Терапевтические средства, используемые против реакции трансплантат против хозяина, содержащие в качестве активного ингредиента ингибитор рецептора интерлейкина-6

Терапевтические средства, используемые против реакции трансплантат против хозяина, содержащие в качестве активного ингредиента ингибитор рецептора интерлейкина-6

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к терапевтическим средствам, используемым против реакции трансплантат против хозяина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к терапевтическим средствам, используемым против реакции трансплантат против хозяина, которые содержат в качестве активного ингредиента ингибитор рецептора интерлейкина-6 (IL-6).

Уровень техники

Несмотря на то, что лечение гематопоэтических опухолей, таких как лейкоз, начинают с химиотерапии противоопухолевыми средствами, для пациентов, плохо подающихся лечению или с низкой вероятностью лечения с помощью стандартной химиотерапии, в дальнейшем требуется трансплантация гематопоэтических стволовых клеток (например, стволовых клеток периферической крови, клеток костного мозга). При этом отмечается, что трансплантация гематопоэтических стволовых клеток вызывает реакцию трансплантат против хозяина (РТПХ).

РТПХ представляет собой общее название заболеваний, которые вызываются иммунной реакцией пересаженных или трансплантированных иммунокомпетентных клеток против тканей хозяина. Возможно, это в основном происходит из-за того, что иммунокомпетентные клетки (например, зрелые T-клетки), находящиеся в периферической крови для переливания или трансплантации вызывают иммунные ответы против тканей реципиента. РТПХ включает как острые, так и хронические типы заболеваний с симптомами, такими как кожные симптомы, диарея и желтуха, которые могут оказывать серьезные побочные явления, приводящие в некоторых случаях к смерти.

Методики, обычно используемые для подавления РТПХ, включают способы, основанные на использовании иммуносупрессивных средств, таких как метотрексат или циклоспорин A, а также способы, основанные на удалении зрелых T-клеток из группы трансплантатных клеток (трансплантата). В случае использования метотрексата или циклоспорина A возникает проблема их побочного воздействия на организм. Известно, что подобным эффектом циклоспорина A является сильная нефротоксичность, а побочным эффектом метотрексата является подавление костного мозга.

С другой стороны, удаление зрелых T-клеток из группы трансплантатных клеток позволяет подавлять РТПХ, однако недостатком такого удаления является снижение противоракового действия, что приводит, например, к рецидиву лейкоза (непатентный документ 1).

Интерлейкин-6 (IL-6) представляет собой цитокин, называемый фактором стимуляции 2 В-клеток (BSF2) или интерфероном β2. IL-6 был открыт как фактор дифференцировки, вовлеченный в активацию B-клеточных лимфоцитов (непатентный документ 3), а позднее было обнаружено, что он является многофункциональным цитокином, который оказывает влияние на функцию различных клеток (непатентный документ 3). Сообщалось, что IL-6 индуцирует созревание Т-лимфоцитарных клеток (непатентный документ 4).

IL-6 осуществляет свою биологическую активность через два типа белков на клетке. Первый тип белка представляет собой рецептор IL-6, который является лиганд-связывающим белком, с которым связывается IL-6; этот белок имеет молекулярную массу около 80 кДа (непатентные документы 5 и 6). Рецептор IL-6 представлен в мембраносвязанной форме, которая пронизывает клеточную мембрану и экспрессируется на клеточной мембране, а также в виде растворимого рецептора IL-6, который в основном состоит из внеклеточного участка мембраносвязанной формы.

Другим типом белка является мембранный белок gp130, который обладает молекулярной массой около 130 кДа и вовлечен в не связанную с лигандом передачу сигнала. Биологическая активность IL-6 передается в клетку путем образование комплекса IL-6/рецептор, состоящего из IL-6 и рецептора IL-6, после чего происходит связывание комплекса с gp130 (непатентный документ 7).

Ингибиторы IL-6 представляют собой вещества, которые ингибируют передачу биологической активности IL-6. В настоящее время известные ингибиторы IL-6 включают антитела против IL-6 (антитела анти-IL-6), антитела против рецептора IL-6 (антитела анти-рецептор IL-6), антитела против gp130 (антитела анти-gp130), варианты IL-6, частичные пептиды IL-6 или рецептора IL-6а и другие.

Существует несколько документов, посвященных антителам против рецептора IL-6а (непатентные документы 8 и 9, патентные документы 1-3). В одном из таких докладов подробно описано гуманизированное антитело PM-1, которое получено путем замены гипервариабельного участка (CDR) антитела PM-1 мыши (непатентный документ 10), которое представляет собой антитело против рецептора IL-6а, в антителе человека (патентный документ 4).

Антитела против рецептора IL-6а используют для лечения воспалительных заболеваний, таких как ревматизм. Однако действующие при воспалении цитокины, включая IL-6, образуют сложную сеть, и поэтому было неясно, являются ли ингибиторы рецептора IL-6а эффективными для лечения других заболеваний, таких как реакция трансплантат против хозяина.

Действительно, сообщалось, что на модели РТПХ с экспрессией IL-6 на мышах не было получено никакого терепевтического эффекта, даже при введении антитела против IL-6 (непатентный документ 11).

Документы, относящиеся к прототипам настоящего изобретения, представлены ниже.

Непатентный документ 1: Marmont, AM. et al., Blood (1991) 78, 2120-2123

Непатентный документ 2: Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76

Непатентный документ 3: Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78

Непатентный документ 4: Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258

Непатентный документ 5: Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981

Непатентный документ 6: Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828

Непатентный документ 7: Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581

Непатентный документ 8: Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146

Непатентный документ 9: Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630

Непатентный документ 10: Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906

Непатентный документ 11: Knulst A. C. et al., Mediators of Inflammation (1994) 3, 33-40

Патентный документ 1: International Patent Publication No. WO 95/09873

Патентный документ 2: French Patent Publication No. FR 2694767

Патентный документ 3: U.S. Patent No. US 5216128

Патентный документ 4: International Patent Publication No. WO 92/19759

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ НАСТОЯЩИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Конкретные детали роли рецептора IL-6а в РТПХ остаются неизвестными. Также не ясно, за счет чего оказывается эффект на РТПХ при введении ингибиторов рецептора IL-6а.

Настоящее изобретение было осуществлено на основании описанных выше обстоятельств. Объектом настоящего изобретения являются новые терапевтические средства, используемые при РТПХ.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ

В результате всесторонних и интенсивных попыток, предпринимавшихся для достижения вышеупомянутого объекта, авторы настоящего изобретения обнаружили, что антитело против рецептора IL-6а вызывает значительный терепевтический эффект на модели РТПХ на мышах. Эти данные привели к созданию настоящего изобретения.

А именно, настоящее изобретение более конкретно определено ниже в пунктах [1]-[5].

[1]. Терапевтическое средство, используемое против реакции трансплантат против хозяина (РТПХ), которое содержит в качестве активного ингредиента ингибитор рецептора интерлейкина-6 (IL-6).

[2]. Терапевтическое средство, используемое против РТПХ, как указано выше в [1], при этом ингибитор рецептора IL-6а представляет собой ингибитор рецептора IL-6а человека.

[3]. Терапевтическое средство, используемое против РТПХ, как указано выше в [1], при этом ингибитор рецептора IL-6а представляет собой антитело против рецептора IL-6.

[4]. Терапевтическое средство, используемое против РТПХ, как указано выше в [3], при этом антитело против рецептора IL-6 представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.

[5]. Терапевтическое средство, используемое против РТПХ, как указано в любом из указанных выше [1]-[4], которое предназначено для использования против РТПХ после трансплантации стволовых клеток периферической крови.

[6]. Способ, используемый против реакции трансплантат против хозяина (РТПХ), который включает введение терапевтически эффективного количества ингибитора рецептора интерлейкина-6 (IL-6).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖА

Фигура 1 представляет собой график, на котором показана кривая изменений массы тела у мышей с индуцированной РТПХ в группе с антителом против рецептора IL-6 и в контрольной группе в зависимости от времени.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе, «ингибитор рецептора IL-6» представляет собой вещество, которое блокирует обусловленную рецептором IL-6 передачу сигнала и ингибирует биологическую активность рецептора IL-6. Таким ингибитором рецептора IL-6 может являться либо вещество, которое непосредственно ингибирует биологическую активность рецептора IL-6 посредством связывания с рецептором IL-6, либо вещество, которое опосредованно ингибирует биологическую активность рецептора IL-6 путем связывания с другим веществом, таким как gp130, однако предпочтительно представляет собой вещество, которое связывается с рецептором IL-6 и обладает ингибирующей активностью, препятствующей связыванию между IL-6 и рецептором IL-6.

Ингибиторы рецептора IL-6, по настоящему изобретению, включают, в качестве неограничивающих примеров, например, антитела против рецептора IL-6, растворимые варианты рецептора IL-6, частичные пептиды рецептора IL-6 и низкомолекулярные соединения, которые обладают сходной активностью. Предпочтительные примеры ингибиторов рецептора IL-6, по настоящему изобретению, включают антитела, которые распознают рецептор IL-6.

Источник антител против рецептора IL-6, использованный в настоящем изобретении, конкретно не ограничен; тем не менее, антитело предпочтительно получают из организма млекопитающего.

Антитела против рецептора IL-6, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител, используя известные способы. В частности, антитела против рецептора IL-6, используемые в настоящем изобретении, представляют собой, предпочтительно, моноклональные антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих, включают моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, и моноклональные антитела, продуцируемые с помощью способов генной инженерии организмами-хозяевами, трансформированными вектором экспрессии, который содержит ген антитела. За счет связывания с рецептором IL-6 антитело ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, таким образом, блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.

Примеры таких антител включают антитело MR16-1 (Tamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928); антитело PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906); антитело AUK12-20, антитело AUK64-7 и антитело AUK146-15 (WO 92/19759); tocilizumab; и т.д. Из них, антитело PM-1 является примером предпочтительного моноклонального антитела против рецептора IL-6 человека, f антитело MR16-1 - предпочтительного моноклонального антитела против рецептора IL-6 мыши.

В принципе, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело против рецептора IL-6, могут быть получены известными методиками, как указано ниже. В частности, такие гибридомы могуть быть получены с использованием рецептора IL-6 в качестве сенсибилизирующего антигена для проведения иммунизации с помощью общепринятого способа иммунизации, слияния полученных иммунных клеток с использованием известной родительской клетки с помощью общепринятого способа слияния клеток, и отбора продуцирующих моноклональные антитела клеток с помощью общепринятого способа отбора.

А именно, антитела против рецептора IL-6 могут быть получены следующим образом. Например, рецептор IL-6 человека или рецептор IL-6 мыши для использования в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антител может быть получен с помощью генов рецептора IL-6 и/или аминокислотных последовательностей, описанных в публикациях Европейских патентов No. EP 325474 и JP 3-155795 A, соответственно.

Существует два вида IL-6-рецепторных белков: один, экспрессируемый на клеточной мембране и другой, выделенный из клеточной мембраны (растворимый рецептор IL-6) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Растворимый рецептор IL-6 в основном состоит из внеклеточной области связанного с клеточной мембраной рецептора IL-6 и отличается от мембраносвязанного рецептора IL-6 тем, что в нем отсутствует трансмембранная область или как трансмембранная, так и внутриклеточная области. Любой рецептор IL-6 можно использовать в качестве IL-6-рецепторного белка, при условии, что его можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена для продуцирования антитела против рецептора IL-6, применяемого в настоящем изобретении.

После трансформации клетки соответствующего хозяина известной системой вектора экспрессии, несущей последовательность гена рецептора IL-6, необходимый IL-6-рецепторный белок очищают из содержимого клетки-хозяина или из культуральной среды с использованием известного способа. Этот очищенный IL-6-рецепторный белок можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно, экспрессирующийся в клетке рецептор IL-6 или слитый белок белка рецептора IL-6 и другого белка можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена.

На млекопитающих, предназначенных для иммунизации сенсибилизирующим антигеном, не накладывается особых ограничений, однако их предпочтительно выбирают с учетом совместимости с родительской клеткой, используемой для слияния клеток. Как правило, используют грызунов, таких как мыши, крысы и хомяки.

Животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном известными способами. Например, в одном из общепринятых способов, животных иммунизируют путем внутрибрюшинной или подкожной инъекции сенсибилизирующего антигена. В частности, сенсибилизирующий антиген предпочтительно разводят или суспендируют в соответствующем количестве забуфернного фосфатом солевого раствора (PBS), физиологического солевого раствора или подобных и, при желании, дополнительно смешивают и эмульгируют с соответствующим количеством общеупотребительного адъюванта (например, полный адъювант Фрейнда), и затем вводят животному несколько раз, с интервалами от четырех дней до 21 дня. Кроме того, для иммунизации сенсибилизирующим антигеном можно использовать соответствующий носитель.

После такой иммунизации подтверждают увеличение уровня требуемого антитела в сыворотке и затем из млекопитающего получают иммунные клетки для слияния клеток. Предпочтительно, иммунные клетки для слияния клеток включают, в частности, клетки селезенки.

Клетки миеломы млекопитающих, используемые в качестве родительских клеток, т.е. в качестве клеток-партнеров для слияния с вышеупомянутыми иммунными клетками, включают различные известные линии клеток, например, P3X63Ag8,653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology и Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. и Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., клетка (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Способы (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133), и подобные.

В принципе, слияние клеток вышеупомянутых иммунных клеток и клеток миеломы можно осуществить с использованием известных способов, например, способа Milstein et al. (Kohler, G. и Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), и подобных.

А именно, вышеуказанное слияние клеток проводят в культуральной среде со стандартными пищевыми добавками в присутствии вещества, усиливающего слияние клеток. Например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), вирус Сендай (HVJ) и тому подобное, используют в качестве веществ, усиливающих слияние. Кроме того, для усиления эффективности слияния можно добавлять вспомогательные агенты, такие как диметилсульфоксид, в зависимости от необходимости.

Используемое соотношение иммунных клеток к клеткам миеломы составляет, предпочтительно, например, от 1 до 10 иммунных клеток на каждую клетку миеломы. Культуральная среда, используемая для вышеупомянутого слияния клеток, представляет собой, например, культуральную среду RPMI1640 или MEM, которые подходят для пролиферации вышеупомянутых клеток миеломы. Можно также использовать стандартную культуральную среду, используемую для культивирования этого типа клеток. Более того, можно использовать в комбинации сывороточные добавки, такие как эмбриональная сыворотка (FCS).

Для слияния клеток, представляющие интерес слитые клетки (гибридомы) образуются путем тщательного смешивания предопределенных количеств вышеупомянутых иммунных клеток и миеломных клеток в вышеупомянутой культуральной среде и последующего добавления и перемешивания раствора ПЭГ (например, раствор ПЭГ со средней молекулярной массой от около 1000 до 6000), предварительно нагретого до 37°C в концентрации от 30% до 60% (масса/объем). Затем вещества, способствующие слиянию клеток, и вещества, которые являются неподходящими для роста гибридом, можно удалить путем многократного добавления соответствующей культуральной среды и затем удаления супернатанта путем центрифугирования.

Вышеописанные гибридомы отбирают путем культивирования в стандартной селективной культуральной среде, например, культуральной среде HAT (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культуру в культуральной среде HAT поддерживают в течение достаточного периода, как правило, от нескольких дней до нескольких недель, для уничтожения клеток, отличных от представляющих интерес гибридом (неслитые клетки). Затем способом стандартных лимитированных разведений осуществляют скрининг и клонируют гибридомы, которые продуцируют представляющее интерес антитело.

Кроме способов иммунизации отличных от человека млекопитающих антигенами для получения вышеупомянутых гибридом, требуемые антитела человека с активностью связывания с требуемым антигеном или антиген-экспрессирующей клеткой могут быть получены путем сенсибилизирования лимфоцита человека требуемым антигенным белком или антиген-экспрессирующей клеткой in vitro и слияния сенсибилизированного B-лимфоцита с миеломной клеткой человека (например, U266) (см., JP 1-59878 B). Кроме того, желаемое антитело человека можно получить путем введения антигена или антиген-экспрессирующей клетки в трансгенное животное, которое обладает набором генов антитела человека, и затем следовать вышеупомянутому способу (см., публикации Международных патентов Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, и WO 96/33735).

Полученные таким образом гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, можно субкультивировать в общепринятой культуральной среде и хранить в жидком азоте в течение продолжительного периода времени.

При получении моноклональных антител из вышеупомянутой гибридомы можно использовать следующие способы: способ, при котором гибридомы культивируют в соответствии с общепринятыми способами и антитела получают в виде культурального супернатанта; способ, при котором гибридомы вводят и размножают в совместимом млекопитающем и антитело получают в виде асцитной жидкости; и так далее. Первый способ является предпочтительным для получения антител с высокой степенью очистки, а последний предпочтителен для крупномасштабного продуцирования антител.

Например, гибридомы, продуцирующие антитело против рецептора IL-6, можно получить способом, описанным в JP 3-139293 A. Такие гибридомы можно получать путем впрыскивания гибридомы, продуцирующей антитело PM-1, в брюшную полость BALB/c мыши, получения асцитов и затем очистки антитела PM-1 из асцитов; или путем культивирования гибридомы в соответствующей среде (например, среда RPMI1640, содержащая 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 5% BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim); среда hybridoma SFM (GIBCO-BRL); среда PFHM-II (GIBCO-BRL) и т.д.) и затем получение антитела PM-1 из культурального супернатанта.

Рекомбинантные антитела можно использовать в качестве моноклональных антител по настоящему изобретению, когда антитела получают с использованием методик генетической рекомбинации путем клонирования гена антитела из гибридомы, встраивания гена в соответствующий вектор, и затем введения вектора в организм-хозяин (см., например, Borrebaeck, C. A. K. и Larrick, J. W., Therapeutic Monoclonal Antibodies, опубликованное в Великобритании издательством Macmillan Publishers Ltd, 1990).

А именно, мРНК, кодирующие вариабельные участки (V) антитела, выделяют из клеток, которые продуцируют представляющие интерес антитела, таких как гибридомы. мРНК можно выделять путем получения тотальных мРНК в соответствии с известными способами, такими как способ ультрацентрифугирования с гуанидином (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) и способ AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), и получать мРНК с использованием набора для очистки мРНК “mRNA Purification Kit” (Pharmacia) и других. Альтернативно, мРНК можно непосредственно получать с использованием набора для очистки мРНК “QuickPrep mRNA Purification Kit” (Pharmacia).

кДНК V-областей антитела синтезируют из полученных мРНК с использованием обратной транскриптазы. кДНК можно синтезировать с использованием набора “AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit” и других. Кроме того, для синтезирования и амплификации кДНК можно применять способ 5'-RACE (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) с использованием набора “5'-Ampli FINDER RACE Kit” (Clontech) и ПЦР. Представляющий интерес фрагмент ДНК очищают из полученных ПЦР-продуктов и затем лигируют с векторной ДНК. Затем рекомбинантный вектор получают с использованием вышеописанной ДНК и вводят в Escherichia coli или подобные, и затем их колонии отбирают для получения необходимого рекомбинантного вектора. Нуклеотидную последовательность представляющей интерес ДНК подтверждают известным способом, например, способом дидезокси-секвенирования.

Как только получена ДНК, кодирующая V-область представляющего интерес антитела, ДНК лигируют с ДНК, которая кодирует необходимую константную область (C-область) антитела, и вставляют в экспрессирующий вектор. Альтернативно ДНК, кодирующая V-область антитела, можно вставлять в экспрессирующий вектор, содержащий ДНК C-области антитела.

Для получения антитела, используемого в настоящем изобретении, как описано выше, ген антитела встраивают в экспрессирующий вектор так, чтобы он экспрессировался под контролем регуляторной области экспрессии, например, энхансера и промотора. Затем антитело можно экспрессировать путем трансформации клетки организма-хозяина этим экспрессирующим вектором.

По настоящему изобретению, для снижения гетероантигенности у людей и других можно применять искусственные генетически модифицированные рекомбинантные антитела, например, химерные антитела или гуманизированные антитела. Такие модифицированные антитела можно получить с использованием известных способов.

Химерное антитело можно получить путем лигирования ДНК, кодирующей V-область антитела, полученную как описано выше, с ДНК, кодирующей C-область антитела человека, затем встраивания ДНК в экспрессирующий вектор и введения его в организм хозяина для продуцирования (смотри, Европейская Патентная публикация No. EP 125023; Международная Патентная публикация No. WO 92/19759). Этот известный способ можно использовать для получения химерного антитела, подходящего для использования по настоящему изобретению.

Гуманизированные антитела также называют видоизмененными антителами человека, и они представляют собой антитела, где комплементарные детерминирующие области (CDR) антитела из отличного от человека млекопитающего (например, антитело мыши) перенесены в CDR антител человека. Общие способы для такой генной рекомбинации также известны (см., Европейская Патентная публикация No. EP 125023, Международная Патентная публикация No. WO 92/19759).

А именно, последовательности ДНК, спроектированные так, что CDR антитела мыши лигируют с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезированными при помощи ПЦР из нескольких олигонуклеотидов, полученных с содержанием перекрывающихся частей на их концах. Полученную ДНК лигируют с ДНК, кодирующую C-области антитела человека - и затем вставляют в экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор вводят в организм-хозяин для продуцирования гуманизированного антитела (см., Европейская Патентная публикация No. EP 239400, Международная Патентная публикация No. WO 92/19759).

FR антитела человека, лигированные через посредство CDR, отбирают, так что CDR образуют подходящие антиген-связывающие участки. Аминокислота(ы) внутри вариабельных областей FR антитела можно заменить, как необходимо, так что CDR перестраиваемого антитела человека образует соответствующие участки связывания антигена (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

C-области антитела человека, как правило, используют для химерных и гуманизированных антител. Примеры C-областей тяжелой цепи антитела человека включают Cγ, Cα, Cµ, Cδ и Cε, и, например, можно использовать Cγ1, Cγ2, Cγ3 или Cγ4. Примеры C-областей легкой цепи антитела человека включают κ или λ. Более того, для улучшения стабильности антител или их продуцирования C-области антитела человека можно модифицировать.

Химерные антитела состоят из вариабельных областей антитела, полученного из отличного от человека млекопитающего и константных областей антитела, полученного из человека; гуманизированное антитело состоит из CDR антитела, полученного из отличного от человека млекопитающего, и каркасных областей и константных областей, полученных из антитела человека. Они обладают уменьшенной антигенностью в организме человека и, таким образом, пригодны в качестве антител для применения, по настоящему изобретению.

Предпочтительные конкретные примеры гуманизированных антител, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают гуманизированное антитело PM-1 (tocilizumab; см., Международная Патентная публикация No. WO 92/19759). Альтернативно, также возможны модифицированные формы гуманизированного антитела PM-1, которые конструируют для введения замен, делеций, добавлений или других модификаций в аминокислотную последовательность гуманизированного антитела PM-1.

Более того, кроме вышеупомянутых способов получения антител человека, также известны технические приемы для получения антитела человека путем сортировки (пэннинга) с использованием библиотеки антител человека. Например, вариабельные области антител человека можно экспрессировать на поверхности фагов в виде одноцепочечного антитела (scFv), используя способ фагового дисплея, селектируя тем самым антиген-связывающие фаги. Путем анализа генов отобранных фагов, можно определить последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области антитела человека, которые связываются с антигеном. Как только можно выявить последовательность ДНК scFv, которое связывается с антигеном, можно сконструировать соответствующий экспрессирующий вектор, включающий последовательность, для получения антитела человека. Эти способы уже известны, и публикации WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388 можно использовать в качестве ссылки.

Вышеописанные сконструированные гены антитела можно экспрессировать общепринятыми способами. При использовании клеток млекопитающих можно экспрессировать ген антитела при помощи ДНК, в которой ген экспрессируемого антитела состыкован с подходящим обычно используемым промотором и сигналом полиаденилирования, расположенным ниже гена антитела, или при помощи вектора, содержащего ДНК. Примеры промотора/энхансера включают быстрый ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека.

Более того, другие промоторы/энхансеры, которые можно использовать для экспрессии антител для использования, по настоящему изобретению, включают вирусные промоторы/энхансеры ретровируса, вируса полиомы, аденовируса, вакуолизирующего вируса 40 (SV40) обезьяны и других; и также включают промоторы/энхансеры, полученные из клеток млекопитающих, такие как относящиеся к фактору элонгации 1α (HEF1α) человека.

Например, при использовании промотора/энхансера SV40 экспрессию легко осуществять в соответствии со способом Mulligan et al. (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114). Альтернативно, в случае использования промотора/энхансера HEF1α можно применить способ Mizushima et al. (Mizushima, S. и Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

Системы продуцирования с использованием прокариотических клеток-хозяев включают системы с использованием бактериальных клеток. Известные бактериальные клетки включают E. coli и Bacillus subtilis.

При использовании E. coli ген антитела можно экспрессировать путем сшивания общепринятого подходящего промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и гена антитела, который следует экспрессировать. Примеры такого промотора включают промотор lacZ, промотор araB и т.д. При использовании промотора lacZ гены можно экспрессировать в соответствии со способом Ward et al. (Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427); и промотор araB можно использовать в соответствии со способом Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043).

При продуцировании антитела в периплазму E. coli можно использовать сигнальную последовательность pel B (Lei, S. P. et al., J. Бактериоl. (1987) 169, 4379-4383) в качестве сигнальнаой последовательности для секреции антитела. Продуцируемые в периплазме антитела выделяют и соответствующим образом подвергают повторному сворачиванию перед использованием (см., например, WO 96/30394).

В качестве участка начала репликации можно использовать участки начала репликации, полученные из SV40, вируса полиомы, аденовируса, вируса папилломы крупного рогатого скота (BPV) и другие. Кроме того, для увеличения числа копий гена в системе клеток-хозяев экспрессирующий вектор может содержать ген аминогликозидфосфотрансферазы (APH), ген тимидинкиназы (TK), ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (Ecogpt) E. coli, ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) или подобные в качестве селективного маркера.

Любую систему продуцирования можно использовать для получения антител для использования по настоящему изобретению. Системы продуцирования для получения антитела включают системы продуцирования in vitro и in vivo. Системы продуцирования in vitro включают системы с использованием эукариотических клеток или прокариотических клеток.

Системы продуцирования при помощи эукариотических клеток-хозяев включают системы продуцирования с использованием клеток животных, клеток растений или клеток грибков. Такие клетки животных включают (1) клетки млекопитающих, например, CHO, COS, клетки миеломы, клетки почки хомячка (BHK), HeLa, Vero и другие; (2) клетки земноводных, например, ооциты Xenopus; и (3) клетки насекомых, например, sf9, sf21, Tn, и другие. Известные клетки растений включают клетки, полученные из Nicotiana tabacum, которые можно культивировать в качестве каллюса. Известные клетки грибков включают дрожжи, такие как Saccharomyces (например, S. cerevisiae), плесневые грибки, такие как Aspergillus (например, A. niger), и другие.

Антитела можно получать при помощи трансформации для введения представляющего интерес гена антитела в эти клетки, и затем путем культивирования трансформированных клеток in vitro. Культуры наращивают известными способами. Например, в качестве среды для культивирования можно использовать DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, и можно использовать в комбинации сывороточные добавки, такие как FCS. Кроме того, клетки с введенным геном антитела можно передавать в брюшную полость или подобные животного для продуцирования антитела in vivo.

С другой стороны, системы продуцирования in vivo включают системы продуцирования с использованием животных или растений. Системы продуцирования с использованием животных включают системы продуцирования, которые используют млекопитающих или насекомых.

Млекопитающие, которых можно использовать, включают козлов, свиней, овец, мышей, быков и других (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Кроме того, насекомые, которых можно использовать, включают тутовых шелкопрядов. При использовании растений можно применять, например, табак.

Ген антитела вводят в животные или растения, и антитело продуцируют в организме животных или растений и затем выделяют. Например, ген антитела можно получить в виде слитого гена путем встраивания в середину гена, кодирующего белок, такой как β-казеин козла, который продуцируется исключительно в молоко. Фрагменты ДНК, содержащие слитый ген, который включает ген антитела, впрыскивают в эмбрионы козла, и эмбрионы вводят в коз. Требуемое антитело получают из молока, вырабатываемого трансгенным животным, рожденным козами, которые получили эмбрионы, или полученного от потомства этих животных. Трансгенным козам можно давать гормоны для увеличения объема молока, содержащего требуемое антитело, которое они продуцируют (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

При использовании тутовых шелкопрядов, тутовых шелкопрядов инфицируют бакуловирусом с встроенным геном антитела, и требуемое антитело получают из жидкости организмов этих тутовых шелкопрядов (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Более того, при использовании табака требуемый ген антитела встраивают в экспрессирующий вектор растений (например, pMON530) и вектор вводят в бактериальные клетки, такие как Agrobacterium tumefaciens. Эти бактериальные клетки используют для инфицирования табака (например, Nicotiana tabacum), так что требуемое антитело можно получать из листьев этого табака (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

При продуцировании антитела с использованием систем продуцирования in vitro или in vivo, как описано выше, ДНК, кодирующие тяжелую цепь (H-цепь) и легкую цепь (L-цепь) антитела, можно встроить в отдельные экспрессирующие векторы и совместно трансформировать в хозяина. Альтернативно, ДНК, кодирующие цепи H и L, можно встроить в общий экспрессирующий вектор для трансформации хозяина (смотри, Международная Патентная публикация No. WO 94/11523).

Антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть фрагментами антитела или их модифицированными продуктами, поскольку их можно соответственно использовать в настоящем изобретении. Например, фрагменты антитела включают Fab, F(ab')2, Fv, и одноцепочечные Fv (scFv), в которых Fv цепей H и L связаны посредством соответствующего линкера.

В частности, фрагменты антитела получают путем обработки антител ферментами, например, папаином или пепсином; или, альтернативно, кодирующие эти фрагменты гены конструируют, вводят в экспрессирующие векторы и затем экспрессируют в соответствующих клетках-хозяевах (см., например, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Способы in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-666; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

scFv можно получать путем соединения V-области H-цепи и V-области L-цепи антитела. В scFv, V-область H-цепи и V-область L-цепи связаны посредством линкера, предпочтительно, посредством пептидного линкера (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). V-области цепей H и L в scFv можно получить из любого из вышеописанных антител. Пептидные линкеры для связывания V-областей включают, например, произвольные одноцепочечные пептиды, включающие от 12 до 19 аминокислотных остатков.

scFv-кодирующую ДНК можно получить путем использования ДНК, кодирующей вышеописанные H-цепь или V-область H-цепи антитела, и ДНК, кодирующей вышеописанные L-цепь или V-область L-цепи антитела в качестве матриц для ПЦР-амплификации участка ДНК, который кодирует требуемую аминокислотную последовательность в матричной последовательности с праймеров, которые определяют концы участка, и затем дальнейшего амплифицирования части амплифицированной ДНК с ДНК, которая кодирует часть пептидного линкера и пары праймеров, которые соединяют оба конца линкера с цепями H и L, соответственно.

После получения scFv-кодирующей ДНК общепринятыми способами можно получить экспрессирующий вектор, содержащий ДНК и хозяина, трансформированного вектором. Кроме того, scFv можно получить в соответствии с общепринятыми способами с использованием хозяина.

Эти фрагменты антитела можно продуцировать из организмов-хозяев путем получения и экспрессирования их генов, как описано выше. В данном случае, термин «антитело» охватывает такие фрагменты антитела.

Антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), можно также использовать в качестве модифицированных антител. В настоящем описании, термин «антитело» охватывает такие модифицированные антитела. Эти модифицированные антитела можно получить путем химического модифицирования полученных антител. Такие способы уже закрепились в рассматриваемой области.

Антитела, продуцированные и экспрессированные, как описано выше, можно выделять из содержимого или извне клеток или из организмов-х