Новые анти-il 13 антитела и их использование

Новые анти-il 13 антитела и их использование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Интерлейкин (IL)-13 является плейотропным цитокином Т-хелперных клеток 2-го подкласса (Th2). Аналогично IL4, IL13 принадлежит к семейству цитокинов I типа, имеющим третичную структуру, заданную 4α-спиральным гидрофобным пучковым кором. IL13 имеет приблизительно 30% аминокислотную гомологию с IL4 и имеет многие общие свойства с IL4 (Wynn, Ann. Rev. Immunol., 21: 425 (2003)). Функциональное сходство IL4 и IL13 приписывают тому факту, что IL13 может связывать альфа-цепь рецептора IL4 (IL4R-α) после его связывания с альфа-цепью 1 рецептора IL13 (IL13Rα1) (Hershey, J. Allergy Clin. Immunol., 111:677 (2003)). IL4Rα активируется IL4 и IL13, приводя к фосфорилированию Jak1-зависимых STAT6. Как IL4, так и IL13 активирует пролиферацию В-клеток и индуцирует переключение классов IgG4 и IgE совместно с CD40/CD40L (Punnonen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3730 (1993), Oettgen et al„ J. Allergy Clin. Immunol., 107: 429 (2001)).

Однако, в отличие от IL4, IL13 не вовлечен в дифференциацию наивных Т-клеток в ТП2-клетки (Zurawski et al., Immunol. Today, 15: 19 (1994)). IL13 позитивно регулирует FceRI и таким образом способствует IgE-праймингу тучных клеток (de Vries, Allergy Clin. Immunol. 102: 165 (1998). В моноцитах/макрофагах IL13 позитивно регулирует экспрессию CD23 и антигенов МНС I и II классов, отрицательно регулирует экспрессию Fey и CD14 и ингибирует антитело-зависимую цитотоксичность (de Waal Malefyt et al., J. Immunol., 151: 6370 (1993), Chomarat et al., Int. Rev. Immunol., 17: 1 (1998)). IL13, но не IL4, способствует выживаемости эозинофилов, активации и рекрутингу (Horie et al., Intern. Med., 36: 179 (1997), Luttmann et al., J. Immunol. 157:1678 (1996), Pope et al., J. Allergy Clin. Immunol., 108: 594 (2001). IL13 также проявляет важные функции на негематопоэтических клетках, таких как клетки гладких мышц, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и клетки фибробластов. IL13 усиливает пролиферацию и холинергически индуцируемое сокращение гладких мышц (Wills-Karp, J. Allergy Clin. Immunol., 107: 9 (2001), В эпителиальных клетках IL13 является сильным индуктором образования хемокинов (Li et al., J. Immunol. 162: 2477 (1999), изменяет мукоцилиарную дифференцировку (Laoukili et al., J. Clin. Invest, 108: 1817 (2001), снижает частоту движения ресничек клеток реснитчатого эпителия (Laoukili et al., J. Clin. Invest., 108: 1817 (2001), и приводит к метаплазии бокаловидных клеток (Zhu et al., J. Clin. Invest., 103: 779 (1999), Grunig et al., Science, 282: 2261 (1998)). В эндотелиальных клетках IL13 является сильным индуктором сосудисто-клеточной адгезивной молекулы 1 (VCAM-1), которая является важной для рекруитмента эозинофилов (Bocher et al., J. Immunol. 154: 799 (1995)). В фибробластах кожи человека IL13 индуцирует синтез коллагена 1 типа в фибробластах кожи человека (Roux et al., J. Invest. Dermatol., 103: 444 (1994)).

Хотя IL13 и IL4 имеют определенные функциональные сходства, изучение заболевания на животных моделях и мышах с «выключенным» геном показало, что IL13 обладает уникальными эффекторными функциями, отличными от IL4 и предоставляет убедительные доказательства, что IL13, независимо от других Th2-цитокинов, является необходимым и достаточным для индукции всех признаков аллергической астмы (Wills-Karp et al., Science, 282: 2258 (1998), Walter et al., J. Immunol. 167: 4668 (2001)). IL13 может играть более существенную роль чем другие Th2-цитокины в эффекторных функциях, связанных с симптомами астмы (Curr, Curr. Opin. Immunol., 11: 610 (1999)). Это утверждение подкрепляется на болезни человека строгой корреляцией между уровнями IL13 и генетическими полиморфизмами в гене IL13 и корреляциями заболевания (Wills-Karp. et al., Respir. Res. 1: 19 (2000); Vercelli et al., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 2: 389 (2002); He et al., Genes Immunol., 4: 385 (2003), Arima et al., J. Allergy Clin. Immunol., 109: 980 (2003), Liu et al., J. Clin. Allergy Immunol., 112: 382 (2003)). Полученные данные дают основание предполагать, что IL13 индуцирует признаки аллергической реакции посредством его действия на слизистый эпителий и клетки гладких мышц скорее, чем посредством традиционных путей с вовлечением эозинофилов и событий, опосредованных IgE (Wills-Karp et al., Sci., 282: 2258 (1998)).

Астму описывают как хроническое легочное заболевание, которое заключается в воспалении дыхательных путей, гиперчувствительности и обструкции. Физиологически, гиперчувствительность дыхательных путей подтверждают снижением бронхиального дыхания после бронхопровокации с использованием метахолина или гистамина. Другие механизмы запуска, которые провоцируют обструкцию дыхательных путей, включают в себя холодный воздух, физическую нагрузку, вирусную инфекцию верхних дыхательных путей, курение и респираторные аллергены. Бронхиальная провокация аллергеном индуцирует на ранней стадии мгновенное (IgE)-опосредованное снижение иммуноглобулина Е в бронхиальном дыхании, за которым у многих пациентов следует фаза замедленной IgE-опосредованной реакции со снижением бронхиального дыхания в течение 4-8 часов. Ранний ответ вызван резким высвобождением веществ, вызывающих воспаление, таких как гистамин, простагландин D2 (PGD₂), лейкотриен, триптаза и фактор активации тромбоцитов (PAF), тогда как поздний ответ вызывается de novo синтезированными про-воспалительными цитокинами (например, TNFα, IL4, IL13) и хемокинами (например, МСР-1 и MIP-1α) (Busse et al. In: Allergy: Principles and Practice, Ed. Middleston, 1173 (1998)). У пациентов с хронической астмой стойкие легочные симптомы опосредуются повышенным ответом Тп2-клкток. Предполагают, что цитокины Th2 играют жизненную роль в заболевании (Larche et al., J. Allergy Clin. Immunol., 111: 450 (2003)), конкретно, IL13 и IL4 продуцируются Th2-клетками с NK фенотипом (NKT) в дыхательных путях, как показано на модели астмы у грызунов (Akbari et al., Nature Med., 9: 582 (2003)). Суммарная патология дыхательных путей астматического характера демонстрирует легочную гиперинфильтрацию, гладкомышечную гипертрофию, утолщение lamina reticularis, отек слизистой, отшелушивание эпителиальных клеток, разрушение клеток ресничек и гиперсекрецию слизистых желез. Микроскопически астма характеризуется наличием повышенного числа эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов и плазматических клеток в бронхиальных тканях, повышенной бронхиальной секрецией и слизью. В начальной стадии существует рекрутинг лейкоцитов из кровотока активированными CD4+ Т-лимфоцитами к дыхательным путям. Активированные Т-лимфоциты также направляют высвобождение воспалительных медиаторов из эозинофилов, тучных клеток и лимфоцитов. Кроме того, ТП2-клетки продуцируют IL4, IL5, IL9 и IL13. IL4 вместе с IL13 передает сигнал переключения с IgM на IgE антитела.

Сшивка мембранно-связанных молекул IgE аллергеном вызывает дегрануляцию тучных клеток, высвобождение гистамина, лейкотриенов и других медиаторов, которые навсегда сохраняют воспаление дыхательных путей. IL5 активирует рекрутинг и активацию эозинофилов. Активированные тучные клетки и эозинофилы также производят свои цитокины, которые помогают навсегда сохранить воспаление. Такие повторяющиеся циклы воспаления в легких вместе с поражением пульмональных тканей с последующей регенерацией могут производить долговременные структурные изменения («перестройку») дыхательных путей.

Умеренную астму в настоящее время лечат с помощью ежедневно вдыхаемого противовоспалительного кортикостероида или ингибитора тучных клеток, например, кромолин-натрия или недокромила плюс вдыхаемого бета2-агониста по мере необходимости (3-4 раза в день) для облегчения прорыва симптомов или астмы, индуцированной аллергеном или физическими нагрузками. Кромолин-натрия и недокромил блокируют бронхоспазм и воспаление, но являются обычно эффективными только для астмы, которая вызывается аллергенами или физическими нагрузками и типична только для молодых астматиков. Ингалируемые кортикостероиды улучшают воспаление, гипереактивность дыхательных путей и обструкцию, и снижают число резких обострений. Однако, требуется, по меньшей мере, месяц до достижения выраженных эффектов и вплоть до года для появления заметного улучшения. Наиболее частыми побочными эффектами являются хрипота и грибковая инфекция полости рта, то есть кандидоз. Сообщалось о более серьезных побочных эффектах, например, частичной супрессии надпочечников, ингибировании роста и сниженном костеобразовании, но только вместе с применением повышенных доз. Беклометазон, триамцинолон и флунизолид, вероятно, имеют сходную эффективность; тогда как будесонид и флутиказон являются более эффективными и, по имеющимся данным, имеют меньше системных побочных эффектов.

Даже пациенты с умеренным заболеванием обнаруживают воспаление дыхательных путей, в том числе инфильтрацию слизистой оболочки и эпителия активированными Т-клетками, тучными клетками и эозинофилами. Т-клетки и тучные клетки высвобождают цитокины, Которые активируют рост эозинофилов и созревание и образование IgE-антител, а те, в свою очередь, повышают микрососудистую проницаемость, разрушают эпителий и стимулируют нервные рефлексы и слизеобразующие железы. Результатом является гиперреактивность дыхательных путей, бронхостеноз и гиперсекреция, выражающиеся свистящим дыханием, кашлем и одышкой.

Традиционно астма лечилась с использованием пероральных и ингалируемых бронхолитических средств. Эти агенты предотвращают симптомы астмы, но ничего не делают для лежащего в основе воспаления. Распознавание в течение последних 10 лет важности воспаления в этиологии астмы привело к повышенному применению коритикостероидов, но многие пациенты продолжают страдать от неконтролируемой астмы.

Вследствие важности лечения воспалительных заболеваний у людей, конкретно астмы, новые биоактивные компоненты, имеющие немного побочных эффектов, являются непрерывно искомыми. Разработка активных и специфических ингибиторов IL13, которые сохраняют активность в течение длительного времени при введении в астматические дыхательные пути, обеспечивает новый подход в лечении астмы, так же как и в лечении других заболеваний, опосредованных IL13 и IgE.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится, по меньшей мере, частично к антителам, которые связываются специфически и с высокой аффинностью как с гликозилированным, так и с негликозилированным человеческим IL13; не связывают мышиный IL13 и нейтрализуют активность человеческого IL13 при молярном соотношении приблизительно 1:2 (Mab:IL13). Также включенными в изобретение являются антитела, содержащие антигенсвязывающие участки, полученные из вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи указанных антител. Антитела изобретения могут быть моноклональными, и моноклональное антитело может быть антителом человека, химерным антителом или гуманизированным антителом.

Примерами таких антител являются 228 В/С-1, 228А-4, 227-26 и 227-43. Гибридомы, которые продуцируют эти антитела, депонировали 20 ноября 2003 г.в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, под инвентарными номерами РТА-5657, РТА-5656, РТА-5654 и РТА-5655 соответственно.

Изобретение включает в себя антитела, которые имеют VL-последовательность, по меньшей мере, на 95% гомологичную последовательности, изложенной в SEQ ID NO:3 и VH-последовательность, по меньшей мере, гомологичную на 95% последовательности, изложенной в SEQ ID NO:4; антитела, которые имеют VL-последовательность, по меньшей мере, на 95% гомологичную таковой, изложенной в SEQ ID NO:5 и VH-последовательность на 95% гомологичную таковой, изложенной в SEQ ID NO:6; и антитела, которые имеют VL-последовательность на 95% гомологичную таковой, изложенной в SEQ ID NO:7 и VH-последовательность на 95% гомологичную таковой, изложенной в SEQ ID NO:8. Изобретение также включает в себя молекулу рекомбинантного антитела или его IL13-связывающий фрагмент, содержащую, по меньшей мере, одну тяжелую цепь антитела, или его 11-13-связывающий фрагмент, содержащий не относящиеся к человеку CDRs в положениях 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) и 95-102 (CDR3) (нумерация по Кэботу) из антитела мыши, в котором положения 27-30 имеют аминокислоту Gly26, Phe27, Ser28, Leu29, Asn30, (SEQ ID NO:18); и по меньшей мере, одну легкую цепь антитела, или его IL13-связывающий фрагмент, содержащий не относящиеся к человеку CDRs в положениях 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3)) из антитела мыши, и каркасные участки моноклонального антитела человека.

Изобретение включает в себя антигенсвязывающие фрагменты антитела человека антител данного изобретения, в том числе, но, не ограничиваясь, Fab, Fab' и F(ab')₂, Fd, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, соединенные дисульфидными связями Fvs (sdFv). Изобретение также включает в себя однодоменные антитела, содержащие или VL- или VH-домен. Пример scFv, изображают на фигуре 21, имеющий последовательность SEQ ID NO:152.

Изобретение включает в себя гуманизированные последовательности моноклонального антитела 228 В/С-1. Эти молекулы рекомбинантного гуманизированного антитела содержат в себе вариабельную область легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, имеющую формулу: FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4, где FRL1 состоит из любой из последовательностей SEQ ID Nos: 20-25; CDRL1 состоит из любой из последовательностей SEQ ID Nos: 99-103; FRL2 состоит из SEQ ID NO: 29; CDRL2 состоит из любой из последовательностей SEQ ID Nos: 104-114; FRL3 состоит из любой из последовательностей SEQ ID Nos: 30-56; CDRL3 состоит из любой из последовательностей SEQ ID Nos: 115-116 и FRL4 состоит из SEQ ID NO: 57-59; и содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую формулу: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4, в которой FRH1 состоит из любой из последовательностей SEQ ID Nos: 60-66; CDRH1 состоит из любой из последовательностей SEQ ID NOs: 117-122;

FRH2 состоит из любой из последовательностей SEQ ID NOs: 67-75; CDRH2 состоит из любой из последовательностей SEQ ID NOs: 123-134; FRH3 состоит из любой из последовательностей SEQ ID NOs: 76-90; CDRH3 состоит из любой из последовательностей SEQ ID NOs: 135-141; FRH4 состоит из любой из последовательностей SEQ ID NOs: 91-92. Вариабельная область тяжелой цепи может дополнительно содержать по меньшей мере СН1-домен константной области или СН1-, СН2- и СН3-домены константной области. Константная область тяжелой цепи может содержать IgG-антитело, в котором IgG-антитело является IgG1-антителом, IgG2-антителом, IgG3-антителом или IgG4-антителом.

Изобретение также включает в себя молекулы рекомбинантных антител, в которых вариабельную легкую цепь выбирают из любой из последовательностей SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 93, 95, 97, 142, 144 и 150, и вариабельную тяжелую цепь выбирают из любой из последовательностей SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 94, 96, 98, 143, 145,146, 147, 148 и 149. Конкретное антитело содержит вариабельную легкую цепь, имеющую последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 142 и вариабельную тяжелую цепь, имеющую последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 143.

Изобретение включает в себя гибридомные клеточные линии, которые продуцируют моноклональные антитела 228 В/С-1, 228А-4, 227-26 и 227-43. Изобретение включает в себя нуклеиновые кислоты, кодирующие моноклональные антитела 228 В/С-1, 228А-4, 227-26 и 227-43, клеточные линии, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую эти антитела или их цепи, и векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую эти антитела или их цепи.

Изобретение также включает антитела, которые связывают тот же самый эпитоп, что и 228 В/С-1. Типичные полипептиды содержат всю или часть последовательности SEQ ID NO:1 или ее варианты, или SEQ ID NO: 2, в которой 13 аминокислоту заменяют из глутаминовой кислоты на лизин. Изобретение также относится к эпитопу, узнаваемому антителами данного изобретения. Эпитопные пептиды включают в себя пептид, существенно содержащий или состоящий из ESLINVSG (SEQ ID NO:18) или YCAALESLINVS (SEQ ID NO: 19).

Изобретение включает в себя композицию, содержащую антитела в соответствии с приложенной формулой изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем, наполнителем или стабилизатором.

Изобретение включает в себя способ лечения субъекта, страдающего от астматических симптомов, содержащий введение субъекту, например, субъекту, который в этом нуждается, количества анитела, в соответствии с формулой изобретения, эффективного для снижения астматических симптомов, при котором антитело может отрицательно регулировать активность IL13 у пациента, снижать бронхиальную гиперчувствительность у пациента и/или снижать эозинофилию в легких субъекта. Изобретение также включает в себя способ ингибирования инфекции респираторно-синцитиального вируса (RSV), содержащий введение субъекту, например, субъекту, который в этом нуждается, ингибирующего количества антитела в соответствии с изобретением, описанным в формуле.

Антитело изобретения может быть введено одним или несколькими путями, в том числе внутривенно, интраперитонеально, ингаляцией, внутримышечно, подкожно или перопально. Изобретение включает в себя приспособление для ингаляции, которое доставляет пациенту терапевтически эффективное количество антитела в соответствии с изобретением, описанным в формуле.

Изобретение включает в себя способ обнаружения белка интерлейкин-13 у субъекта, например, у пациента, страдающего от аллергического заболевания, предусматривающий, например, шаги, позволяющие антителу заявляемого изобретения контактировать с пробой; и обнаружения интерлейкина-13 посредством появления иммунной реакции. Описывают также способы диагностирования сверхэкспрессии IL13 у субъекта, предусматривающие этапы (а) получения пробы от субъекта; (b) объединение пробы с антителом в соответствии с заявляемым изобретением в условиях, которые делали бы возможной иммунную реакцию с IL13 и (с) определения, является ли IL13 сверхэкспрессированным или нет относительно нормального уровня экспрессии IL13.

Изобретение включает в себя способ продуцирования антител заявляемого изобретения, предусматривающий этапы а) создания иммуногенной композиции, содержащей компонент гликозилированного IL13 и иммуногенный компонент; b) изготовления инъецируемого раствора, содержащего указанный иммуногенный компонент в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), и адъювант; с) иммунизации мыши с использованием указанного инъецируемого раствора путем комбинирования внутривенных и внутрибрюшинных инъекций, а) продуцирования гибридомы слиянием клетки селезенки из указанной иммунизированной мыши с клеткой миеломы; е) селекции гибридомы, продуцирующей антитело, имеющего характеристики антитела, заявленного в изобретении; и f) выделения указанного антитела.

Изобретение включает в себя способ ингибирования продукции IgE-антитела у пациента, который предусматривает введение пациенту эффективного количества продукции IgE-антитела, ингибирующее эффективное количество антител в соответствии с заявленным изобретением. Ингибирование продукции IgE-антител может предупредить бронхиальную астму, аллергические риниты, аллергические дерматиты и анафилаксию, а также лечить бронхиальную астму, аллергические риниты, аллергическую реакцию (uticaria), и атопические дерматиты.

Изобретение включает в себя способ лечения у пациента нарушения опосредованного IL13, содержащий введение пациенту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с заявленным изобретением, при котором указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибируют связывание IL13 с рецептором и ингибируют одну или несколько функций, ассоциированных со связыванием интерлейкина с указанным рецептором.

Изобретение включает в себя способ лечения у пациента нарушения опосредованного IgE, содержащий введение пациенту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с заявленным изобретением, при котором указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент ингибируют связывание IL13 с его рецептором и ингибируют одну или несколько функций, связанных со связыванием интерлейкина с указанным рецептором.

Изобретение включает в себя способ снижения тяжести астмы у млекопитающих, содержащий введение млекопитающим терапевтически эффективного количества анти-IL13 моноклонального антитела, имеющего, по меньшей мере, одну из следующих характеристик: способность связывать человеческий IL13 с К_Д между приблизительно от 1×10¹⁰ до приблизительно 1×10¹² М; способность ингибировать одну или несколько функций, ассоциированных со связыванием интерлейкина IL13 с рецептором IL13; и неспособность антитела связывать мышиный IL13.

Заболевания и/или состояния, опосредованные IL13, которые рассматривают в изобретении, включают в себя, но не ограничиваясь, аллергическую астму, неаллергическую (эндогенную) астму, аллергические риниты, атопические дерматиты, аллергические конъюнктивиты, экзему, утикарию, пищевые аллергии, хроническое обструктивное легочное заболевание, язвенные колиты, инфекции, вызванные респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), увеиты, склеродерму и остеопорозы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг.1 изображает связывание анти-IL13 моноклональных антител с человеческим IL13.

Фиг.2 изображает связывание анти-IL13 моноклональных антител с мутантным IL13-FC.

Фиг.3 иллюстрирует, что не существует ингибирования связывания MAb 228 В/С-1 с человеческим IL13 моноклональными антителами MAb JES10-5A2 (Pharmingen).

Фиг.4 иллюстрирует эффект анти-IL13 моноклональных антител на пролиферацию клеток L-1236 лимфомы Ходжкина.

Фиг.5 иллюстрирует эффект анти-IL13 моноклональных антител на IL13-индуцированную супрессию экспрессии CD14 в моноцитах человека.

Фиг.6 иллюстрирует эффект анти-IL13 моноклональных антител на IL13-индуцированную позитивную регуляцию экспрессии CD23 в моноцитах человека.

Фиг.7 иллюстрирует эффект анти-IL-13 моноклональных антител на IL13-индуцированное фосфорилирование STAT6 в клетках ТНР-1.

Фиг.8 изображает аминокислотную последовательность областей VH и VL моноклонального антитела 228 В/С-1.

Фиг.9 изображает аминокислотную последовательность областей VH и VL моноклонального антитела 228А-4.

Фиг.10 изображает аминокислотную последовательность областей VH и VL моноклонального антитела 227-26.

Фиг.11 изображает последовательности вариабельных областей легкой цепи для гуманизации моноклонального антитела 228 В/С-1. Клоны от В до R представляют клоны, тестированные с помощью матрицы 2 человека для VK и мышиной VH. Конструировали клоны HT2-NEW и HT2-DP27 с каркасными областями человека как для VK, так и для VH.

Фиг.12 изображает последовательности, соответствующие тяжелой цепи клонов на Фигуре 11.

Фиг.13 А-Е изображают ELISA-профили для комбинаторных гуманизированных кадидатов.

Фиг.14 А изображает ELISA-профили для 89 Vk/276G. Фиг.14 В изображает результаты ELISA-теста для конструкции FL 115Vk/73Vh FL.

Фиг.15 изображает последовательности кадидатов комбинаторной библиотеки.

Фиг.16 изображает профиль конкурентного связывания для двух кандидатов (CL5 и CL-13), показанный в сравнении с химерным кандидатом (228 В/С #3) при связывании с IL13. Посторонний Fab является 51, который демонстрирует отсутствие способности к конкуренции.

Фиг.17 изображает последовательности трех аффинно-созревших кандидатов.

Фиг.18 показывает упорядочение последовательностей белка IL13.

Фиг.19 изображает связывающий эпитоп Mab 228B/C-1.

Фиг.20 изображает варианты CDR и соответствующие им последовательности SEQ ID Nos.

Фиг.21 изображает последовательности вариабельной легкой цепи и вариабельной тяжелой цепи для селекции кандидатов рекомбинантных антител.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами, клеточными линиями, векторами или реагентами, описанными здесь, поскольку они могут варьировать. Кроме того, терминологию в изобретении используют только с целью описания конкретных вариантов воплощения изобретения, и она не предназначена для ограничения рамок данного изобретения. Как используют здесь и в приложенной формуле изобретения, формы единственного числа "a", "an" и "the" включают в себя множественные ссылки, если контекст ясно не предписывает иначе, например, ссылка на «клетку-хозяин» включает в себя множественность таких клеток хозяина.

Если не определено иначе, все технологические и научные термины и акронимы, используемые здесь, имеют те же значения, что обычно подразумеваются любым из специалистов в области изобретения. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные таковым, описанным здесь, могут быть использованы в практике данного изобретения, типичные способы, устройства и материалы описывают здесь.

Все патенты и публикации, упомянутые здесь, включенные в виде ссылок для полноты, разрешенные законом с целью описания и раскрытия белков, ферментов, векторов, клеток-хозяина, и методологий, изложенных здесь, которые могут быть использованы вместе с настоящим изобретением. Однако, ничего здесь не должно быть рассмотрено в виде признания того, что изобретение является дающим право предсказания такого раскрытия на основании предшествующего изобретения.

Иммуноген

Рекомбинантный IL13 использовали для иммунизации мышей для выработки гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела изобретения. Рекомбинантный IL13 является коммерчески доступным из ряда источников (см., например, R&D Systems, Minneapolis, MM., PeproTech, Inc., NJ, и Sanofi Bioindustries, Inc., Tervose, PA.). Альтернативно, ген или кДНК, кодирующие IL13, могут быть клонированы в плазмиде или другом экспрессионном векторе и экспрессированы в любой из ряда экспрессирующих систем в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области. Способы клонирования и экспрессии IL13 и последовательность нуклеиновой кислоты для IL13 являются хорошо известными (см., например, патент США N 5652123). Из-за вырожденности генетического кода может быть продуцировано множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды IL13. Можно варьировать нуклеотидную последовательность селекцией комбинаций на основе случайных выборов кодонов. Такие комбинации делают в соответствии со стандартным триплетным генетическим кодом применительно к нуклеотидной последовательности, которая кодирует встречающийся в природе полипептид IL13, и все такие вариации необходимо рассмотреть. Любой из этих полипептидов может быть использован в иммунизации животного для получения антител, которые связываются с IL13.

Иммуногенный IL13-полипептид может, если это выгодно, быть экспрессирован в виде слитого белка, который имеет IL13-полипептид прикрепленный к сливающемуся сегменту. Слитый сегмент часто помогает в очистке белка, например, давая возможность слитому белку быть выделенным и очищенным аффинной хроматографией. Слитые белки могут быть произведены культивированием рекомбинантной клетки, трансформированной слитой последовательностью нуклеиновых кислот, которая кодирует белок, в том числе слитый отрезок, присоединенный или к карбоксильному и/или аминоконцевому концу белка. Слитые отрезки могут включать в себя, но не ограничиваться, Fc-области иммуноглобулина, глутатион-S-трансферазу, β-галактазидазу, поли-гистидиновый фрагмент, обеспечивающий связывание с ионами двухвалентных металлов, и мальтозо-связывающий белок.

Типичные полипептиды содержат всю или часть последовательности SEQ ID NO:1 или ее варианты, или SEQ ID NO: 2, в которой 13 аминокислотой является Хаа и может быть заменена, исходя из мол. массы, например, глутаминовая кислота на лизин.

Слитый белок, содержащий мутантную форму человеческого IL13, использовали для получения антител данного изобретения. Эта мутантная форма IL13, содержащая единичную мутацию, приводящую к инактивированной форме белка (Thompson et al., J. Biol. Chem. 274: 2994 (1999)). Для создания нейтрализующих антител с высокой аффинностью слитый белок, содержащий мутантный белок IL13, сливали с Fc иммуноглобулинов, конкретно IgG1, и экспрессировали в клеточной линии млекопитающих, так чтобы рекомбинантный белок был гликозилирован естественным образом. Fc-фрагмент слитого белка может обеспечить конформационную структуру, которая экспонирует ключевой эпитоп.Гликозилирование может иметь повышенную иммуногенность эпитопа, позволяющую образование антител к конкретному эпитопу.

IL13-полипетиды, экспрессированные в E. coli, негликозилированы и коммерчески доступные тестированные антитела были произведены с использованием этого белка. Авторы тестировали эти антитела, например, R&D Systems и Pharmingen, и обнаружили, что антитела, произведенные с помощью иммуногена, продуцированного в Е.coli, не дают перекрестную реакцию с эпитопом, связанным антителами данного изобретения.

Производство антител

Антитела изобретения могут быть произведены любым из подходящих способов, известным в данной области. Антитела изобретения могут содержать поликлональные антитела. Способы приготовления поликлональных антител известны специалистам в данной области (Hariow, et al., Antibodies: a Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), которая внедрена сюда в виде ссылки в ее полноте).

Например, иммуноген, как описано выше, может быть введен различным животным-хозяевам, в том числе, но, не ограничиваясь, кроликам, мышам, крысам и т.д., для индукции образования антител специфичных к антигену. Введение иммуногена может быть связано с одной или несколькими инъекциями иммунизирующего агента и, если желательно, адъюванта. Различные адъюванты могут быть использованы для усиления иммунологического ответа в зависимости от вида хозяина и включают, но не ограничиваются, адъювант Фрейнда (полный или неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол и потенциально полезные адъюванты человека, такие как БЦЖ (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Дополнительные примеры адъювантов, которые могут быть использованы, включают в себя адъювант MPL-TDM (монофосфориллипид А, синтетический трегалозодикориномиколат). Процедуры иммунизации являются хорошо известными в данной области и могут быть исполнены любым способом, который вызывает иммунный ответ в выбранном животном-хозяине. Адъюванты также являются хорошо известными в данной области.

Типично, иммуноген (с адъювантом или без адъюванта) инъецируют внутрь млекопитающего подкожными или внутрибрюшинными инъекциями, или внутримышечно или внутривенно. Иммуноген может включать в себя IL13-полипептид, слитый белок или их варианты. В зависимости от природы полипептидов (то есть, степени гидрофобности, степени гидрофильности, стабильности, суммарного заряда, изоэлектрической точки и т.д.) может быть полезным конъюгирование иммуногена с белком, который известно, что является иммуногенным при иммунизации млекопитающих. Такое конъюгирование включает в себя или химическую конъюгацию путем дериватизации активных химических функциональных групп как к иммуногену, так и к иммуногенному белку, который должен быть конъюгирован, так что образуется ковалентная связь, или посредством методологии, основанной на слиянии с белком, или другими способами, известными специалистам в данной области. Примеры таких иммуногенных белков включают в себя, но не ограничиваются, гемоцианин лимфы улитки, овальбумин, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин, соевый ингибитор трипсина и смешанные Т-хелперные пептиды. Различные адъюванты могут быть использованы для усиления иммунологического ответа, как описывают выше.

Антитела изобретения содержат моноклональные антитела. Моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием гибридомной технологии, такой как технология, описанная Kohler и Milstein, Nature, 256:495 (1975), и патент США N 4376110, и Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2 sup. nd. ed. (1988), и Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., (1981)), или другими способами, известными специалистам. Другие примеры методов, которые могут быть применены для производства моноклональных антител, включают в себя, но не ограничиваются, технологию В-клеточной гибридомы человека (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030), и способ гибридомы EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., стр.77-96). Такими антителами могут быть любые из класса иммуноглобулинов в том числе IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любой их подкласс. Гибридома, продуцирующая Mab данного изобретения, может быть культивирована in vitro или in vivo.

С использованием типичных гибридомных технологий, хозяин, например, мышь, гуманизированная мышь, мышь с иммунной системой человека, хомяк, кролик, верблюд или любое другое подходящее животное-хозяин типично иммунизируют с использованием иммуногена для извлечения лимфоцитов, которые продуцируют или являются способными продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с IL13. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы с помощью антигена in vitro.

В общих чертах, в создании антителопродуцирующих гибридом, используют или лимфоциты периферической крови ("PBLs"), если необходимы клетки человеческого происхождения, или используют клетки селезенки, или клетки лимфатических узлов, если необходимы источники млекопитающих, не имеющих отношения к человеку. Затем лимфоциты сливают с иммортализованными клеточными линиями с использованием агента, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, для образования гибридомной клетки (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), стр.59-103), Иммортализованные клеточные линии являются обычно трансформированными клетками млекопитающих, конкретно миеломными клетками грызуна, бычьими, или клетками человеческого происхождения. Типично используют миеломную клеточную линию мышей или крыс. Гибридомные клетки могут быть культивированы в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, иммортализованных клеток. Например, если родительские клетки теряют фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом типично будет включать в себя гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("НАТ-среда), вещества, которые препятствуют росту HGPRT-дефицитных клеток.

Предпочтительными иммортализованными клеточными линиями являются линии, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антитела при помощи отобранных антитело-продуцирующих клеток и являются чувствительными к среде, такой как НАТ-среда. Более предпочтительными иммортализованными клеточными линиями являются линии миеломы мышей, которые могут быть получены, например, из Salk Institute Cell Distribution Centre, San Diego, Calif, и Американской коллекции типовых культур, Manassas, Va. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мишь/человек также могут быть использованы для производства моноклональных антител человека (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Appliations, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) стр.51-63).

Культуральная среда, в которой культивируют гибридомные клетки, может быть проанализирована на наличие моноклональных антител, направленных против IL13. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, определяют, например, иммунопреципитацией или анализом связывания in vitro, таким как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазным иимуноферментным анализом (ELISA). Такие технологии являются известными в данной области и среди специалистов. Аффинность связывания моноклонального антитела с IL13 может, например, быть определена Скэтчардовским анализом (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)).

После идентификации желаемых гибридомных клеток клоны могут быть субклонированы методами серийных разведении и выращены стандартными способами (Goding, как сказано выше). Подходящая культуральная среда для этой цели включает в себя, например, среду Dulbecco's Modified Eagle's Medium и RPMI-1640. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, могут быть выделены или очищены из культуральной среды общепринятыми способами очистки иммуноглобулинов, например, протеин-А-сефарозой, хроматографией на гидроксиапатите, гель-проникающей хроматографией, гель-электрофорезом, диализом или аффинной хроматографией,

Различные способы существуют в области производства моноклональных антител и, таким образом, изобретение не ограничивается их исключительным производством в гибридомах. Например, моноклональные антитела могут быть изготовлены способами рекомбинантной ДНК, такими как описанные в патенте США N 4816567. В данном контексте термин «моноклональное антитело» относится к антителу, произведенному из одиночного эукариотического, фагового или прокариотического клона. ДНК, кодирующая моноклональные антитела изобретения может быть легко выделена и секвенирована с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны связываться специфически с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител, или подобные цепи из человеческих, гуманизированных или других источников). Гибридомные клетки изобретения служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. Выделенна