменов». TIBS 2001; 26: 230-235]. В этой структуре все три гипервариабельных участка кластеризуются с одной стороны V-домена (где они участвуют в узнавании антигена) и располагаются в петлях, соединяющих бета-структуры. Однако, имеются и важные отличия, связанные с функционированием VHH в формате одного домена. Так, гипервариабельные участки CDR1 и CDR3 заметно увеличены в случае VHH. Часто в гипервариабельных участках VHH обнаруживаются цистеиновые остатки, причем присутствующие сразу в двух участках (чаще всего в CDR1 и CDR3, реже - в CDR2 и CDR3). При исследовании кристаллических структур VHH было показано, что эти цистеиновые остатки формируют дисульфидные связи, что приводит к дополнительной стабилизации структуры петель данного антигена. Наиболее явным и воспроизводимым отличительным признаком VHH являются четыре замены гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные во втором каркасном участке (Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly, согласно нумерации Кабат). Этот каркасный участок в случае VH домена является высоко консервативным, обогащен гидрофобными аминокислотными остатками и особо важен для образования связи с вариабельным доменом VL легкой цепи. VHH-домен в этом плане сильно отличается: указанные замены гидрофобных аминокислот на гидрофильные делают невозможной ассоциацию VHH и VL. Эти замены также объясняют высокую растворимость VHH, наноантитела, когда его получают в виде рекомбинантного белка [Тиллиб С.В. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85].

По сравнению с традиционными и чисто рекомбинантными антителами верблюжьи наноантитела обладают рядом преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний.

Характерными особенностями наноантител, определяющими большой потенциал их использования для самых разнообразных практических приложений в иммунобиотехнологии, являются следующие [см. обзор: Тиллиб С.В. «Верблюжьи наноантитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85].

1) Наличие высокоэффективного способа генерирования и селекции наноантител.

2) Малый размер, ~2×4 нм, 13-15 кДа, улучшенная проницаемость клеток.

3) Структурные особенности, а именно, способность образовывать необычные для классических антител паратопы, позволяющие связываться с углублениями и активными центрами белков); могут использоваться для выявления «скрытых» эпитопов или эпитопов, которые не могут быть узнаны существенно более крупными обычными антителами.

4) Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах. Обычно наноантитела нарабатывают в периплазме бактерий E.coli (в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры). Возможна их наработка в дрожжах, растениях и клетках млекопитающих.

5) Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.

6) Низкая иммуногенность; возможность экономично «гуманизировать» антитела без заметной потери их специфической активности.

Возможность получения рекомбинантных наноантител с заданной специфичностью определяется существованием у представителей семейства Camelidae функциональных и обладающих достаточно широким спектром узнавания неканонических антител. Неканонические антитела состоят из димера только одной укороченной тяжелой цепи иммуноглобулина без легких цепей, специфичность узнавания которых определяется лишь одним вариабельным доменом [Hamers-Casterman С, Atarhouch Т, Muyldermans S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. / «Существующие в природе антитела без легких цепей». Nature 1993; 363: 446-448]. Техническая реализация отбора наноантител, являющихся генно-инженерными производными антиген-распознающих доменов одноцепочечных антител верблюда, основана на высокоэффективной процедуре селекции антиген-узнающих полипептидов, экспонированных на поверхности частицы нитчатого фага - «фаговый дисплей».

Метод фагового дисплея является весьма эффективной и широко используемой технологией для функционального отбора из больших рекомбинантных библиотек последовательностей ДНК, кодирующих пептиды и белки, обладающие заданными свойствами и экспрессирующиеся в составе поверхностного белка нитчатых фагов [Brissette R & Goldstein Nl. The use of phage display peptide libraries for basic and translational research. / «Использование пептидных фагово-дисплейных библиотек для фундаметальных исследований и исследований трансляции». Methods Mol Biol. 2007; 383: 203-13; Sidhu SS & Koide S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces./ «Фаговый дисплей для конструирования и анализа взаимодействий белковых доменов». Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 481-7]. Одно из особо важных приложений этой технологии - генерирование специфических рекомбинантных антител для самых различных антигенов [Hoogenboom HR. Selecting and screening recombinant antibody libraries./ «Селекция и анализ библиотек рекомбинантных антител». Nat Biotechnol. 2005; 23: 1105-16]. Обычно, вместо больших целых молекул классических антител для экспонирования на поверхности фага используют гибридные рекомбинантные одноцепочечные белки, представляющие собой случайные комбинации клонированных последовательностей вариабельных районов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, соединенные короткой серин/глицин-богатой линкерной последовательностью. Такая химерная молекула, в случае правильного сочетания доменов, способна сохранять специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на введенные по сравнению с нативной молекулой антител изменениями. Одной из проблем традиционных рекомбинантных технологий является необходимость работы с очень большими библиотеками рекомбинантных антител, в которых должны быть представлены всевозможные комбинации двух случайных вариабельных районов (тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов), соединенных линкерной последовательностью. Помимо проблемы представленности здесь также очевидна и проблема формирования правильной относительной конформации этих двух доменов, а также проблема растворимости индивидуальных вариабельных доменов, которые часто имеют тенденцию к аггрегации. Упомянутые проблемы возможно избежать при использовании наноантител, так как практически каждый клонированный вариабельный домен одноцепочечных антител будет в этом случае обладать определенной антиген-узнающей специфичностью, соответствующей одному из антител иммунизированного животного, и можно эффективно проводить селекцию из относительно небольших библиотек таких доменов.

Наноантитела с заданной специфичностью или их производные могут использоваться, как и классические антитела, в различных приложениях, включающих в себя, но не ограниченных, детекцией антигенов, как в исследовательских, так и в диагностических целях, блокированием активности белка-антигена, специфической доставкой за счет связывания с антигеном желаемых молекул, конъюгированных с антителом. Также, наноантитела могут быть исходными модулями - блоками - более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами, или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также: комбинированное объединение в одну конструкцию наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов [Conrath КЕ, Lauwereys M, Wyns L, Muyldermans S. Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. / «Верблюжьи однодоменные антитела в качестве модулярныйх строительных единиц в биспецифичных и бивалентных конструкциях антител». J Biol Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Zhang J, Tanha J, Hirama T, Khieu NH, To R, Tong-Sevinc H, Stone E, Brisson JR, MacKenzie CR. Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents./ «Пентамеризация однодоменных антител из фаговых библиотек: новая стратегия быстрого получения реагентов антител с высокой авидностью». J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (1); 49-56; Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. / «Эффективная раковая терапия конъюгатами на основе нанотел». Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Baral TN, Magez S, Stijiemans B, Conrath K, Vanhollebeke B, Pays E, Muyldermans S, De Baetselier P. Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody-conjugated human trypanolytic factor. / «Экспериментальная терапия африканской трипаносомии с помощью человеческого трипанолитического фактора, конъюгиованного с наотелом». Nat. Med. 2006 May; 12 (5): 580-4; Coppieters K, Dreier Т, Silence К, Haard HD, Lauwereys M, Casteels P, Beirnaert E, Jonckheere H, Wiele CV, Staelens L, Hostens J, Revets H, Remaut E, Elewaut D, Rottiers P. Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. / «Форматированные анти-TNFalpha VHH-белков, выделенные из верблюдовых, демонстрируют высокое сродство к воспаленным суставам в мышиной модели коллаген-индуцированного артрита». Arthritis Rheum. 2006 Jun; 54 (6): 1856-66]; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы [Harbury P.В., Zhang T.,Kim P.S., et al. A switch between two-, three- and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. / «Перключение между двух-, трех- и четырех-цепочечными спиральными структурами в мутантах GCN4-«лейциновой молнии»». Science, 1993, 262: 1401-1407; Shirashi Т., Suzuyama k., Okamoto H. et al. Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif. / «Усиленная цитотоксичность растворимого Fas-лиганда вследствие его соединения с мотивом «изолейциновой молнии»». Biochem. Biophys. Res. Communic. 2004, 322: 197-202; ChenchikA., Gudkov A., Komarov A., Natarajan V. Reagents and methods for producing bioactive secreted peptides./ «Реагенты и методы для получения биоактивных секретируемых пептидов». 2010. US Patent Application 20100305002], или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы [Deyev SM, Waibel R, Lebedenko EN, Schubiger AP, Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module. / «Дизайн мультивалентных комплексов используя модуль барназа-барстар». Nat Biotechnol. 2003, 21(12): 1486-92.].

Также было показано [Vincke С., Loris R., Saerens D., et al. // J.Biol.Chem. 2009. V.284. №5. P.3273-3284], что можно «гуманизировать» такие верблюжьи наноантитела без заметной потери их специфической активности, проведя небольшое число точечных замен аминокислот. Это открывает потенциальную возможность широкого использования наноантител в качестве средств пассивной иммунизации для предотвращения развития различных опасных инфекционных заболеваний [Wesolowski J., Alzogaray V., Reyelt J. et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. / «Однодоменные антитела: многообещающие экспериментльные и терапевтические инструменты в области инфекции и иммунитета». Med. Microbiol. Immunol. 2009; 198, 157-174.].

Раскрытие изобретения.

Способ получения наноантител, связывающих антигены хламидии C.trachomatis, проводят на основании селекции методом фагового дисплея, генно-инженерных модификаций кодирующих эти антитела последовательностей и использования в качестве продуцента действующего вещества (антитела) бактерии E.coli. Наноантитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных антител и являются полнофункциональными антиген-узнающими единицами, обладающими рядом новых положительных качеств практической значимости. Наноантитело представляет собой однодоменный белок, который хорошо растворим и обладает повышенной стабильностью (в широком диапазоне температур и рН). Это позволяет избегать проблем с растворимостью и правильным сворачиванием молекул антител при продукции прокариотическими клетками и ведет к существенному снижению затрат на их производство по сравнению с традиционными способами получения терапевтических моноклональных антител в эукариотических системах экспрессии. Существенно облегчается также процедура сохранения и транспортировки антител по сравнению с заметно менее стабильными традиционными антителами. В силу меньшего размера наноантитела характеризуются лучшей способностью проникать в ткани. Наконец, наноантитела позволяют легко проводить генно-инженерные манипуляции с целью последующей продукции биспецифических наноантител или химер, в состав которых помимо наноантитела входит другой белок с желаемыми свойствами.

Несмотря на то, что, главным образом, в иллюстративных целях авторами настоящего изобретения делается акцент на продукции антител с использованием бактерии E.coli, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают и другие варианты систем реализации настоящего изобретения, прямо не заявленные в настоящем документе. Например, в качестве эукариотического продуцента могут быть использованы дрожжевые культуры или любые другие системы, очевидные в данной области техники.

Способ получения наноантител описан в примерах 1 и 2. Выбор путей реализации с целью получения наноантител с заявляемыми свойствами из прокариотической системы экспрессии в соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения обусловлен следующими факторами:

1) Высокий экспрессионный выход, экономичность наработки в больших количествах, обеспечивающийся экспрессией наноантител в периплазму бактерий E.coli в количестве 1-10 мг из 1 литра культуры.

2) Простота всевозможных генно-инженерных манипуляций, адаптации для конкретных задач, возможность создания многовалентных и многофункциональных производных.

3) Высокая экономическая рентабельность производства.

Авторы настоящего изобретения исходили из того, что, как известно среднему специалисту в данной области техники, первичные, исходно получаемые последовательности наноантител, могут быть затем адаптированы или «форматированы» различным образом для последующего практического использования. Так, наноантитела могут быть исходными модулями-блоками - более сложных многомодульных препаратов. Возможно объединение в одном мультивалентном производном двух, трех и более моновалентных первичных наноантител. Эти объединяемые в одну конструкцию наноантитела могут связываться как с одним и тем же эпитопом антигена-мишени, так и с его разными эпитопами, или даже с различными антигенами-мишенями. Возможно также комбинированное объединение в одну конструкцию наноантител и других молекул или лекарств с получением многофункциональных препаратов; мультимеризация с помощью введения дополнительных аминокислотных последовательностей, взаимодействующих белковых доменов, таких как лейциновые зипперы или последовательностей небольших белков, образующих стабильные комплексы. Для модулирования свойств препарата наноантитела, например, увеличения времени жизни или совершенствования способа очистки, в состав конечного соединения могут быть введены дополнительные аминокислотные последовательности. Среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что такие модификации и прочие варианты антител, лежащих в основе настоящего изобретения, подпадают под объем настоящего изобретения, поскольку являются структурными и функциональными вариантами наноантител. Таким образом, авторы настоящего изобретения понимают под термином «наноантитела» как первичные, исходно получаемые, «минимальные» аминокислотные последовательности наноантител, так и их модификации, полученные в результате упомянутых адаптации или «форматирования» и их варианты. Термин «вариант антитела» для целей настоящего изобретения означает полипептид, который содержит изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, как минимум 10% от активности исходного наноантитела. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять, например, от 1 до 30, более предпочтительно, от 1 до 15, и наиболее предпочтительно, от 1 до 5 изменений в последовательности исходного наноантитела. Эти изменения могут иметь место в областях полипептида, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который характеризуется гомологией не менее 70%, предпочтительно, не менее 80%, более предпочтительно, не менее 90%, и наиболее предпочтительно, не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности исходного наноантитела при условии сохранения активности полипептида. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка, добавление или замена одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Поскольку гипервариабельные районы наноантител определяют их специфическое взаимодействие с антигеном, то именно гомологичные замены аминокислот в этих участках могут приводить к получению несколько различающихся по последовательности наноантител, которые обладают идентичными или близкими свойствами. Таким образом, среднему специалисту в данной области техники будет очевидно, что под объем настоящего изобретения подпадают не только указанные в приложении последовательности наноантител, но и те, которые могут быть получены путем замен аминокислот в гипервариабельных участках, указанных в перечне последовательностей как CDR, на другие, но очень близкие по свойствам, аминокислоты консервативных замен.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, кодирующего исходное наноантитело, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же функциональный полипептид исходного наноантитела, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, и установления активности экспрессируемого продукта.

Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотидов, описанных выше, также включают

мутации, которые имеют место в природе и, например, обусловлены изменчивостью.

Полипептиды наноантител согласно настоящему изобретению могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть феномена состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более, чем одним триплетным нуклеотидным кодоном. Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав кассет, экспрессирующих антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, и подпадающих под объем настоящего изобретения.

Получение функционально-активных наноантител, распознающих антигены хламидии C.trachomatis, показано в примерах 3, 4.

Эффективность ингибирующего действия терапевтически эффективного количества наноантител на развитие хламидийной инфекции продемонстрирована примере 5.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлены нуклеотидные и аминокислотные последовательности двух отобранных наноантител, aCt1 и aCt2, полученные параллельно одним и тем же способом и обладающие искомыми свойствами: способностью специфически связывать Chlamydia trachomatis. Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующие два отобранных наноантитела были определены для aCt1 - SEQ ID NO: 1; для aCt2 - SEQ ID NO: 3, и из них были выведены соответствующие аминокислотные последовательности отбранных наноантител: для aCt1 - SEQ ID NO: 2; для aCt2 - SEQ ID NO: 4. В указанных последовательностях подчеркнуты соответственно слева направо, от N- к С-концу гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 антигенузнающих последовательностей отобранных наноантител. Стрелками указаны позиции аминокислотных остатков, являющихся характеристическими для вариабельных доменов особых одноцепочечных антител, отличающихся от остатков в вариабельных доменах тяжелых цепей классических антител.

На фиг.2 представлены результаты микроиммунофлуоресцентного (МИФ) анализа, демонстрирующего специфическое связывание C.trachomatis наноантителами aCt1 и aCt2. Детекцию связавшихся наноантител проводили с помощью анти-НА антител мыши и вторичных антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Специфическое связывание характеризуется ярко-зеленым свечением. Х 1500, где,

А - микрофотографии результатов МИФ с aCt1 (10 мкг/мл)

Б - микрофотографии результатов МИФ с aCt2 (10 мкг/мл)

1 - C.trachomatis, 2 - белок овальбумин, 3 - C.pneumoniae, 4 - C.mundarum,