Антитела против 5т4 и их применение

Антитела против 5т4 и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №60/891,248, поданной 23 февраля 2007 и предварительной заявке на патент США №60/781,346, поданной 10 марта 2006, каждая из которых полностью включена в данное описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится главным образом к антителам против 5Т4 и конъюгатам антител с лекарственным препаратом (т.е. иммуноконъюгатам) для диагностики и/или лечения новообразований и злокачественных опухолей. Настоящее изобретение также относится к изолированными нуклеиновым кислотам, кодирующим вариабельную область антитела и полипептидам указанной области для приготовления антител против 5Т4 и конъюгатов антител с лекарственным препаратом.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Доступность высокоаффинных моноклональных антител сделала возможным развитие направленной иммунотерапии. В соответствии с этим подходом терапевтическое средство соединяют с антителом, характеризующимся специфичностью связывания с определенной совокупностью клеток-мишеней. Терапевтические средства, которые конъюгируют с моноклональными антителами, включают цитотоксины, биологические модуляторы, ферменты (например, рибонуклеазы), вызывающие апоптоз белки и пептиды, и радиоизотопы. Конъюгаты антитела с цитотксином обычно называют иммуноцитоксинами. Антитела, связанные с низкомолекулярными лекарственными средствами, как например метотрексатом, обычно называются конъюгатами химиоантител с лекарственным средством. Конъюгаты, представленные как иммуномодуляторы, содержат модификаторы биологического ответа, такие как лимфокины (гуморальные межклеточные пептиды), факторы роста и комплемент-активирующий фактор яда змей (cobra venom factor, CVF). Антитела, меченные радиоактивными изотопами, включают радиоактивные изотопы, которые могут применяться как для целей радиотерапии, так и в качестве контраста.

Доставка лекарственного средства в опухолевые клетки с помощью антител увеличивает эффективность лекарственного средства посредством снижения его проникновения в здоровые ткани. См., например: Reffet al. (2002) Cancer Control 9:152-66; Sievers (2000) Cancer Chemother. Pharmacol. 46 Suppl:S18-22; Goldenberg (2001) Cut. Rev. Oncol. Hematol. 39:195-201. MY-LOTARG® (гемтузумаб озогамицин) является коммерчески доступным средством таргетной иммунотерапии, которое действует согласно вышеописанному принципу и которое допущено к применению при лечении острой миелоидной лейкемии у пожилых пациентов. См. Sievers et al. (1999) Blood 93:3678-84. В этом случае, таргетная молекула представляет собой моноклональное антитело против CD33, которое связано с калихеамицином.

Тем не менее, применение таргетной иммунотерапии на человеке было ограничено, частично вследствие побочного действия, связанного с моноклональными антителами, полученными от других животных. Ранние клинические попытки использования антител, полученных от грызунов, выявили ответную выработку организмом человека антител к антителам, полученным от мышей (МАМА) и антителам, полученным от крыс (HARA), что служило причиной быстрого клиренса антител. Впоследствии разработали менее иммуногенные антитела, которые включают гибридные антитела, гуманизированные антитела, PRIMATIZED® антитела и человеческие антитела, полученные посредством применения трансгенных библиотек мышей или бактериофагов. Смотри: Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-5; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33; Newman et al. (1992) Biotechnology (NY) 10:1455-60; Green et al. (1994) Nat. Genet. 7:13-21; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-97. Исключение НАМА ответа допускает применения для достижения терапевтического эффекта высоких и повторных доз.

Отобранные антитела для направленного действия лекарственного средства включают антитела, которые распознают карциноэмбриональные антигены, то есть антигены, которые присутствуют в эмбриональных клетках и опухолевых клетках, и которые почти отсутствуют в нормальных клетках взрослых людей. См., например, Magdelenat (1992) J. Immunol. Methods 150:133-43. Карциноэмбриональный антиген 5Е4 является высоко гликозилированным трансмембранным гликопротеином с молекулярным весом 72 kDa, который включает 42 kDa негликолизированное ядро. (Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57:239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45:179-84; международная заявка WO89/07947; Патент США №5,869,053). 5Т4 содержит внеклеточный домен, который характеризуется двумя богатыми лейцином повторами (LRRs) и промежуточной гидрофильной областью, которая является доступным сайтом для таргетной терапии (Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9319-24).

Человеческий 5Т4 экспрессируется в многочисленных типах рака, включающих карциномы мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, эндометрия, легкого, пищевода, яичника, поджелудочной железы, желудка, яичек, и в основном отсутствует в нормальных тканях, за исключением синцитиотрофобластов в плаценте (см., например: Southall et al. (1990) Br. J. Cancer 61:89-95 (иммуногистологическое распределение 5Т4 антигена в нормальных и злокачественных тканях); Mieke et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:1923-1930 (низкая межклеточная адгезия молекулы 1 и высокая экспрессия 5Т4 в опухолевых клетках коррелирует с свободной от болезни выживаемостью больных раком кишечника); Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69: 899-902 (прогностическая значимость экспрессии 5Т4 карциноэмбрионального антигена в раке кишечника; Starzynska et al. (1992) Br. J. Cancer 66:867-869 (экспрессия антигена 5Т4 при раке кишечника и раке желудка); Jones et al. (1990) Br. J. Cancer 61:96-100 (экспрессия антигена 5Т4 при раке шейки матки); Connor и Stern (199) Int. J. Cancer 46:1029-1034 (утрата МНС (главный комплекс гистосовместимости, ГКГС) экспрессии класса-I при раке шейки матки), Ali et al. (2001) Oral Oncology 37:57-64 (модель экспрессии карциноэмбрионального антигена 5Т4 в нормальной, дисплазированной и злокачественно поврежденной слизистой оболочке рта); WO 89/07947; Патент США №5,869,053). Например, ткани, которые описаны как не имеющие экспрессии 5Т4, включают печень, кожу, селезенку, тимус, центральную нервную систему (ЦНС), надпочечники и яичники. Ткани, которые описаны как имеющие очаговую или низкую экспрессию 5Т4, включают: печень, кожу, селезенку, лимфатические узлы, миндалины, простату и семенные пузырьки. Слабая и умеренная экспрессия 5Т4 была описана для почки, легкого, поджелудочной железы, глотки и желудочно-кишечного тракта. Синцитиотрофобласт является единственной тканью, о которой сообщали, что она имеет высокую экспрессию 5Т4; 5Т4 также отсутствует в нормальной сыворотке крови или сыворотке крови беременных женщин (т.е. уровни менее 10 нг/мл). Сверхэкспрессия 5Т4 в опухолевых тканях была поставлена в зависимость с развитием заболевания и в качестве способа, пригодного для выявления пациентов с краткосрочными прогнозами была предложена оценка экспрессии 5Т4. (Mulder et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:1923-30, Naganuma et al. (2002) Anticancer Res. 22:1033-1038, Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69:899-902, Starzynska et al. (1998) Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 10:479-484, Wrigley et al. (1995) Int. J. Gynecol. Cancer 5:269-274).

Описано несколько антител против 5Т4, включая mAb5T4, которое также называют антителом Н8, которое различает конформационный эпитоп антигена 5Т4 (Shaw et al. (2002) Biochem. J. 363:137-45, WO 98/55607), моноклональное антитело крысы (Woods et al. (2002) Biochem. J. 366:353-65) и моноклональное антитело мыши, именуемое 5Т4 (Патент США №5,869,053). Также описаны антитела против 5Т4, имеющие одну цепь, а также гибридные белки, которые включают последовательности антител против 5Т4, сшитых с терапевтической молекулой. Например, последовательности антител к 5Т4, сшитые с константным доменом IgG1 человека или внеклеточным доменом В7.1 мыши, вызывают цитолиз 5Т4-экспрессирующих линий опухолевых клеток. (Myers et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9:884-896, Shaw et al (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524:238-246; Заявка на патент США №2003/0018004). Аналогично, антитело против 5Т4 с одной цепью, сшитое с суперантигеном может стимулировать Т клеточно-зависимый цитолиз в клетках легочной карциномы in vitro. (Forsberg et al. (2001) Br. J. Cancer 85: 129-136). Первая фаза клинических испытаний применения PNU-214936, Fab фрагмента моно-клонального антитела 5Т4, сшитого с мутированным суперантигеном (антигеном с резко повышенной иммуногенностью) стафилококкового энтеротоксина A (SEA), выявили ограниченную токсичность и определенный противоопухолевый ответ (Cheng et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22(4) 602-9). Рекомбинантные 5Т4 вакцины также предложены как вариант терапии при лечении рака (Mulryan et al. (2002) Mol. Cancer Ther. 1: 1129-37; патенты США№2,370,571 и 2,378,704; ЕР 1,160,323 и 1,152,060).

Задачей настоящего изобретения является создание новых антител против 5Т4, конъюгатов антител против 5Т4 с лекарственным средством, способы получения предложенных антител и конъюгатов антител с лекарственным средством и способы их применения в диагностике и терапии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает новые антитела против 5Т4, конъюгаты на их основе и способы применения вышеупомянутых объектов. Также предлагаются изолированные полипептиды против 5Т4 и кодирующие их изолированные последовательности нуклеиновых кислот.

Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, которые специфично связывают антиген 5Т4 человека, причем антитело (а) содержит антигенсвязывающий домен антител А1, А2, A3 мыши; (б) конкурирует за связывание 5Т4 с антителами А1, А2, A3 мыши; (в) связывает эпитоп 5Т4, с которым связываются антитела А1, А2, A3 мыши; или (г) содержит в себе 5Т4-связывающий фрагмент антител (а)-(в). Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут быть гибридными, гуманизированными, одноцепочечными, Fab фрагментом, F(ab)2 фрагментом, Fv фрагментом, четырехмерными, четырехвалентными, полиспецифическими, домен-специфичными, однодоменным антителом, рекомбинантным белком или моноклональными телами мыши. Например, гуманизированные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область с высокомолекулярной цепью и по меньшей мере одну вариабельную область с низкомолекулярной цепью, в которых гуманизированное антитело или фрагмент антитела: (а) содержит антигенсвязывающий домен мышиных антител А1, А2, A3; (б) конкурирует за связывание 5Т4 с мышиными антителами А1, А2, A3; (в) связывает эпитоп 5Т4, который связывают антитела А1, А2, A3; или (г) 5Т4-связывающий фрагмент антител (а)-(в).

Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению имеют сродство связывания антигена 5Т4 человека по меньшей мере от порядка 1×10^-7 Моль до порядка 1×10^-12 Моль. Заявленные антитела против 5Т4 и их конъюгаты могут также проявлять специфичное сродство в отношении 5Т4-экспрессирующих клеток in vivo.

Типичные представители антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую (а) последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична остаткам 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (в) последовательность остатков аминокислот 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 86% идентична остаткам 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (д) последовательность остатков аминокислот 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична остаткам 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (ж) последовательность аминокислотных любой из последовательностей SEQ ID №:49, 51, 52, 54, 56, 77, 78, 81, или 82; (з) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична последовательности SEQ ID №:51; (и) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 78% идентична последовательности SEQ ID №:54; (к) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична последовательности SEQ ID №:77; (л) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 79% идентична последовательности SEQ ID №:78; (м) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID №:81; или (н) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 78% идентична последовательности SEQ ID №:82.

Типичные представители антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, которые содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую (а) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 94% идентична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (в) последовательность остатков аминокислот 23-130 последовательности SEQ ID №:8; (г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 96% идентична остаткам 23-130 последовательности SEQ ID №:8; (д) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №:12; (е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 98% идентична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:12; (ж) последовательность аминокислот любой из последовательностей SEQ ID №:58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 80, 83, или 84; (з) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 83% идентична последовательности SEQ ID №:60; (и) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 93% идентична последовательности SEQ ID №:70; (к) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID №:76; (л) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID №:76; (м) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 88% идентична последовательности SEQ ID №:79; (н) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 84% идентична последовательности SEQ ID №:80; (о) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID №:83; или (п) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична последовательности SEQ ID №:84.

Например, антитело против 5Т4 может включать (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2; и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (б) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из остатков 19-135 последовательности SEQ ID №:6; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из групп 23-130 последовательности SEQ ID №:8; или (в) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из групп 20-141 последовательности SEQ ID №:10; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из групп 21-127 последовательности SEQ ID №:12.

Гибридные и гуманизированные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут содержать константные области, происходящие из константных областей человека, такие как например, константная область легкой цепи антитела человека, полученная из константной области легкой цепи каппа человека и константная область тяжелой цепи антитела человека, полученная из константной области тяжелой цепи IgG1 или IgG4 человека.

Типичные представители антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, которые содержат (а) каркасные области, включающие остатки каркасной области антител человека; и (б) один или более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи с последовательностью SEQ ID №:4, 8, или 12; или один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №:2, 6, или 10. Например, остатки каркасной области антител человека могут включать (а) каркасную область легкой цепи антитела человека из клона DPK24 подгруппы IV зародышевой линии, клона зародышевой линии подгруппы VHIII (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21) или подгруппы VHI (DPK9, DPK1, O2, DPK7); (б) каркасную область тяжелой цепи антитела человека, выбранную из группы, состоящей из DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8 (VH1-2), DP-25, VI-2b и VI-3 (VH1-03), DP-15 и V1-8 (VH1-08), DP-14 и V1-18 (VH1-18), DP-5 и V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 и YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 и DA-8 (VH1-f); (в) консенсусную последовательность каркасных областей тяжелой цепи (б); или (г) каркасную область, которая по меньшей мере на 63% идентична каркасной области (а)-(в).

Типичные представители гуманизированных антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут также включать два и более гипервариабельных участка с последовательностью: SEQ ID №:2, 4, 6, 8, 10, или 12, как например, два или три гипервариабельных участка вариабельной области легкой цепи, которые имеют последовательность: SEQ ID №:4, 8 или 12; или два или три гипервариабельных участка вариабельной области тяжелой цепи, которые имеют последовательность: SEQ ID №:2, 4 или 10; или один и более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, который имеет последовательность: SEQ ID №:4, 8 или 12 и один и более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность: SEQ ID №:2, 6 или 12

Типичные представители гибридных и гуманизированных антител против 5Т4 включают антитела, которые содержа последовательность вариабельной области тяжелой цепи, включающую (а) последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична остаткам аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (в) последовательность остатков аминокислот 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 86% идентична остаткам аминокислот 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (д) последовательность остатков аминокислот 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична остаткам аминокислот 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (ж) последовательность остатков аминокислот 1-119 последовательности SEQ ID №:49; (з) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 90% идентична остаткам аминокислот 1-119 последовательности SEQ ID №:49; или последовательность аминокислот гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи, изображенную на Рисунках 9А-9С.

Дополнительные гибридные и гуманизированные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую нуклеиновой кислотой, которая содержит: (а) последовательность нуклеотидов 58-414 последовательности SEQ ID №:1; (б) последовательность нуклеотидов 55-405 последовательности SEQ ID №: 5; (в) последовательность нуклеотидов 58-423 последовательности SEQ ID №: 9; (г) последовательность нуклеотидов 1-358 последовательности SEQ ID №: 48; (д) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области гуманизированных антител А1, А2 или A3, изображенные на Фигуре 9А-9С; (е) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидной последовательности любой из последовательностей (а) - (д); или (ж) нуклеиновую кислоту, которая специфически гибридизируется с комплементом любой из (а) - (д) при строгих условиях гибридизации.

Типичные гибридные и гуманизированные антитела против 5Т4 включают антитела, содержащие последовательность вариабельной области легкой цепи, которпая содержит: (а) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 4; (б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 94% идентична остаткам аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 4; (в) последовательность остатков аминокислот 23-130 последовательности SEQ ID №: 8; (г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 96% идентична остаткам аминокислот 23-130 последовательности SEQ ID №: 8; (д) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 12; (е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 98% идентична остаткам аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 12; или (ж) последовательности аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированных антител А1, А2 и A3, изображенные на Рисунках 9А-9С.

Также предложены конъюгаты антител с лекарственным средством для лекарственных форм, включающие (а) гибридное или гуманизированное антитело против 5Т4 или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению; и (б) лекарственное средство, которое прямо или косвенно связано с указанным антителом. Типичные лекарственные средства включают терапевтические агенты, такие как цитотоксины, радиоизотопы, иммуномодуляторы, антиангиогенные средства, антипрофилеративные средства, проапоптические средства, химиотерапевтические средства и нуклеиновые кислоты, применяемые в терапевтических средствах. Цитотоксином, например, может быть антибиотик, ингибитор полимеризации тубилина, алкилирующий агент, ингибитор синтеза белка, ингибитор протеин киназы, ингибитор фосфатазы, ингибитор топоизомеризы или фермент. Цитотоксины-антибиотики, такие как калихеамицин, N-ацетил-γ-калихеамицин или его производные, такие как N-ацетил-γ-калихеамицин диметилгидразид, особенно эффективны в противораковой терапии.

Предложенные конъюгаты антитела против 5Т4 с лекарственным средством могут включать линкер для связывания антитела с лекарственным средством. Типичные линкеры включают 4-(4'ацетилфенокси)масляную кислоту (AcBut), 3-ацетилфенилфенилуксусную кислоту (АсРас) и 4-меркапто-4-метилвалериановую кислоту (Amide). Конъюгаты антитела с лекарственным средством также включают полиэтитенгликоль и другие вещества, применяемые для увеличения включения лекарственного вещества.

Для доставки лекарственного средства в 5Т4-экспрессирующие клетки настоящее изобретение предлагает способы, согласно которым клетки приводят в контакт с конъюгатом антитела с лекарственным средством, включающим (i) гибридное или гуманизированное антитело против 5Т4 и (ii) лекарственное средство, которое прямо или косвенно связано с гуманизированным антителом против 5Т4. В соответствии с предложенными способами лекарственное средство интернализируется в клетку-мишень. В данной заявке также предлагаются способы терапии, которые включают введение субъекту, имеющему 5Т4-положительную форму рака, терапевтически эффективного количества конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством, включающего (i) гибридное или гуманизированное антитело против 5Т4 или фрагмент антитела и (ii) терапевтическое средство, которое прямо или косвенно связано с гуманизированным антителом против 5Т4 или фрагментом антитела. С целью усиления эффективности терапия против 5Т4 согласно настоящему изобретению может быть совмещена с любыми другими известными терапевтическими способами. Второй терапевтический агент можно применять в сочетании с конъюгатом антитела против 5Т4 с лекарственным средством параллельно или последовательно в любом порядке.

Также предложены изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированные вариабельные области антител против 5Т4, которые можно применять для производства предложенных гуманизированных антител против 5Т4. Типичные нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи антитела против 5Т4 включают: (а) последовательность нуклеотидов 58-414 последовательности SEQ ID №:1; (б) последовательность нуклеотидов 55-405 последовательности SEQ ID №:5; (в) последовательность нуклеотидов 58-423 SEQ ID №:9; (г) последовательность, кодирующую одну из последовательностей SEQ ID №:48, 50, 53, или 55; (д) последовательность нуклеотидов, которая на 89% идентична последовательности SEQ ID №:50, если охват запроса 100%; (е) последовательность нуклеотидов, которая на 82% идентична последовательности SEQ ID №:53, если охват запроса 100%; или (ж) нуклеиновую кислоту, которая специфично гибридизуется с комплементом любой из последовательностей из (а) - (г) при строгих условиях гибридизации. Типичные нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированную вариабельную область легкой цепи антитела против 5Т4 включают (а) последовательность нуклеотидов 61-381 последовательности SEQ ID №:3; (б) последовательность нуклеотидов 67-390 последовательности SEQ ID №:7; (в) нуклеотидную последовательность нуклеотидов 61-381. последовательности с идентификационным номером SEQ ID №:11; (г) последовательность кодирующую гуманизированные вариабельные области легкой цепи антител А1, А2, или A3 любой из последовательностей SEQ ID №:57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, или 75; (д) последовательность нуклеотидов, которая на 84% идентична последовательности SEQ ID №:59, если охват запроса 100%; (е) последовательность нуклеотидов, которая на 86% идентична последовательности SEQ ID №:69, если охват запроса 100%; (ж) последовательность нуклеотидов, которая на 85% идентична последовательности SEQ ID №:75, если охват запроса 100%; или (з) нуклеиновую кислоту, которая специфично гибридизуется с комплементом любой из последоваетльностей (а) - (г) при строгих условиях гибридизации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАЦИЙ

На Фиг.1А-1С изображены последовательности нуклеотидов и аминокислот вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи мышиных антител А1, А2, и A3 против 5Т4. Последовательности аминокислот снабжены комментариями для распознавания дополнительных гипервариабельных участков (CDR) путем подчеркивания и главная последовательность - путем двойного подчеркивания.

На Фиг.2 изображен вестерн-блот, приготовленный с использованием СТ26/5Т4 клеточных лизатов и протестироованный с указанными антителами.

На Фиг.3А-3В приведены линейные графики, на которых показана зависимость кривой отклика и кинетики связывания для двух независимых препаратов Н8 и А1 антител.

На Фиг.4А-4С приведены линейные графики, которые показывают модуляцию активности Н8, А1, А2, и A3 антител клетками MDAMB435/5T4. Уровни антитела на поверхности клетки уменьшаются со временем (Фигуры 4А, 4С (закрашенные точки)), в то время как уровень антитела в надосадочной жидкости остается постоянным (Фигуры 4В, 4С (незаполненные точки). MCF означает клеточную флюоресценцию; supt, - супернатант (надосадочная жидкость).

На Фиг.5 приведено схематическое изображение конструкта человеческого эктодомена 5Т4 Fc, конструкта эктодомена 5Т4 Fc мыши и конструкта гибридных человек/мышь эктодоменов. Эти структуры применили для картирования антигенных детерминант как это описано в Примере 4.

На Фиг.6А-6В приведены графические результаты конкурирующего связывания Н8 и каждого из обозначенных антител с 5Т4 эктодоменом Fc связанного белка человека. HuH8, гуманизированное Н8 антитело; ChiA1, гибридное А1 антитело; ChiA1+C67F, гибридное А1 антитело, несущее мутацию C67F; ChiA2, гибридное А2 антитело; muA2, А2 антитело мыши; ChiA3, гибридное A3 антитело; ChiA3+C91Y, гибридное A3 антитело, несущее мутацию C91Y, muA3, A3 антитело мыши; No Ab - отсутствие антитела (контроль).

Фиг.7 представляет собой линейную диаграмму, на которой показано связывание эпитопов 5Т4 человека с Н8, А1, А2 и A3. Приведенные остатки представляют собой остатки антигена 5Т4, описанные Майерой и сотр. Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(12):9319-9324, которые также имеются в наличии в Банке генов GenBank Accession № Z29083 (последовательность с индентификационным номером SEQ ID №:87). LRR, дупликация, насыщенная лейцином.

На Фиг.8 приведены результаты сферических анализов, проведенных согласно описанию в примере 6. Конъюгаты антител против 5Т4 с калихеамицином, полученные при использовании антител А1 и A3, значительно подавляют рост 5Т4 экспрессирующих клеток (MDAMB435/5T4) по сравнению с контрольными клетками (MDAMB435/neo). CMA-676, конъюгат антитела против CD33 с калихеамицино; huH8-AcBut-CalichDMH, гуманизированное Н8 антитело, конъюгированное к калихеамицину с помощью 4-(4'-ацетилфенокси)-масляной кислоты (AcBut); CalichDMH, неконъюгированный калихеамицин; А1-AcBut-CalichDMH, антитело А1, конъюгированное к калихеамицину с помощью 4-(4'-ацетилфенокси)-масляной кислоты (AcBut); А3-AcBut-CalichDMH, антитело A3, конъюгированное к калихеамицину с помощью 4-(4'-ацетилфенокси)-масляной кислоты (AcBut).

На Фиг.9А-9Н показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела А1 (huA1 VH) версии 1 (последовательность с идентификационным номером SEQ ID №:48-49); аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела А1 V-версии 1.2 и 2.0, аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела А1 (huA1 VL) версии 1.0, 2.0 и 3.0; аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела А2 (huA2 VH) версии 1.0 и 2.0; аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела А2 (huA2 VL) версии 1.0 и 2.0; аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела A3 (huA3 VH) версии 1.0 и 2.0; и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела A3 (huA32 VL) версии 1.0 и 2.0. CDR (гипервариабельные участки) подчеркнуты.

На Фиг.10А-10В показаны типичные каркасные последовательности Вариабельной области тяжелой цепи, которые можно применять для получения гуманизированных антител против 5Т4. На Рисунке 10А показано правильное относительное расположение последовательностей Вариабельной области тяжелой цепи человека подгруппы 1 (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 14-24) и консенсусные каркасные последовательности, выведенные здесь из (последовательностей с идентификационными номерами SEQ ID №: 25-27). На Рисунке 10 В показаны последовательности генов зародышевой линии человека подгрупп VH 7 и VH 3 (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 88-93).

На Фиг.11 приведено правильное относительное расположение последовательностей вариабельной области легкой цепи чловека подгруппы VкIII (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 29-34). Обведенные в рамку последовательности - CDR (гипервариабельные участки).

На Фиг.12 приведено правильное относительное расположение последовательностей вариабельной области легкой цепи человека подгруппы VкI (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №:35-44). Обведенные в рамку последовательности - CDR (гипервариабельные участки).

На Фиг.13 приведены дополнительные последовательности зародышевой линии подгрупп Vk 1 и Vk IV, которые имеют каркасные участки, которые можно использовать для получения гуманизированных имунноглобулинов против 5Т4 (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 94-99).

На Фиг.14 показаны аминокислотные последовательности типичных С-сегментов человека, которые могут применяться для приготовления гибридных и гуманизированных антител против 5Т4 (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 45-47).

На Фиг.15 показаны аминокислотные последовательности полного 5Т4 антигена яванского макака (cynomolgus monkey - Масаса fascicularis) и неполного антигена 5Т4 чернохвостой мартышки. Подчеркнутые последовательности, главные последовательности. Для каждой последовательности 5Т4 эктодомен содержит аминокислоты 30-356.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Антитела против 5Т4

В настоящем изобретении предложены новые антитела мыши, которые связывают человеческий 5Т4 антиген и которые пригодны для создания таргетной иммунотерапии. Человеческий антиген представляет собой 72 kDa негликолизированный фосфопротеин, обнаруженный на поверхности клеток тробопласта и ряде типов раковых клеток. См. See Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57:239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-184; PCT Международное издание № WO 89/07947; Патент США №5,869,053.

Мышиные антитела согласно настоящему изобретению обозначены А1, А2 и A3 и приготовлены как описано в Примере 1. Также предложены антитела против 5Т4, произведенные от А1, А2 и A3, которые специфически связываются с человеческим 5Т4 антигеном. Например, антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие антиген связывающие остатки из А1, А2 и A3 антител; антитела, которые конкурируют за связывание 5Т4 антигена с А1, А2 и A3 антителами; и антитела, которые связываются с вышеупомянутым 5Т4 эпитопом как А1, А2 и A3 антитела.

В частности, предложенные А1, А2 и A3 антитела каждое содержит антигенсвязывающий сайт, который различает специфичный эпитоп человеческого 5Т4 антигена. Каждое из этих антител также связывается с эпитопом, отлично от эпитопа, связанного Н8, и каждое А1, А2 и A3 не конкурирует с Н8 антителом за связывание с человеческим 5Т4. См. Примеры 4-5 и фиг.6-7. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются антитела, которые специфически связываются с остатками 30-168 человеческого 5Т4 (например, A3), антитела, которые специфически связываются с остатками 224-276 человеческого 5Т4 (например, А1), и антитела, которые специфически связываются с остатками 224-355 человеческого 5Т4 (например, А2). Также предложены человеческие 5Т4 антигены, включающие эпитопы, с которыми связываются антитела А1, А2 и A3. Например, в изобретении предлагаются фрагменты антигена против 5Т4, включающие остатки 30-163, 224-276 и 224-355 нативного или полномерного 5Т4 антигена.

Специфическое связывание предложенных антител против 5Т4 относится к предпочтительному связыванию антитела с 5Т4 антигеном человека в гетерогенном образце, который содержит различные антигены со сложной структурой. Обычно, специфическое связывание имеет место, если сродство связывания составляет по меньшей мере примерно 10^-7 М и более, так например, по меньшей мере, примерно 10^-8 М и более, включая по меньшей мере примерно 10^-9 М и более, по меньшей мере, примерно 10^-11 М и более или, по меньшей мере примерно 10^-12 М и более. Например, специфическое связывание антитела согласно настоящему изобретению с 5Т4 антигеном человека включает связывание в диапазоне от по меньшей мере примерно 10^-7 М до примерно 1×10^-12 М, также как в пределах от примерно 1×10^-8 М до примерно 1×10^-12 М, или в пределах от примерно 1×10^-8 М до примерно 1×10^-11 М, или в пределах от примерно 1×10^-8 М до примерно 1×10^-10 М, или в пределах от примерно 1×10^-9 М до примерно 1×10^-10 М. Специфическое связывание также относится к селективному таргетированию антитела против 5Т4 на 5Т4-экспрессирующие клетки после введения антитела субъекту.

Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут иметь тетрамерную структуру (например, аналогичную встречающимся в природе антителам), или они могут включать любую другую структуру, имеющую хотя бы одну вариабельную область иммуноглобулина легкой цепи или хотя бы один V-региона иммуноглобулина тяжелой цепи, или 5Т4 связывающие фрагменты последних (например, фрагменты Fab, модифицированного Fab, F(ab')₂ или Fv). Также включены однодоменные антитела, в которых один или более гипервариабельных участка (CDR), но менее, чем все шесть гипервариабельных участка (CDR), составляют область связывания антигена. Предлагаются также гибридные антитела, гуманизированные антитела, супергуманизированные антитела, диатела, антитела с одной цепью, тетра-валентные антитела, и/или мультиспецифичные антитела (например, двуспецифичные антитела). Эти дескрипторы антител не являются взаимоисключающими.

Природные антитела представляют собой тетрамерные (H₂L₂) гликопротеины около 150,000 дальтонов, составленные из двух одинаковых легких (L) цепей и двух одинаковых тяжелых (Н) цепей. Две тяжелые цепи связаны друг с другом посредством дисульфидных связей, и каждая тяжелая цепь связана легкой цепи дисульфидной связью. Каждая из легких и тяжелых цепей дополнительно определена N-концевой вариабельной областью и С-сегментом. Вариабельные области включают последовательности, которые в значительной степени отличаются среди антител и определяют по существу сродство к связыванию и специфичность отдельного антитела к отдельному антигену. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей выстраиваются с образованием антигенсвязывающего домена.

Гибридные антитела содержат последовательности, по меньшей мере, двух видов. В качестве одного из примеров, для включения вариабельных областей, которые содержат сайты связывания антигена, можно использовать технологию рекомбинантного клонирования из нечеловеческого антитела (т.е. антитело, приготовленное из нечеловеческих особей, иммунизированных антигеном) и C-сегментов, выведенных из иммуноглобулина человека.

Гибридные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антител А1, А2 и A3; т.е. (а) вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2 и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (б) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, соответствующую остаткам аминокислот 19-135 последователь