Новые антитела

Новые антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки США номер 60/975471, поданной 26 сентября 2007 г., полное содержание которой приведено в настоящем документе ссылкой для всех целей.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым антителам против α5β1, композициям и наборам, содержащим антитела, и способам с использованием антител.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Интегрин α5β1 представляет собой гликопротеин мембраны клеток, опосредующий взаимодействия клетка-клетка и клетка-ECM посредством его главного лиганда, фибронектина. Интегрин α5β1 играет роль в миграции, дифференцировке и выживаемости клеток. Уровни интегрина α5β1 повышены в эндотелии сосудов опухоли (например, при карциномах желудка, ободочной и прямой кишки, гепатоцеллюлярной карциноме, карциномах шейки матки и молочной железы) и в других ангиогенных сосудах. Интегрин α5β1 модулирует связь пристеночных клеток с эндотелиальными клетками и сборку эндотелиального внеклеточного матрикса в ходе ангиогенеза. Соответственно, интегрин α5β1 является полезной мишенью для ингибирования ангиогенеза и сенсибилизации клеток к воздействию антагониста VEGF.

Таким образом, в данной области существует необходимость в композициях и способах для нацеливания на интегрин α5β1. Настоящее изобретение удовлетворяет эту и другие необходимости.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым антителам против α5β1, полученным из антитела, продуцируемого гибридомой 7H5, наборам и композициям, содержащим новые антитела против α5β1, и способам их получения или использования. Антитела против α5β1 по этому изобретению обладают улучшенным связыванием с α5βl по сравнению с антителом, продуцируемым гибридомой 7H5. Такие антитела включают в себя гуманизированные антитела. По другому варианту осуществления новые антитела против α5β1 можно конъюгировать с другим веществом, таким как, в качестве неограничивающих примеров, лекарственное средство или флуоресцентный краситель, или другой маркер для детекции α5β1 у пациентов или в образцах от пациента. Такие новые антитела против α5β1 можно использовать во множестве терапевтических и диагностических способов. Например, такие антитела против α5β1 можно использовать для лечения аномального ангиогенеза, неоплазии, глазных заболеваний и аутоиммунных заболеваний. Такие антитела можно использовать для детекции белка α5β1 у пациентов или в образцах от пациента посредством приведения таких антител в контакт с белком α5β1 у пациентов или в образцах от пациента и количественного или качественного определения антитела против α5β1, связанного с белком α5β1.

В одном варианте осуществления антитела против α5β1 по этому изобретению содержат последовательность вариабельного домена легкой цепи, содержащую (1) LHVR1, содержащую аминокислотную последовательность KASQ-N/S-VGSDVA (SEQ ID NO: 10), (2) LHVR2, содержащую аминокислотную последовательность STSYRYS (SEQ ID NO: 11) и (3) LHVR3, содержащую аминокислотную последовательность QQY-N/S-SYPFT (SEQ ID NO: 12). В другом варианте осуществления антитела против α5β1 по этому изобретению содержат последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, содержащую (1) HHVR1, содержащую аминокислотную последовательность GYTF-T/S-DYYLY (SEQ ID NO: 13), (2) HHVR2, содержащую аминокислотную последовательность GISPS-N/S-GGTTF-N/A-D-N/A-FE-N/G (SEQ ID NO: 14) и (3) HHVR3, содержащую аминокислотную последовательность DAYGDWYFDV (SEQ ID NO: 15).

В другом варианте осуществления антитела против α5β1 по этому изобретению содержат вариабельный домен легкой цепи, обладающий последовательностью SEQ ID NO:1, или его вариант, и вариабельный домен тяжелой цепи, обладающий последовательностью SEQ ID NO: 6, или его вариант. В одном варианте осуществления вариант последовательности вариабельного домена тяжелой цепи содержит аминокислотную замену в остатке, выбранном из группы, состоящей из 30, 48, 49, 54, 60, 62, 65, 66, 67 и 69 (система нумерации Kabat). В другом варианте осуществления вариант последовательности вариабельного домена легкой цепи содержит аминокислотную замену в остатке, выбранном из группы, состоящей из 28, 46 и 92 (система нумерации Kabat). В одном варианте осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из T30S, I48V, G49S, N54S, N60A, N62A, N62S, N65G, K66R, A67F и L69I (система нумерации Kabat). В одном варианте осуществления вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из N28S, T46L и N92S (система нумерации Kabat).

Настоящее изобретение относится также к композиции, содержащей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 1 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:5. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:2 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:6. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:2 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:7. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:3 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:8. В другом варианте осуществления композиция содержит антитело, содержащее последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:4 и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:9.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему в себя стадию(стадии) введения антагониста VEGF и антитела против α5β1 по этому изобретению. В одном из предпочтительных вариантов осуществления рак является способным отвечать на терапию антагонистом VEGF. В другом варианте осуществления способ лечения возрастной дегенерации желтого пятна (AMD), включая влажную связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна, у субъекта, страдающего от AMD, включает в себя стадию(стадии) введения терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антитела против α5β1 по этому изобретению. В другом варианте осуществления способ лечения аутоиммунного заболевания у субъекта включает в себя стадию (стадии) введения терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антитела против α5β1.

В одном варианте осуществления субъекту, подлежащему лечению, сначала можно вводить антагонист VEGF, а затем лечить его антителом против α5β1 по этому изобретению. В другом варианте осуществления субъекта лечат антагонистом VEGF и антителом против α5β1 по этому изобретению во время циклов лечения одним из двух лекарственных средств. В другом варианте осуществления субъекта подвергают лечению антагонистом VEGF, пока субъект не перестает отвечать на лечение антагонистом VEGF, и затем субъекта подвергают лечению антителом против α5β1 по этому изобретению. В одном конкретном варианте осуществления субъекта подвергают лечению антагонистом VEGF, если рак является неинвазивным или находится на ранней стадии, и подвергают лечению антителом против α5β1 по этому изобретению, если рак является инвазивным. В другом варианте осуществления субъект, подвергающийся лечению антителом против α5β1 по этому изобретению, обладает повышенными уровнями α5β1 в пораженной заболеванием ткани по сравнению с тканью субъекта, не страдающего заболеванием. В этом случае, способ может дополнительно включать в себя стадию детекции α5β1 у субъекта, например, в пораженной заболеванием ткани после лечения антагонистом VEGF. В одном варианте осуществления инвазивный рак представляет собой метастазирующий рак. В другом варианте осуществления рак на ранней стадии представляет собой рак после лечения адъювантной терапией (например, химиотерапией или хирургическим удалением).

В одном предпочтительном варианте осуществления субъект страдает заболеванием с аномальным ангиогенезом. В другом варианте осуществления заболевание выбрано из группы, состоящей из рака, имунного заболевания или глазного заболевания. В одном из предпочтительных вариантов осуществления заболевание выбрано из группы, состоящей из солидной опухоли, метастазирующей опухоли, опухоли мягких тканей, заболевания, обладающего неоваскуляризацией глаза, воспалительного заболевания с аномальным ангиогенезом, заболевания, возникающего после трансплантации у субъекта, и заболевания с аномальной пролиферацией сосудисто-волокнистой ткани. В другом предпочтительном варианте осуществления, рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы (включая метастазирующий рак молочной железы), рака шейки матки, рак ободочной и прямой кишки (включая метастазирующий рак ободочной и прямой кишки), рака легкого (включая немелкоклеточный рак легкого), неходжкинской лимфомы (NHL), хронического лимфоцитарного лейкоза, почечноклеточного рака, рака предстательной железы, включая устойчивый к гормонам рак предстательной железы, рака печени, рака головы и шеи, меланомы, рака яичника, мезотелиомы, рака мягких тканей, стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, мультиморфной глиобластомы и множественной миеломы. В другом предпочтительном варианте осуществления заболевание выбрано из группы, состоящей из ретинопатии, связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (например, влажной AMD), диабетического отека желтого пятна, окклюзии ретинальных вен (RVO) и сухой AMD/географической атрофии (для предотвращения прогрессирования до влажной AMD), покраснения радужки; псориаза, воспалительной почечной недостаточности, гемолитико-уремического синдрома, диабетической нефропатии (например, пролиферативной диабетической ретинопатии), артрита (например, псориатического артрита, остеоартрита, ревматоидного артрита), воспалительного заболевания кишечника, хронического воспаления, хронического отслоения сетчатки, хронического увеита, хронического витрита, отторжения трансплантата роговицы, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации трансплантата роговицы, болезни Крона, миопии, заболевания неоваскуляризации глаза, болезни Педжета, пемфигоида, полиартериита, заболевания после лазерной радиальной кератотомии, неоваскуляризации сетчатки, синдрома Шегрена, язвенного колита, отторжения трансплантата, воспаления легких, нефротического синдрома, отека, асцитов, связанных со злокачественными новообразованиями, инсульта, ангиофибромы и неоваскулярной глаукомы. В одном варианте осуществления субъекту дополнительно вводят лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из антинеопластического средства, химиотерапевтического средства и цитотоксического средства.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления этого изобретения субъект, подлежащий лечению антителом против α5β1, страдает от обострения после лечения антагонистом VEGF или стал устойчивым к лечению антагонистом VEGF. В другом варианте осуществления субъект, подлежащий лечению антителом против α5β1 по этому изобретению и антагонистом VEGF, страдает от метастазирующего рака или его ранее подвергали лечению с помощью адъювантной терапии. В одном варианте осуществления пациент-кандидат испытывает обострение, является невосприимчивым или устойчивым к химиотерапевтическому средству, такому как иринотекан. Такие заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров метастазирующий рак ободочной и прямой кишки, рецидивирующий метастазирующий рак ободочной и прямой кишки, метастазирующий рак молочной железы, рецидивирующий метастазирующий рак молочной железы, метастазирующий HER2+ рак молочной железы, адъювант рак молочной железы, адъювант HER2+ рак молочной железы, метастазирующий рак поджелудочной железы, рак толстого кишечника после адъювантной терапии, немелкоклеточный рак легкого после адъювантной терапии, рак прямой кишки после адъювантной терапии, немелкоклеточный рак легкого после адъювантной терапии, метастазирующий немелкоклеточный рак легкого, метастазирующий рак яичника, метастазирующий почечно-клеточный рак и почечно-клеточный рак после адъювантной терапии.

В одном варианте осуществления для субъекта, страдающего заболеванием, описанным в настоящем документе, проводят поддерживающую терапию после лечения заболевания антагонистом VEGF, где поддерживающая терапия представляет собой терапию антителом против α5β1 по этому изобретению отдельно или последовательно, или одновременно с антагонистом VEGF.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEGF может являться выбранным из группы, состоящей из антитела, иммуноадгезина, пептидного антитела, малой молекулы и нуклеиновой кислоты, гибридизующейся с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF, в строгих условиях (например, рибозим, миРНК и аптамер). В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEGF представляет собой антитело. В другом варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антитело против VEGF можно конкурентно ингибировать посредством связывания VEGF человека антителом Авастин®. В другом варианте осуществления антитело против VEGF является человеческим, гуманизированным или химерным. В одном конкретном варианте осуществления антитело против VEGF представляет собой антитело Авастин®. В другом варианте осуществления антитело против VEGF выбрано из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)'₂, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. В другом варианте осуществления антагонист VEGF представляет собой биспецифическое антитело, которое связывает VEGF и содержит тяжелую цепь и легкую цепь вариабельного домена антитела против α5β1 по этому изобретению.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления антитело против α5β1 по этому изобретению представляет собой антитело, содержащее Fc-фрагмент из IgG человека. В другом варианте осуществления антитело против α5β1 по этому изобретению содержит домены CH1, CH2 и CH3 из IgG1 человека или hIgG4. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антитело против α5β1 представляет собой гуманизированное антитело. В одном конкретном варианте осуществления антитело против α5β1 представляет собой антитело 7H5 или химерное, или гуманизированное антитело из него. В другом варианте осуществления антитело против α5β1 выбрано из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)^' ₂, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. В другом варианте осуществления антитело против α5β1 по этому изобретению представляет собой биспецифическое антитело, которое связывает VEGF и α5β1 и является антагонистом VEGF. В другом варианте осуществления антитело против α5β1 по этому изобретению обладает измененной эффекторной функцией. В одном варианте осуществления антитело против α5β1 является измененным для уменьшения или предотвращения активности антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC) (например, изменением последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей Fc-фрагмент антитела). В другом варианте осуществления антитело против α5β1 изменено для увеличения или уменьшения времени его полужизни у человека (например, изменением последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей Fc-фрагмент антитела).

В одном варианте осуществления антитело против α5β1 конъюгируют с цитотоксическим средством или химиотерапевтическим средством. В другом варианте осуществления цитотоксическое средство представляет собой радиоактивный изотоп или токсин.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим антагонист VEGF, антитело против α5β1 по этому изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также относится к изделиям, содержащим инструкции для детекции α5β1 у субъекта, подвергавшегося лечению с помощью антагониста VEGF.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1 изображено выравнивание последовательностей вариабельного домена легкой цепи по отношению к клону 7H5 против интегрина α5β1 для следующего: гуманизированное антитело 7H5, основанное на прививке CDR из мышиного 7H5 (h7H5.v1) (SEQ ID NO: 1), гуманизированное антитело 7H5, основанное на замене остатков в CDR-L1, -L3 и -H2 из h7H5.v1 (h7H5.v2, SEQ ID NO:2) и гуманизированные антитела 7H5, основанные на модификации каркаса в h7H5.v2 (h7H5.v4 (SEQ ID NO:3) и h7H5.v5 (SEQ ID NO:4)). Вариабельный домен легкой цепи h7H5.v3 является идентичным последовательности SEQ ID NO:2.

На фигуре 2 изображено выравнивание последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи по отношению к клону 7H5 против интегрина α5β1 для следующего: гуманизированное 7H5 антитело, основанное на прививке CDR из мышиного 7H5 (h7H5.v1) (SEQ ID NO:5), гуманизированное антитело 7H5, основанное на замене остатков в CDR-L1, -L3 и -H2 из h7H5.v1 (h7H5.v2) (SEQ ID NO:6) и гуманизированные антитела 7H5, основанные на модификации каркаса в h7H5.v2 (h7H5.v4 (SEQ ID NO:8) и h7H5.v5 (SEQ ID NO:9)). Вариабельный домен тяжелой цепи The h7H5.v3 является идентичным последовательности h7H5.v2, за исключением того, что он обладает мутацией аминокислоты N62S (последовательность VH h7H5.v3 обозначена SEQ ID NO:7).

На фигуре 3 изображены результаты анализа BIACORE^® химерного 7H5-IgG и гуманизированного 7H5.v1-IgG против интегрина α5β1 человека. (A) Химерное 7H5-IgG и гуманизированное 7H5.v1-IgG иммобилизовали в двух различных проточных ячейках сенсорного чипа CM5 по 450RU (единиц ответа), и 2-кратные серийные разведения интегрина α5β1 человека от 300 нМ до 0,29 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C. (B) Интегрин α5β1 человека иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 при 800RU, и 2-кратные серийные разведения 7H5-IgG и гуманизированного 7H5.v1-IgG от 200 нМ до 0,2 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C.

На фигуре 4 изображен фаговый конкурентный ELISA для определения IC50 фага против интегрина α5β1 человека для клона гуманизированного 7H5.v1 с единичной точечной мутацией, представленного на фаге в формате моновалентного Fab.

На фигуре 5 изображено обобщение относительной кратности изменений аффинности связывания (IC50) для каждой единичной точечной мутации по отношению к исходному клону h7H5.v1.

На фигуре 6 изображен фаговый конкурентный ELISA для определения IC50 фага против интегрина α5β1 человека для клонов гуманизированного 7H5.v1 с множественными заменами, представленных на фаге в формате моновалентного Fab. Два первых варианта получены на основании отбора из фигуры 5, как отмечено. В общем, все шесть вариантов обладали сохраненной и немного улучшенной аффинностью связывания; таким образом, два варианта, h7H5.v2 и h7H5.v3, как указано, выбрали для включения замены глицина в положении 65 CDR-H2.

На фигуре 7 изображены результаты анализа BIACORE^® гуманизированных 7H5.v1, v2 и v3-IgG против интегрина α5β1 человека. Гуманизированные 7H5.v1, v2 и v3-IgG иммобилизовали в трех различных проточных ячейках сенсорного чипа CM5 по 450RU (единиц ответа), и 2-кратные серийные разведения интегрина α5β1 человека от 300 нМ до 0,29 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C. Для гуманизированного 7H5.v2 показали наибольшее улучшение аффинности связывания для скорости диссоциации.

На фигуре 8 изображен фаговый конкурентный ELISA для определения IC50 фага против интегрина α5β1 человека для клонов гуманизированного 7H5.v2 с модификацией каркаса, представленных на фаге в формате моновалентного Fab. Для большинства замен в каркасе показали сравнимую аффинность связывания по сравнению с h7H5.v2, за исключением положений 49 и 78 тяжелой цепи с заменами глицина на серин и аланина на лейцин, соответственно.

На фигуре 9 изображены результаты анализа BIACORE^® гуманизированных 7H5.v2, v4 и v5-IgG против интегрина α5β1 человека. (A) Гуманизированные 7H5.v2, v4 и v5-IgG иммобилизовали в трех различных проточных ячейках сенсорного чипа CM5 по 450RU (единиц ответа), и 2-кратные серийные разведения интегрина α5β1 человека от 300 нМ до 0,29 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C. (B) Интегрин α5β1 человека иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 при 800RU, и 2-кратные серийные разведения гуманизированного 7H5.v2, v4 и v5-IgG от 200 нМ до 0,2 нМ инъецировали сквозь сенсорный чип для определения аффинностей связывания и кинетики при 25°C. В обоих форматах для гуманизированного 7H5.v4 показали сравнимую аффинность связывания по сравнению с гуманизированным 7H5.v2.

На фигуре 10 изображены результаты экспериментов по заживлению ранений кожи, показывающие, что введение комбинации h7H5.v2 и анти-VEGF усиливает антиангиогенные эффекты одного анти-VEGF.

На фигуре 11 изображены результаты экспериментов по заживлению ранений кожи, показывающие, что введение комбинации h7H5.v4 и анти-VEGF усиливает антиангиогенные эффекты одного анти-VEGF.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Введение

Настоящее изобретение основано на идентификации новых антител, которые связывают интегрин α5β1. Антитела против α5β1 получены из моноклонального антитела 7H5, и их можно использовать во множестве терапевтических и диагностических способов. Например, антитела против α₅β₁ можно использовать отдельно или в сочетании с другими средствами для лечения аномального ангиогенеза, неоплазии, глазных заболеваний и аутоиммунных заболеваний. Антитела можно использовать также для детекции белка α5β1 у пациентов или в образцах от пациента посредством введения антител против белка α₅β₁ пациентам и детекции антитела против α₅β₁, связанного с белком α₅β₁ в образце от пациента (например, in vivo или ex vivo) или посредством приведения антител в контакт с образцами от пациента и количественного или качественного определения антитела против α₅β₁, связанного с белком α₅β₁.

II. Определения

«Альфа5бета1» или «α5β1» или «a5b1» или «α₅β₁» представляет собой интегрин, содержащий два различных белка (т.е., субъединицы Альфа5 и бета1). Показано, что α5β1 связывается с фибронектином, L1-CAM и фибриногеном. Интегрин α5β1 известен также как белок очень поздней активации 5, VLA-5, альфа5бета1, CD49e/CD29, рецептор фибронектина, FNR и GPIc-IIa. В предпочтительном варианте осуществления α5β1 представляет собой α5β1 человека.

«Альфа5», применяемая в настоящем документе взаимозаменяемо с CD49e, α5, субъединицей интегрина альфа5, альфа-субъединицей VLA-5, субъединицей IC GPIc-IIa и альфа-цепью FNR, относится к одной субъединице интегрина α₅β₁. Альфа5 имеет четыре изоформы, получаемые альтернативным сплайсингом (A-D), которые отличаются внутри их цитоплазматических доменов. Аминокислотные последовательности изоформ альфа5 человека можно найти, например, под инвентарными номерами в Genbank: X07979, U33879, U33882 и U33880, соответственно.

«Бета1» называют также CD29, бета1, GPIIa тромбоцитов; цепь VLA-бета; цепь бета-1 интегрина, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 и VLA5B. Аминокислотные последовательности для Бета1 человека можно найти, например, под инвентарным номером в Genbank No. X06256.

Термин «VEGF», как применяют в настоящем документе, относится к фактору роста эндотелиальных клеток сосудов человека из 165 аминокислот и родственным факторам роста эндотелиальных клеток сосудов человека из 121, 189 и 206 аминокислот, как описано в Leung et al. Science, 246: 1306 (1989), и Houck et al. Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991), вместе с их природными аллельными и процессированными формами. Термин «VEGF» относится также к VEGF из не относящихся к человеку видов, таких как мышь, крыса или примат. Иногда VEGF из конкретных видов указывают такими терминами, как hVEGF для VEGF человека, mVEGF для VEGF мыши и т.д. Термин «VEGF» используют также для обозначения усеченных форм полипептида, содержащих аминокислоты 8-109 или 1-109 из фактора роста эндотелиальных клеток сосудов человека из 165 аминокислот. Ссылку на любую из таких форм VEGF можно идентифицировать в настоящей заявке, например, посредством «VEGF(8-109)», «VEGF(1-109)» или «VEGF₁₆₅». Положения аминокислот для «усеченного» природного VEGF пронумерованы, как указано в природной последовательности VEGF. Например, положение аминокислоты 17 (метионин) в усеченном природном VEGF представляет собой также положение 17 (метионин) в природном VEGF. Усеченный природный VEGF обладает аффинностью связывания для рецепторов KDR и Flt-1, сравнимой с аффинностью природного VEGF. В предпочтительном варианте осуществления VEGF представляет собой VEGF человека.

«Антагонист VEGF» относится к молекуле, способной осуществлять нейтрализацию, блокирование, ингибирование, устранение, снижение или препятствование активности VEGF, включая его связывание с VEGF или с одним или несколькими рецепторами для VEGF, или с кодирующей их нуклеиновой кислотой. Предпочтительно, антагонист VEGF связывает VEGF или рецептор VEGF. Антагонисты VEGF включают в себя антитела против VEGF и их антигенсвязывающие фрагменты, полипептиды, которые связывают VEGF и рецепторы VEGF и блокируют взаимодействие лиганд-рецептора (например, иммуноадгезины, пептидные антитела), антитела против рецептора VEGF и антагонисты рецептора VEGF, такие как низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR, аптамеры, которые связывают VEGF, и нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в строгих условиях с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими VEGF или рецептор VEGF (например, РНКи). В предпочтительном варианте осуществления, антагонист VEG связывает VEGF или рецептор VEGF с Kd между 1 мкМ и 1 пМ. В другом предпочтительном варианте осуществления антагонист VEGF связывает VEGF или рецептор VEGF между 500 нМ и 1 пМ.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEGF связывает VEGF и ингибирует индуцированную VEGF пролиферацию эндотелиальных клеток in vitro. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEGF связывает VEGF или рецептор VEGF с большей аффинностью, чем не относящуюся к VEGF молекулу или рецептор не относящейся к VEGF молекулы. В одном из предпочтительных вариантов осуществления антагонист VEG связывает VEGF или рецептор VEGF с Kd между 1 мкМ и 1 пМ. В другом предпочтительном варианте осуществления антагонист VEGF связывает VEGF или рецептор VEGF между 500 нМ и 1 пМ.

В предпочтительном варианте осуществления антагонист VEGF выбран из группы, состоящей из полипептида, такого как антитело, пептидное антитело, иммуноадгезин, малая молекула или аптамер. В предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой антитело против VEGF, такое как антитело АВАСТИН® или антитело против рецептора VEGF, такое как антитело против VEGFR2 или против VEGFR3. Другие примеры антагонистов VEGF включают в себя: VEGF-ловушку, мукаген, PTK787, SUl 1248, AG-013736, Bay 439006 (сорафениб), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 и KRN-633.

«Антитело против VEGF» представляет собой антитело, связывающее VEGF с достаточной аффинностью и специфичностью. Предпочтительно, антитело против VEGF по изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства для нацеливания на заболевания или состояния, в которые вовлечена активность VEGF, и создания помех для них. Антитело против VEGF обычно не связывается ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как PlGF, PDGF или bFGF. Предпочтительное антитело против VEGF представляет собой моноклональное антитело, связывающее тот же самый эпитоп, что и моноклональное антитело против VEGF A4.6.1, продуцируемое гибридомой ATCC HB 10709. Более предпочтительно, антитело против VEGF представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, полученное согласно Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, включая, в качестве неограничивающих примеров, антитело, известное как бевацизумаб (BV; Авастин®). В другом варианте осуществления, антитела против VEGF, которые можно использовать, включают в себя в качестве неограничивающих примеров антитела, описанные в WO 2005/012359. В одном из вариантов осуществления антитело против VEGF содержит вариабельную тяжелую и вариабельную легкую область из любого из антител, описанных на фигурах 24, 25, 26, 27 и 29 из WO 2005/012359 (например, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 и B20.4.1). В другом предпочтительном варианте осуществления антитело против VEGF, известное как ранибизумаб, представляет собой антагонист VEGF, вводимый при глазном заболевании, таком как диабетическая ретинопатия и влажная AMD.

Антитело против VEGF «Бевацизумаб (BV)», известное также как «rhuMAb VEGF» или «Авастин®», представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против VEGF, полученное согласно Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. Оно содержит мутантные каркасные области IgG1 человека и антигенсвязывающие определяющие комплементарность области из мышиного моноклонального антитела против hVEGF A.4.6.1, блокирующие связывание VEGF с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть каркасных областей, получено из IgG1, и приблизительно 7% последовательности получено из мышиного антитела A4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу приблизительно 149000 дальтон и является гликозилированным. Другие антитела против VEGF включают в себя антитела, описанные в патенте США No. 6884879 и WO 2005/044853.

Антитело против VEGF Ранибизумаб или антитело ЛУЦЕНТИС® или rhuFab V2 представляет собой гуманизированный, подвергнутый аффинному созреванию Fab-фрагмент против VEGF человека. Ранибизумаб получают общепринятыми способами посредством рекомбинантной технологии в экспрессирующем векторе E. coli и бактериальной ферментации. Ранибизумаб не является гликозилированным и обладает молекулярной массой ~48000 дальтон. Смотри WO98/45331 и U.S. 2003/0190317.

Моноклональное антитело против альфа5/бета1, известное как 7H5, депонировано в ATCC как 7H5.4.2.8 (ATCC No. PTA-7421) 7 марта 2006 г.

Молекулы, такие как антитела, характеризующиеся связыванием с перекрывающимися или сходными областями на мишени, можно идентифицировать анализами конкурентного ингибирования/связывания.

В одном варианте осуществления HUVEC или другие клетки, экспрессирующие α5β1, используют в конкурентном анализе ингибирования, и FACS используют для оценки местоположений связывания двух антител против α5β1 друг относительно друга. Например, клетки HUVEC можно промывать в конической пробирке и центрифугировать 5 мин при 1000 об/мин. Осадок, как правило, промывают два раза. Затем клетки можно ресуспендировать, подсчитать и сохранять на льду до использования. 100 мкл первого антитела против α₅β₁ (например, начиная с концентрации 1 мкг/мл или более низкой концентрации) можно добавлять в лунку. Затем 100 мкл (например, 20×10⁵ клеток) клеток можно добавлять в лунку и инкубировать на льду в течение 30 мин. Затем 100 мкл биотинилированного антитела против α5β1 (исходный раствор 5 мкг/мл) можно добавлять в каждую лунку и инкубировать на льду в течение 30 мин. Затем клетки промывают и осаждают в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант отсасывают. Второй реагент, конъюгированный с R-фикоэритрином стрептавидин (Jackson 016-110-084), добавляют в лунку (100 мкл, 1:1000). Затем планшет можно завернуть в фольгу и инкубировать на льду 30 мин. После инкубации осадок можно промывать и осаждать 5 мин при 1000 об/мин. Осадок можно ресуспендировать и переносить в пробирки для микротитрования для анализа FACS.

«Ангиогенный фактор или средство» представляет собой фактор роста, стимулирующий развитие кровеносных сосудов, например стимулирующий ангиогенез, рост эндотелиальных клеток, стабильность кровеносных сосудов и/или васкулогенез и т.д. Ангиогенные факторы включают в себя в качестве неограничивающих примеров, например, VEGF и члены семейства VEGF, PlGF, семейство PDGF, семейство фактора роста фибробластов (FGFs), лиганды TIE (ангиопоэтины), эфрины, Del-1, факторы роста фибробластов: кислый (aFGF) и основной (bFGF), фоллистатин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), фактор роста гепатоцитов (HGF) /рассеивающий фактор (SF), интерлейкин-8 (IL-8), лептин, мидкин, фактор роста плаценты, тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF), тромбоцитарный фактор роста, особенно PDGF-BB или PDGFR-бета, плейотропин (PTN), програнулин, пролиферин, трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-альфа), трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-альфа), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)/фактор проницаемости сосудов (VPF) и т.д. Ангиогенные факторы включают в себя также факторы, ускоряющие заживление ран, такие как гормон роста, инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I), VIGF, эпидермальный фактор роста (EGF), CTGF и члены его семейства, и TGF-альфа и TGF-бета. Смотри, например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, Таблица 1 с перечислением известных ангиогенных факторов); и Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003).

По этому изобретению в одном предпочтительном варианте осуществления «Kd» или «значение Kd» для антитела против VEGF измеряют посредством анализа связывания радиоактивно меченного VEGF (RIA), проведенного с вариантом Fab антитела и молекулой VEGF, как описано в следующем анализе, где аффинность связывания Fab с VEGF в растворе измеряют посредством уравновешивания Fab минимальной концентрацией (¹²⁵I)-меченного VEGF(109) в присутствии серий для титрования немеченного VEGF с удерживанием затем связанного VEGF на планшете, покрытом антителом против Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Чтобы подготовить условия для этого анализа, микропланшеты для титрования (Dynex) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл антитела для захвата против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (pH 9,6) и затем блокируют 2% (масс./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620) 100 пМ или 26 пМ [¹²⁵I] VEGF(109) смешивают с серийными разведениями интересующего Fab, например Fab-12 (Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем интересующий Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубацию можно продолжать в течение 65 часов, чтобы убедиться, что равновесие достигнуто. Затем смеси переносят в планшет для захвата для инкубации при комнатной температуре в течение одного часа. Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% Tween-20 в PBS. Когда планшеты высыхают, добавляют 150 мкл/лунку сцинтиллятора (MicroScint-20; Packard), и планшеты просчитывают на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, обеспечивающие связывание, меньшее или равное 20% от максимального, выбирают для использования в конкурентных анализах связывания. Согласно другому варианту осуществления Kd или значение Kd измеряют с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с чипами CM5 с иммобилизованным hVEGF при ~10 единицах ответа (RU). Коротко, биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям производителя. VEGF человека разводят в 10 мМ ацетате натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/минуту для достижения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После инъекции VEGF инъецируют 1 M этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для измерений кинетики инъецируют двукратные серийные разведения Fab (0,78 нМ - 500 нМ) в PBS с 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости связывания (k_on) и скорости диссоциации (k_off) вычисляют с использованием простой модели связывания один-к-одному Лэнгмюра (программное обеспечение BIAcore Evaluation версии 3.2) посредством одновременного подбора для сенсограмм связывания и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (Kd) вычисляют как соотношение k_off/k_on. Смотри, например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Если скорость связывания превышает 10⁶ M^-1 сек^-1 по вышеописанному анализу поверхностного плазмонного резонанса, тогда скорость связывания можно определить с использованием способа тушения флуоресценции, которым измеряют увеличение или уменьшение интенсивности испускания флуоресценции (возбуждение = 295 нм; испускание = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°C для 20 нМ антитела против VEGF (форма Fab) в PBS, pH 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций короткой формы VEGF чело