Дрожжи saccharomyces cerevisiae, используемые в качестве пробиотика, и композиция на их основе

Дрожжи saccharomyces cerevisiae, используемые в качестве пробиотика, и композиция на их основе

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к области питания и здоровья человека и/или животного.

Изобретение более предпочтительно относится к новым штаммам дрожжей и новым дрожжам, получаемым исходя из новых штаммов. Такие дрожжи являются особенно полезными для комфортного состояния пищеварительного тракта и/или для предупреждения и/или лечения нарушений пищеварительного тракта человека или животного.

В литературе описано множество микроорганизмов для полезного применения у человека в пищеварительном тракте и в целях питания, см., например, WO 2006/021965.

Такие микроорганизмы традиционно обозначают термином "пробиотик", относящимся к активным микроорганизмам, способным приносить организму-хозяину пользу в отношении здоровья в том случае, когда их введение осуществляется в достаточном количестве (Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr 85, ISBN 92-5-105513-0).

Полезный результат при пероральном введении микроорганизмов в большой степени зависит не только от штамма используемого микроорганизма, но также и от формы введения. Даже среди одного вида, в зависимости от используемых штаммов, наблюдаемые эффекты на практике очень сильно варьируют и являются иногда положительными, иногда отрицательными или нейтральными, как, например, для вида Escherichia coli, в котором можно найти как патогенные штаммы (например, типа энтеротоксиногенных или энтерогеморрагических), так и полезные штаммы, как, например, штамм Nissle 1917 (M. de Vrese; P.R. Marteau. Probiotics and Prebiotics: Effects on Diarrhea. 2007, J. Nutr., 137 (3 Suppl. 2), 803S-811S). Таким образом, в настоящее время в отношении заданного штамма невозможно предсказать, что при введении такого штамма можно рассчитывать на полезный эффект в отношении здоровья человека, и даже предусмотреть природу его возможного полезного эффекта или его интенсивность.

Некоторые штаммы микроорганизмов, в частности среди дрожжей и молочных бактерий, уже были идентифицированы в отношении некоторых случаев полезного действия на желудочно-кишечный тракт. Тем не менее, получение комплексного полезного действия на желудочно-кишечный тракт часто требует сопутствующего введения нескольких штаммов различной природы (I. Goktepe; V.K. Juneja; M. Ahmedna (eds). Probiotics in Food Safety and Human Health. 2006, CRC Taylor & Francis, ISBN 1-57444-514-6).

Кроме того, было замечено, что достаточно многие микроорганизмы, в частности молочные бактерии, обладают провоспалительным действием. Такой провоспалительный эффект может оказаться особенно вредным и нежелательным, например, в случае аутоиммунных заболеваний или иммуннодефицита.

Описаны некоторые фракции дрожжей и/или производные продукты дрожжей в отношении их полезного действия на пищеварительный тракт.

Так, например, маннопротеины, являющиеся производными продуктами дрожжей, описаны в отношении их ингибирующего действия на адгезию патогенов. Описаны также продукты клеточных стенок дрожжей в отношении их действия подобно волокнам. Однако, существует множество штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые совсем не оказывают полезное действие или такие же эффекты.

Кроме того, в зависимости от используемых штаммов и форм вводимых дрожжей эффекты также могут очень сильно варьировать.

Таким образом, существует потребность в возможности располагать новыми штаммами микроорганизмов, которые могут оказывать полезное действие в отношении здоровья профилактически и/или терапевтически на известные или предполагаемые патологии или нарушения или на общее состояние как физического, так и психического здоровья.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является новый штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3856, и новый штамм Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, депонированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3799.

Объектом настоящего изобретения являются также дрожжи Saccharomyces cerevisiae, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3856, и дрожжи Saccharomyces var. boulardii, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3799.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая дрожжи Saccharomyces cerevisiae, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3856, и/или дрожжи Saccharomyces var. boulardii, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3799, и/или по меньшей мере один производный продукт дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выбранный из экстрактов дрожжей, производных продуктов клеточных стенок, париетальных глюканов, париетальных маннопротеинов, липидных фракций дрожжей, фракций нуклеиновых кислот дрожжей (РНК, ДНК).

Композиция по настоящему изобретению имеет следующие преимущества:

- способность, в частности, в сухих формах сопротивляться и выживать при переходе желудочного барьера, что позволяет оптимизировать ее действие на желудочно-кишечный тракт;

- противовоспалительное действие;

- отсутствие провоспалительного действия или очень слабое такое действие;

- способность уменьшать боли в кишечнике;

- способность затруднять и уменьшать адгезию и заселение бактериями, являющимися патогенными и/или имеющими инвазивный характер, желудочно-кишечного тракта, в частности тонкого кишечника и толстой кишки.

Такая новая композиция, обладающая такой комбинацией характеристик, до настоящего времени еще не была описана или идентифицирована.

Таким образом, данная композиция представляет собой исключительный интерес.

Другим объектом настоящего изобретения является применение упомянутой композиции для получения пищевой добавки и/или пробиотика, и/или продукта для лечебно-профилактического питания, и/или биологически активной добавки, и/или функциональных ингредиентов, и/или лечебно-косметического средства, и/или фармацевтически активного вещества, предназначенных для человека и/или животного.

В то же время настоящее изобретение относится к применению композиции, такой, как определено ранее, для получения пищевых композиций, предназначенных для улучшения комфортного состояния желудочно-кишечного тракта и/или улучшения кишечной микрофлоры.

Объектом настоящего изобретения является также применение композиции, такой, как определено ранее, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики расстройств кишечника, функциональных нарушений кишечника или заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Объектом настоящего изобретения является также применение композиции, такой, как определено ранее, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики патологий или расстройств кишечника, характеризующихся состоянием гипералгезии.

Последним объектом настоящего изобретения является набор, содержащий по меньшей мере один вид дрожжей и/или по меньшей мере один производный продукт дрожжей, таких, как определено ранее, в форме, приемлемой для перорального введения.

Штамм, депонированный заявителем в соответствии с Будапештским договором в Национальной коллекции культур микроорганизмов (институт Пастера, Париж) под № CNCM I-3856, в дальнейшем описании для краткости обозначается "ScPro1".

Штамм, также депонированный заявителем в соответствии с Будапештским договором в Национальной коллекции культур микроорганизмов (институт Пастера, Париж) под № CNCM I-3799, в дальнейшем описании для краткости обозначается "SCB1".

Также для краткости производный продукт дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выбранный из экстрактов дрожжей, производных продуктов клеточных стенок, париетальных глюканов, париетальных маннопротеинов, липидных фракций дрожжей, фракций нуклеиновых кислот дрожжей (РНК, ДНК) и их смесей, в дальнейшем описании упоминается как "производное".

Под пробиотиком понимают активные микроорганизмы, которые, в случае их введения в достаточном количестве, оказывают положительное действие на здоровье, комфортное состояние и хорошее самочувствие помимо традиционных питательных эффектов.

Под продуктом для лечебно-профилактического питания или биологически активной добавкой, или функциональным пищевым продуктом, или лечебно-косметическим средством понимают пищевой продукт, который содержит ингредиенты, оказывающие полезное действие на здоровье или способные улучшить физиологические функции.

Под пищевой добавкой понимают пищевой продукт, предназначением которого является дополнение нормального пищевого режима. Пищевая добавка представляет собой концентрированный источник питательных веществ или других веществ, обладающих питательным или физиологическим действием, в том случае, когда их используют индивидуально или в комбинации в малых количествах.

Под пищевыми продуктами, предназначенными для специального питания (DDAP), понимают пищевые продукты, целью которых является особое питание, предназначенное для четко определенной группы населения, такой, как грудные дети, дети младшего возраста, спортсмены.

Пищевая композиция, такая, как упомянуто в настоящем изобретении, может представлять собой пищевую добавку или DDAP.

Штаммы по настоящему изобретению были выявлены заявителем благодаря их многочисленным преимуществам и, в частности, благодаря их способности индуцировать полезное действие на пищеварительный тракт человека и, в частности, на тонкий кишечник и толстую кишку, а также на организм в целом.

На практике было замечено, что дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные неожиданным образом способны индуцировать противовоспалительное действие в противоположность достаточно большому числу штаммов дрожжей и при этом без провоспалительного действия.

На практике дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные вызывают увеличение секреции интерлейкина IL-10, вовлеченного в противовоспалительные сигналы. Кроме того, в отличие от действия пробиотических бактерий типа лактобактерий дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные не индуцируют синтез провоспалительного цитокина IL-12. Продуцирование провоспалительных цитокинов TNFα и IFNγ также заметно меньше по сравнению с бактериальными пробиотиками. В то же время испытания позволили доказать противовоспалительный эффект in vivo дрожжей ScPro1 и, в частности, уменьшение вдвое степени воспаления толстой кишки и уменьшение на треть кишечного некроза.

Кроме того, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные в их сухих формах способны преодолевать желудочный барьер без каких-либо отрицательных последствий на их выживаемость или их целостность, при этом данные дрожжи не внедряются во внутреннюю среду толстой кишки.

Заявителем впервые и неожиданно доказано, что дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные способны увеличивать сопротивляемость к боли, в частности, на модели с крысой in vivo.

В дополнение к данному полезному действию дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные способны ингибировать заселение и/или инвазию на уровне кишечника микроорганизмов, являющихся патогенными и/или имеющих инвазивный характер. Введение данных дрожжей вызывает уменьшение численности энтеробактерий на уровне толстой кишки и кишечной микрофлоры, устойчивой к антибиотикам.

В частности, заявителем была показана профилактическая и терапевтическая активность против заселения кишечника дрожжами Candida albicans и воспалений, провоцируемых и поддерживаемых данным патогеном. В то же время, данные дрожжи проявляют ингибирующее действие на способность к адгезии и инвазии штаммов, являющихся патогенными и/или имеющих инвазивный характер, патотипов Escherichia coli, выделенных из биопсийных материалов тонкого кишечника больных, страдающих болезнью Крона.

По настоящему изобретению дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть введены в активной или реактивируемой форме предпочтительно пероральным путем.

Под терминами "активная форма" или "активные" по настоящему изобретению понимают то обстоятельство, что дрожжи обладают активным или реактивируемым метаболизмом или способны к размножению. Речь идет, в частности, о дрожжах в сухом или свежем виде.

Как правило, дрожжи в свежем виде находятся в форме прессованных или крупитчатых дрожжей. Они могут находиться также в форме дрожжей в виде суспензии на водной основе, называемых также жидкими дрожжами. В данном случае дрожжи предпочтительно являются инкапсулированными. Способы инкапсулирования и различные типы капсул хорошо известны специалистам в данной области техники.

Среди сухих форм дрожжей можно упомянуть дрожжи, которые могут находиться в сухой быстрорастворимой или сухой активной форме. Под сухими дрожжами понимают любые дрожжи, имеющие содержание сухого вещества больше 90% и предпочтительно в интервале приблизительно от 92 до 96%.

Среди сухих дрожжей также можно упомянуть быстрозамороженные или незамороженные дрожжи со средней влажностью.

Быстрорастворимые сухие дрожжи предназначены главным образом для крупных и мелких хлебопекарных предприятий. Другие варианты применения и сбыта возможны на основе пищевого назначения (технология лекарственных форм, спиртовое брожение). Особенность данных сухих дрожжей состоит в том, что они не требуют увлажнения перед прибавлением к муке.

Данные дрожжи получают обезвоживанием дрожжей под действием градиента горячего воздуха, позволяющего превращать пастообразный продукт (прессованные или жидкие дрожжи) в продукт в виде тонкой сухой вермишели, который при этом остается активным. Затем продукт с целью обеспечения стабильности должен быть расфасован в отсутствии кислорода.

Сухие активные дрожжи представляют собой активные дрожжи, высушенные при низкой температуре с целью сохранения их ферментирующей способности и обеспечения достаточно длительного хранения. Дрожжи находятся в форме сферических частиц.

Данные дрожжи получают обезвоживанием дрожжей при совместном действии тепла и механического воздействия, которые позволяют превращать дрожжи в пастообразной форме в сухой продукт, сохраняя их жизнеспособность.

Выбранные сухие активные дрожжи получают экструзией и высушиванием в псевдоожиженном слое биомассы (активные клетки дрожжей). Такие сухие активные дрожжи, то есть сухие дрожжи, имеющие высокое содержание активных клеток дрожжей, находятся в форме гранул в общем случае с диаметром от 0,1 мкм до 2,5 мм и содержанием H₂O от 4 до 8% масс.

Такие сухие формы обладают преимуществом, состоящим в том, что они обеспечивают более хорошую гастрорезистентность по сравнению с формой свежих дрожжей и оптимизируют полезное действие дрожжей по настоящему изобретению. Дрожжи по настоящему изобретению предпочтительно находятся в форме сухих активных дрожжей.

В общем случае известно, что провоспалительные цитокины стимулируют воспалительные механизмы, которые при этом могут быть ответственными за достаточно многие клинические проблемы, в частности, в случаях аутоиммунных заболеваний или иммуннодефицита.

Так, например, дрожжи по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики и/или лечения как хронических, так и острых заболеваний или воспалительных расстройств кишечника, необязательно связанных с диареей или запорами.

В первом варианте осуществления настоящего изобретения расстройства и заболевания необязательно связаны с диареей.

Во втором варианте осуществления настоящего изобретения расстройства и заболевания не связаны с диареей. В частности, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть полезными для профилактики или лечения колитов, которые характеризуются в основном воспалением толстой кишки.

В частности, данные дрожжи являются в хорошей степени приемлемыми для профилактики и/или лечения хронических воспалительных заболеваний кишечника (MICI), в частности, язвенного колита, геморрагического ректоколита, целиакии или болезни Крона.

Данные заболевания характеризуются, в частности, обостренным иммунным ответом, в который вовлечены многие воспалительные каскады. Так, например, в рамках профилактики или лечения данных заболеваний пробиотиком и/или продуктом для лечебно-профилактического питания, и/или функциональным пищевым продуктом, и/или биологически активной добавкой, и/или лечебно-косметическим средством, является важным, чтобы провоспалительные эффекты были как можно более слабыми.

Таким образом, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные по настоящему изобретению являются наиболее предпочтительно приемлемыми для такого применения. Данные дрожжи обладают несколькими дополнительными преимуществами.

Первым преимуществом является то, что они обладают способностью увеличивать сопротивляемость к боли. Второе преимущество, в частности в случае болезни Крона, состоит в том, что данные дрожжи способны, в частности, ингибировать способность к адгезии и инвазии штаммов, являющихся патогенными и/или имеющих инвазивный характер E. coli, происходящих от больных, страдающих данным заболеванием.

Воспалительный ответ может быть, в частности, обусловлен инвазией любых патогенных микроорганизмов.

Так, например, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные по настоящему изобретению проявляют хорошую эффективность при профилактике или лечении желудочно-кишечных нарушений или заболеваний, обусловленных заселением кишечника микроорганизмами, являющимися патогенными и/или имеющими инвазивный характер прокариотов, таких, как бактерии, или эукариотов, таких, как грибы.

Желудочно-кишечные нарушения или заболевания могут представлять собой хронические воспалительные кишечные заболевания, такие, как язвенный колит, целиакия, болезнь Крона, геморрагический ректоколит.

Помимо того, что дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные позволяют увеличивать сопротивляемость к боли, они представляют собой также интерес для профилактики или лечения патологий или расстройств кишечника, сопровождаемых состоянием гипералгезии. Такие патологии или расстройства могут представлять собой предпочтительно функциональные кишечные расстройства, хронические воспалительные заболевания кишечника (MICI) или пищевую непереносимость (аллергии, выработка условных рефлексов и т.д.), характеризующиеся хронической висцеральной болью.

Данные дрожжи предпочтительно приемлемы для профилактики или лечения гипералгезии, в частности, синдрома раздражения кишечника (SII) любой формы (запор, диарея или их комбинация), а также хронических висцеральных болей, не относящихся к SII, таких, как функциональные абдоминальные боли без затруднений дефекации (FAPS: Functional Abdominal Pain) и боли, связанные с пищевой непереносимостью и целиакией.

Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные, или любые композиции, содержащие их, могут быть также приемлемыми в качестве профилактики у пациентов, имеющих предрасположенность или повышенную чувствительность к нарушениям или заболеваниям такого типа, или в качестве лечения, например, в случае кризисов или в течение более длительных периодов. Композиции и способы по настоящему изобретению могут уменьшать страдания больных, ослаблять симптомы или причину таких нарушений.

Объединение действия данных дрожжей и/или их производных по настоящему изобретению на боль, воспаление и микроорганизмы, являющиеся патогенными и/или имеющие инвазивный характер, вызывает некоторым образом улучшение самочувствия, здоровья и/или комфортного состояния желудочно-кишечного тракта человека или животного.

Композиция по настоящему изобретению может содержать дрожжи ScPro1 и/или дрожжи SCB1, и/или по меньшей мере одно производное дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выбранное из экстрактов дрожжей, производных продуктов клеточных стенок, париетальных глюканов, париетальных маннопротеинов, липидных фракций дрожжей, фракций нуклеиновых кислот дрожжей (РНК, ДНК), в количестве в интервале приблизительно от 10⁷ до 6·10¹⁰ КОЕ и предпочтительно в интервале от 10⁸ до 2·10¹⁰ КОЕ или в интервале от 1 мг до 10 г и предпочтительно в интервале от 1 мг до 1 г. Такое количество может представлять собой суточное количество, принимаемое в один или несколько приемов в течение суток.

Предпочтительно дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные применяют при терапевтическом или нетерапевтическом назначении в суточной дозе в интервале от 10⁷ до 6·10¹⁰ КОЕ (колониеобразующих единиц) и предпочтительно в интервале от 10⁸ до 2·10¹⁰ КОЕ.

В случае, когда дрожжи и/или их производные находятся в активной, а не в реактивируемой форме, суточная доза, приемлемая при терапевтическом или нетерапевтическом назначении, находится предпочтительно в интервале от 1 мг до 10 г и более предпочтительно в интервале от 1 мг до 1 г. Эффективная суточная доза может быть введена в один, два, три или четыре приема.

Дрожжи и/или их производные по настоящему изобретению или композиции, содержащие их, предпочтительно вводят пероральным путем. Их количество может составлять терапевтически эффективную дозу, что означает, что по меньшей мере один из симптомов уменьшается или подавляется.

Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть включены в пищевую композицию, предназначенную для человека или животного, и/или введены с эксципиентами или наполнителями, приемлемыми для перорального введения.

Композиция, предназначенная для питания человека, может представлять собой жидкость, пасту или твердое вещество. В частности, композиция может представлять собой молочный продукт, такой, как сыр, масло, йогурт или сливки, продукт на основе фруктов, такой, как фруктовый сок, компот или фруктовая паста, напиток или твердый пищевой продукт, например, легкие закуски, галеты, или другой продукт. Таким образом, композиция содержит дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные и компоненты пищевого продукта или напитка.

Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные также могут быть включены в фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция является приемлемой для перорального введения. Таким образом, она содержит дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные, а также соответствующую традиционную основу, выбранную из эксципиентов, разрешенных для применения в фармацевтических композициях. Композиция может быть изготовлена в виде жидкости, такой, как сироп или ампулы для питья, или в виде таблеток, желатиновых капсул, пакетиков, капсул или порошков и других приемлемых галеновых препаратов.

Кроме того, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть введены с другими пробиотиками и/или другими функциональными ингредиентами, в частности, с пробиотическими бактериями, в частности, для наиболее полного профилактического действия.

В качестве примера можно упомянуть молочные бактерии родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Pediococcus, Propionibacterium или Leuconostoc.

Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные также могут быть введены с другими активными веществами, такими как антибиотики, аналгетические средства, противодиарейные средства, слабительные средства и их смеси.

Далее настоящее изобретение поясняется примерами и фигурами, приведенными в порядке пояснения и неограничительным образом:

- на фиг.1 показано изменение выживаемости дрожжей ScPro1 в пищеварительной системе, моделирующей толстую кишку человека, соответственно примеру 2;

- на фиг.2 показано действие дрожжей ScPro1 на микрофлору толстой кишки соответственно примеру 2;

- на фиг.3 и 4 показано изменение численности клеток Candida albicans в испражнениях мышей в опытах 1 и 2 примера 5, соответствующих модели профилактики (фиг.3) и лечения (фиг.4);

- на фиг.5 показана процентная доля остаточной адгезии клеток Escherichia coli AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника человека в зависимости от количества дрожжей ScPro1 при предварительной инкубации; клетки дрожжей инкубировали с эпителиальными клетками кишечника в течение часа. Инфицирование клеток штаммом AIEC LF82 осуществляли в присутствии дрожжей ScPro1 соответственно примеру 6;

- на фиг.6 показана процентная доля остаточной адгезии клеток Escherichia coli AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника человека в зависимости от количества дрожжей ScPro1 при совместной инкубации; клетки дрожжей и клетки Escherichia coli инкубировали одновременно с эпителиальными клетками кишечника в течение часа соответственно примеру 6;

- на фиг.7 показана оценка интенсивности воспаления кишечника мышей согласно макроскопической шкале Wallace после введения дрожжей ScPro1 и SCB1 соответственно примеру 4;

- на фиг.8 показана оценка интенсивности воспаления интестинального эпителия кишечника мышей согласно гистологической шкале Ameho после введения дрожжей ScPro1 и SCB1 соответственно примеру 4;

- на фиг.9 показана оценка интенсивности воспаления кишечника мышей согласно макроскопической шкале Wallace после введения дрожжей ScPro1 и SCB1, введенных по отдельности или в комбинации, соответственно примеру 4;

- на фиг.10 показана оценка интенсивности воспаления интестинального эпителия мышей согласно гистологической шкале Ameho после введения дрожжей ScPro1 и SCB1, введенных по отдельности или в комбинации, соответственно примеру 4;

- на фиг.11 показан уровень экспрессии иРНК гена, кодирующего белок IL-10, через один и три часа после приведения в контакт дрожжей или их производных по настоящему изобретению с эпителиальными клетками кишечника человека соответственно примеру 7;

- на фиг.12 показан уровень экспрессии иРНК гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα, через один и три часа после приведения в контакт дрожжей или их производных по настоящему изобретению с эпителиальными клетками кишечника человека соответственно примеру 7;

- на фиг.13 показано модулирование экспрессии иРНК гена, кодирующего белок IL-10, через один и три часа после приведения в контакт производных дрожжей по настоящему изобретению с эпителиальными клетками кишечника человека соответственно примеру 7;

- на фиг.14 показана экспрессия гена, кодирующего белок IL-10, в эпителиальных клетках кишечника мышей после введения дрожжей и/или их производных по настоящему изобретению (пример 4);

- на фиг.15 показана экспрессия гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα, в эпителиальных клетках кишечника мышей после введения дрожжей и/или их производных по настоящему изобретению (пример 4);

- на фиг.16 показано количество цитокина IL-10 в пг/мл, секретированного интестинальными клетками биопсийных материалов больных, не обязательно страдающих болезнью Крона, после приведения их в контакт с дрожжами и/или их производными по настоящему изобретению (пример 8);

- на фиг.17 показано количество цитокина TNF-α в пг/мл, секретированного интестинальными клетками биопсийных материалов больных, не обязательно страдающих болезнью Крона, после приведения их в контакт с дрожжами и/или их производными по настоящему изобретению (пример 8);

- на фиг.18 показаны результаты испытаний по определению способности связывания пили типа 1 с маннопротеиновыми фракциями (EL05 и EL06) дрожжей ScPro1;

- на фиг.19A и 19B показана соответственно средняя процентная доля остаточной адгезии и остаточной инвазии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам T84 в случае совместной инкубации с возрастающими концентрациями дрожжей (пример 6) - *p < 0,05, **p < 0,01;

- на фиг.20A и 20B показана соответственно средняя процентная доля адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам T84 в случае совместной инкубации с возрастающими концентрациями маннопротеинов дрожжей EL05 (пример 6);

- на фиг.21A и 21B показана соответственно средняя процентная доля остаточной адгезии и остаточной инвазии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам T84 в случае предварительной инкубации с возрастающими концентрациями дрожжей (пример 6) - *p < 0,05, **p < 0,01;

- на фиг.22A и 22B показана соответственно средняя процентная доля адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам T84 в случае предварительной инкубации с возрастающими концентрациями маннопротеинов дрожжей EL05 (пример 6) - *p < 0,05, **p < 0,01;

- на фиг.23 показана процентная доля остаточной адгезии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам CHO-K1 и CHO-K1/CEACAM6 в случае предварительной инкубации с возрастающими концентрациями дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (пример 6) - *p < 0,05, **p < 0,01;

- на фиг.24 показана адгезия штамма AIEC LF82 или не имеющего пили мутанта LF82-δfimH на щеточной каемке энтероцитов 3 образцов клеток больных, страдающих болезнью Крона (пример 6);

- на фиг.25 показаны результаты измерений порога восприятия боли (в мм рт. ст.) здоровыми крысами в случае различных дрожжей (пример 9);

- на фиг.26 показаны результаты измерений порога восприятия боли (в мм рт. ст.) крысами с висцеральной повышенной чувствительностью в случае различных дрожжей (пример 9).

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Выживаемость дрожжей ScPro1 и/или SCB1 в искусственной пищеварительной среде, моделирующей кишечник человека

Исследование изменения дрожжей ScPro1 и/или SCB1 в процессе прохождения желудочно-кишечного тракта

Дрожжи ScPro1 и SCB1 были испытаны и исследованы in vivo в искусственной пищеварительной среде, моделирующей пищеварение человека, и, в частности, путем исследования выживаемости испытуемых жизнеспособных дрожжей в процессе прохождения желудочно-кишечного тракта.

Были испытаны два образца сухих активных дрожжей ScPro1 и два образца сухих активных дрожжей SCB1.

Два образца отличались временем хранения при комнатной температуре в вакууме: продолжительность хранения до 6 месяцев и до 2 лет.

Экспериментальные условия

Процессы пищеварения осуществляли в системе, называемой TIM1 (желудок + тонкий кишечник), в соответствии с экспериментальными условиями, установленными исходя из данных, полученных из литературных источников, и воспроизводя переваривание жидкого пищевого продукта (воды) взрослым здоровым человеком натощак с удалением продуктов пищеварения диализом и абсорбцией. Каждый цикл пищеварения осуществляли в течение 5 часов. Все эксперименты с пищеварением осуществляли в одних и тех же общих опытных условиях, описанных далее.

Температура: температуру поддерживали равной 37°C.

Параметры опорожнения желудка: Опорожнение желудка осуществляли соответственно зависимости, определенной Elashoff и соавт. (1982) и выраженной соответственно формуле:

F = 1 − 2 − ( t / T ) b

где F означает порцию удаляемой пищи, t означает время, T означает время полувыведения пищевого продукта, а b означает параметр, описывающий форму кривой. Принятые параметры: T = 15 мин; b = 1.

Параметры опорожнения тонкого кишечника: опорожнение тонкого кишечника осуществляли соответственно модифицированной зависимости Elashoff (при этом введение параметра d обеспечивает замедление опорожнения в конце пищеварения, F_m = F + d·t³). Принятые параметры: T = 150 мин; b = 2,4; d = -10^-7 (ср. фиг.2).

Заданные значения pH:

желудок (мин/ед. pH): 0/6,0; 10/3,2; 20/2,4; 40/1,8; 60/1,6; 90/1,5; 300/1,5;

двенадцатиперстная кишка: 6,4;

тощая кишка: 6,9;

подвздошная кишка: 7,2.

Желудочная секреция:

HCl;

пепсин;

липаза.

Кишечная секреция:

NaHCO₃ в трех участках тонкого кишечника;

экстракт желчи в двенадцатиперстную кишку;

экстракт поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку;

Диализ/абсорбция

Удаление "малых" порций кишечного химуса осуществляли на двух уровнях TIM1 (тощая кишка и подвздошная кишка) посредством гемодиализаторов. Диализ кишечного химуса осуществляли непрерывно с солевым раствором, состав которого был близок к составу плазмы крови. Диализаты собирали в диализные мешки.

Отбор проб осуществляли в процессе пищеварения на разных уровнях тракта с целью контроля выживаемости испытуемых дрожжей.

Подсчеты численности дрожжей осуществляли соответственно традиционным микробиологическим методикам и принятому отбору проб: в желудке через 10, 20, 30 и 45 мин, на выходе из тонкого кишечника с накоплением в течение часа и в конечном остатке.

Методика подсчета изложена далее.

Для каждой отобранной пробы быстро осуществляли последовательное десятикратное разведение стерильным физиологическим раствором (NaCl, 8,5 г/л). Затем 0,1 мл каждого разведения наносили и затем распределяли по поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри (две чашки на одно разведение). Чашки инкубировали в течение 48 ч при 35°C перед подсчетом "колониеобразующих единиц" (КОЕ).

Результаты подсчета выражали в КОЕ/мл (необработанные данные) и в процентном отношении клеток активных дрожжей по сравнению с числом клеток изначально введенных дрожжей для определения уровня выживаемости дрожжей в желудке и на выходе из тонкого кишечника.

В приведенной далее таблице обобщены теоретические уровни выживаемости (при 100%-й жизнеспособности) и реальные значения, полученные для каждого штамма на уровне желудка, в накопленной пробе на выходе из тонкого кишечника после 5 ч пищеварения и в накопленной пробе системы после 5 ч пищеварения.

Результаты

Продукты пищеварения	Введенные дрожжи, КОЕ	На выходе из желудка черезT = 45 мин	На выходе из тонкого кишечника черезT = 5 ч	Общая выживаемость черезT = 5 ч
ScPro1, образец 1	3,5·1010	89%	100%	106%
ScPro1, образец 2	2,0·1010	88%	95%	106%
SCB1 1	1,5·1010	83%	76%	81%
SCB1 2	1,5·1010	85%	69%	76%

Заключение

Данные результаты хорошо демонстрируют превосходную выживаемость в желудочно-кишечном тракте дрожжей ScPro1 и SCB1.

ПРИМЕР 2. Выживаемость дрожжей ScPro1 в искусственной пищеварительной среде, моделирующей кишечник человека

Исследование выживаемости дрожжей ScPro1 во время ферментации в толстой кишке и влияние дрожжей на кишечную микрофлору

Дрожжи ScPro1 в сухой активной форме были испытаны и исследованы in vitro в искусственной пищеварительной среде, моделирующей пищеварение человека, и, в частности, путем исследования изменения и воздействия жизнеспособных испытуемых дрожжей на среду во время ферментации в толстой кишке.

Ферментация в толстой кишке является непрерывной ферментацией с последовательным поступлением среды для сохранения микрофлоры. Данная среда содержит главным образом сложные углеводные соединения, не переваренные в верхней части пищеварительного тракта (крахмал, пектин, целлюлоза т.п.), в большей или меньшей степени гидролизованные белковые соединения и муцин.

Ферментированные соединения извлекаются из среды толстой кишки также последовательно. Среда проходит через систему диализа, обеспечивающую непрерывное удаление растворимых продуктов ферментации.

Диализат собирают для анализа жирных кислот с короткими цепями (AGCC). Среду выдерживают в анаэробных условиях, создаваемых за счет собственных газов ферментации, при этом среда имеет окислительно-восстановительный потенциал меньше -300 мВ. В заключение pH доводят до заданного значения, равного 6.

Каждый цикл пищеварения включал в себя: период стабилизации микрофлоры в течение 2-3 дней после засева толстой кишки, период обработки (по меньшей мере в течение 3 дней) по меньшей мере с одной ежедневной добавкой продукта и период прекращения обработки в течение 3 дней. В каждом опыте контролировали и/или регистрировали следующие параметры:

- жизнеспособность дрожжей;

- изменение различных аэробных и анаэробных бактериальных популяций;

- изменение основных продуктов ферментации (AGCC и газы);

- детектирование стандартной ферментативной активности;

- температура, pH и окислительно-восстановительный потенциал.

Ферментацию осуществляли в пенициллиновом флаконе вместимостью 60 мл, закрытом герметизируемой пробкой с септой и заполненном на 30 мл средой толстой кишки (культуральная среда со свежей фекальной микрофлорой). Образец дрожжей прибавляли к 30 мл среды.

Среда толстой кишки состояла, с одной стороны, из микробной суспензии, полученной из свежих испражнений, в буферном фосфатном растворе, а с другой стороны, из типичного пищевого продукта, используемого также для культивирования микрофлоры толстой кишки в искусственной толс