Способ получения белков с использованием соединений, препятствующих старению

Способ получения белков с использованием соединений, препятствующих старению

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее описание относится в общем к получению белков в культурах клеток млекопитающих. Более конкретно, настоящее описание относится к культивированию клеток млекопитающих в присутствии соединения, препятствующего старению, например карнозина, с целью поддержания жизнеспособности и увеличения продуктивности при высоком качестве. Путем культивирования клеток получают многие белковые продукты. Эти продукты, такие как моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, можно использовать в терапевтических целях, научных исследованиях или других приложениях. Клетки животных и, в частности, клетки млекопитающих часто используют для получения белков. К сожалению, использование клеток животных делает процесс получения более продолжительным и дорогим.

Добавление химического агента в культуральную среду может увеличить продуктивность клеток путем стимуляции продуцирования продукта клетками, что обеспечивает увеличение конечного выхода. Оптимальный агент для использования зависит от нескольких факторов, включая целевой белок и тип клеток. Подобные факторы влияют также на количество и время добавления выбранного агента в культуральную среду. Примеры агентов: алканоые кислоты и солиб производные мочевины или диметилсульфооксид (DMSОб ДМСО). Химические агенты, такие как бутират натрия, могут иметь различное влияние на получение белка. Добавление агента может увеличить удельную продуктивность клеток, но может также иметь цитотоксичный эффект и ингибировать рост и жизнеспособность клеток.

В процессе продуцирования белка клетками белок секретируется в среду, в которой клетки культивируют. Конкретный белок, однако, не является единственным веществом в среде; высокомолекулярные агрегаты, кислые молекулы и другие вещества также часто присутствуют в среде и могут сделать процесс очистки более трудоемким и дорогостоящим. Доступны технологии и способы, улучшающие качество продукта, обеспечивающие более эффективную очистку белков. Они включают, среди прочего, изменение параметров работы биореактора или использование другой линии клеток. Тем не менее остается потребность в технологиях получения белков и способах, обеспечивающих улучшение процесса очистки.

Следовательно, необходим химический агент для добавления в культуральную среду, который может усилить экспрессию представляющего интерес белка при сохранении высокой жизнеспособности клеток. Кроме того, необходим агент, который увеличивает качество белкового продукта путем снижения содержания высокомолекулярных агрегатов и кислотных молекул в культуральной среде.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее описание относится к способу усиленной продукции белкового продукта. Например, в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способы культивирования клеток-хозяев, экспрессирующих белок, представляющий интерес, в среде, содержащей вещество, препятствующее старению, что обеспечивает усиление общего продуцирования белка. В некоторых вариантах реализации подобное вещество, препятствующее старению, содержит карнозин.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает композиции, которые усиливают продуцирование белка, представляющего интерес. Например, в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает культуральную среду, включающую вещество, препятствующее старению, что усиливает продуцирование белка, представляющего интерес, который экспрессируется в клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации такое вещество, препятствующее старению, содержит карнозин. В некоторых вариантах реализации генетически измененные клетки-хозяева смешивают с инокуляционной средой с образованием культуральной среды, которую выращивают в биореакторе. В ходе производственного цикла получения желаемого белкового продукта можно изменять условия работы биореактора и/или вносить дополнительные компоненты с целью увеличения продуктивности и/или поддержания жизнеспособности. Дополнительные компоненты могут включать питательную среду и/или одну или более добавок таких, например, как указано в настоящем описании, карнозин и/или другие вещества, препятствующие старению.

Клетки-хозяева млекопитающих, например клетки яичника китайского хомячка, могут испытывать снижение жизнеспособности в биореакторе при приближению к окончанию производственного цикла. Было обнаружено, что добавление агента, препятствующего старению, такого как карнозин или его аналоги, в культуральную среду помогает поддерживать на более высоком уровне число жизнеспособных клеток и жизнеспособность клеток к моменту сбора белка.

Кроме того, в рамках настоящего изобретения можно применять такой способ увеличения продуктивности, как, например, изменение температуры после окончания фазы роста и/или в течение фазы образования продукта. В качестве одного из примеров: в ходе производства белкового продукта, а именно антитела к фактору дифференцирования роста - 8 (GDF-8), снизили температура, что способствовало инициации продуцирования и увеличивало продуктивность. В некоторых вариантах реализации добавление вещества, препятствующего старению, такого как карнозин, помогает увеличить продуктивность культуры клеток. В некоторых вариантах реализации вещество, препятствующее старению, можно добавлять перед, в течение и/или после такого изменения температуры.

Также было обнаружено, что добавление вещества, препятствующего старению, такого как карнозин, в культуральную среду увеличивает общее качество белкового продукта. В ходе получения белка в культуральной среде присутствуют высокомолекулярные агрегаты, а также нежелательные молекулы. Добавление карнозина уменьшает количество высокомолекулярных агрегатов и увеличивает качество продукта. В некоторых вариантах реализации добавление вещества, препятствующего старению, иного, чем карнозин, снижает накопление подобных высокомолекулярных агрегатов и улучшает качество продукции. В некоторых вариантах реализации карнозин добавляют совместно с одним или более дополнительными веществами, препятствующих старению.

Концентрация вещества, препятствующего старению (например, карнозина), добавляемого в культуральную среду, может варьироваться в зависимости от многих параметров процесса, включая, наряду с другими, например, тип клеток, продукт, представляющий интерес, и условия работы биореактора. Кроме того, карнозин можно заменить его аналогами: ацетил-карнозином, гомо-карнозином, ансерином и β-аланином. В некоторых вариантах реализации карнозин применяют совместно с одним или более других соединений, препятствующих старению. В некоторых вариантах реализации концентрация агента, препятствующего старению (например, карнозина), в культуральной среде составляет приблизительно от 5 мМ до 100 мМ. В некоторых вариантах реализации концентрация составляет приблизительно от 10 до 40 мМ. В некоторых вариантах реализации концентрация составляет приблизительно 20 мМ.

В данном способе получения белка можно применять любые подходящие способы культивирования клеток и инокуляционные среды. Можно применять как сывороточные, так и бессывороточные среды. Более того, можно применять методы культивирования, наиболее подходящие для конкретного типа клеток и белкового продукта. Подобные процедуры известны и понятны средним специалистам в области культивирования клеток.

Другие особенности и преимущества настоящего описания станут очевидны приведенного ниже описания и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1a. Влияние карнозина на кислотные пики у линии для MYO 29.

Фигура 1b. Влияние карнозина на высокомолекулярные агрегаты.

Фигура 1c. Влияние добавления карнозина в различные дни на кислотные пики.

Фигура 1d. Влияние добавления карнозина в различные дни на высокомолекулярные агрегаты.

Фигура 2a. Влияние карнозина на плотность жизнеспособных клеток в каждый из дней.

Фигура 2b. Влияние карнозина на жизнеспособность клеток в каждый из дней.

Фигура 2c. Влияние карнозина на титр в каждый из дней.

Фигура 2d. Влияние карнозина на кумулятивную удельную продуктивность клеток.

Фигура 2e. Влияние карнозина на высокомолекулярные агрегаты.

Фигура 3a. Влияние различных концентраций карнозина на плотность жизнеспособных клеток.

Фигура 3b. Влияние различных концентраций карнозина на жизнеспособность клеток в каждый из дней.

Фигура 3c. Влияние различных концентраций карнозина на титр в каждый из дней.

Фигура 3d. Влияние различных концентраций карнозина на кумулятивную специфичную продуктивность клеток.

Фигура 3e. Влияние различных концентраций карнозина на высокомолекулярные агрегаты.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Согласно устаявшемуся правилу, в настоящей заявке, в том числе и в формуле изобретения, существительные в единственном числе подразумевают «один или более». Несмотря на то, что изобретение описано с определенной степенью конкретизации, очевидно, что множество альтернатив, модификаций и вариантов станут ясны для специалистов в данной области после ознакомления с описанием. Соответственно подразумевается, что все подобные альтернативы, модификации и варианты, которые находятся в рамках сущности и объема изобретения, входят в объем формулы изобретения.

Термин «соединение, препятствующее старению» относится здесь к любому агенту или соединению, которое при добавлении к культуре клеток стимулирует жизнеспособность, рост и/или продолжительность жизни растущих в ней клеток. В некоторых вариантах реализации применение подобного соединения, препятствующего старению, в культуре клеток приводит к увеличению титра, увеличению удельной продуктивности клеток, увеличению жизнеспособности клеток, увеличению интегральной плотности жизнеспособных клеток, уменьшению накопления высокомолекулярных агрегатов и/или уменьшению накопления кислотных молекул, которые наблюдались бы в среде при отсутствии соединения, препятствующего старению, в идентичных в остальном условиях культивирования. Неограничивающие примеры соединений, препятствующих старению, которые можно применять в способах и композициях согласно настоящему изобретению, включают: карнозин, ацетил-карнозин, гомо-карнозин, ансерин и β-аланин. В некоторых вариантах реализации в композициях и способах согласно настоящему изобретению возможно применять два или более соединений, препятствующих старению.

Термин «клетка-хозяин» относится к клеткам, которые могут быть генетически изменены и/или способны расти и выживать в культуральной среде. Как правило, данные клетки могут экспрессировать большое количество эндогенного или гетерологичного белка, представляющего интерес, и могут либо удерживать, либо секретировать белок в культуральную среду.

Клетки-хозяева, как правило, представляют собой «клетки млекопитающих», включая неограничивающий пример - клетки позвоночных, в том числе клетки из: почки детеныша хомячка (ВНК), яичника китайского хомячка (CHO), почки человека (293), нормального диплоидного зародыша макаки-резуса (FRhL-2) и миеломы мыши (например, SP2/0 and NSO). Средний специалист в данной области сможет определить другие клетки-хозяева, которые можно использовать в соответствии со способами и композициями настоящего изобретения.

Термин «культуральная среда» относится к раствору, содержащему питательные вещества для поддержания выживания клеток в условиях, при которых клетки могут расти и продуцировать целевой белок. Фраза «среда для инокуляции» или «инокуляционная среда» относятся к раствору или веществу, содержащему питательные вещества, в котором инициируется культура клеток. В некоторых вариантах реализации «питательная среда» питательные, аналогичные содержащимся в среде для инокуляции, но представляет собой раствор или вещество, которым клетки питают после инициации культуры. В некоторых вариантах реализации питательная среда содержит один или более компонентов, которые не присутствуют в среде для инокуляции. В некоторых вариантах реализации в питательной среде отсутствуют один или более компонентов, присутствующих в среде для инокуляции. Лицо, имеющее средние навыки в области культивирования клеток, не проводя излишних экспериментов, сможет определить, какие компоненты составят среду для инокуляции и питательную среду. Как правило, данные растворы обеспечивают заменимые и незаменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и микроэлементы, необходимые клеткам для роста и выживания. В некоторых вариантах реализации среда для инокуляции, питательная среда или обе эти среды содержат соединение, препятствующее старению.

Термин «характеристика культуры клеток» относится здесь к наблюдаемым и/или поддающимся измерению характеристикам клеточной культуры. Способы и композиции согласно настоящему изобретению преимущественно применяют для улучшения одной или более характеристик культуры клеток. В некоторых вариантах реализации улучшение характеристики культуры клеток заключается в увеличении значения характеристики культуры клеток. В некоторых вариантах реализации, улучшение характеристики культуры клеток заключается в уменьшении значения характеристики культуры клеток. В качестве неограничевающих примеров характеристик культуры клеток могут выступать: титр, удельная продуктивность клеток, жизнеспособность клеток, интегральная плотность жизнеспособных клеток, накопление высокомолекулярных агрегатов и/или накопление кислотных молекул. Лицу, имеющему средние навыки в данной области, будут известны и другие характеристики культуры клеток, которые можно улучшить путем применения способов и композиций настоящего изобретения.

Термин «определенная среда» относится здесь к среде, состав которой известен и контролируется. Определенные среды не содержат сложных добавок, таких как сыворотка и гидролизаты, которые содержат неизвестные и/или неконтролируемые компоненты.

Термин «сложная среда» относится здесь к среде, содержащей по крайней мере один компонент, название (природа) или количество которого либо неизвестны, либо неконтролируемы.

Термин «линия клеток» относится, в целом, к исходным клеткам-хозяевам, которые экспрессируют белок, представляющий интерес. В некоторых вариантах реализации, эти клетки подвергли трансформирации эндогенной ДНК, кодирующей целевой белок и/или содержащей управляющие последовательности, которые активируют экспрессию соответствующих последовательностей, вне зависимости от того, являются они эндогенными или гетерологичными. В некоторых вариантах реализации клетки, произошедшие от клеток, подвергшихся такой генетической модификации, образуют линию клеток и их помещают в культуральную среду для выращивания и получения белкового продукта. В некоторых вариантах реализации клеточная линия состоит из исходных клеток-хозяев, которые не были подвергнуты трансформации экзогенной ДНК и экспрессируют эндогенный белок, представляющий интерес.

Термин «фаза роста» культуральной среды относится к периоду, когда клетки претерпевают быстрые деления и растут экспоненциально или близко к экспоненциальному росту. Как правило, клетки культивируют в условиях, оптимизированных для роста клеток обычно на протяжении 1-4 дней. Условия фазы роста могут включать температуру приблизительно от 35°C до 42°C, обычно 37°C. Продолжительность фазы роста и условия культивирования в течение фазы роста могут варьировать, но в целом известны лицу, имеющему средние навыки в области культивировании клеток. В некоторых вариантах реализации в течение фазы роста в культуральную среду могут добавлять питательную среду.

«Переходная фаза» имеет место в течение периода, когда культуральную среду переводят из условий, характерных для фазы роста, в условия, характерные для фазы образования продукта. В течение переходной фазы часто меняют факторы, подобные температуре, среди прочего. В некоторых вариантах реализации в течение переходной фазы в культуральную среду могут доавлять питательную среду.

«Фаза образования продукта» наступает после фазы роста и переходной фазы. Экспоненциальный рост клеток заканчивается, и приоритетной задачей становится получение белка. Для инициации продуцирования, в культуральную среду, возможно, вносят добавки. В некоторых вариантах реализации в культуральную среду в фазе образования продукта вносят питательную среду. Кроме того, в большинстве случаев температура культуральной среды в фазе образования продукта может быть ниже, чем в фазе роста, что, как правило, стимулирует продуцирование. Фаза образования продукта продолжается до достижения желаемой конечной точки.

Фраза «плотность жизнеспособных клеток» обозначает общее число клеток, которые выживают в определенном объеме (как правило, в миллилитре) культуральной среды. Фраза «жизнеспособность клеток» обозначает выраженное в процентах число живых клеток, отнесенное к общему числу клеток (мертвых и живых).

«Интегральная плотность жизнеспособных клеток», «ИПЖК»: Термин «интегральная плотность жизнеспособных клеток», или «ИПЖК», обозначает здесь среднюю плотность жизнеспособных клеток на протяжении культивирования, умноженное на продолжительность культивирования. Если количество полученного белка пропорционально числу жизнеспособных клеток на протяжении культивирования, то интегральная плотность жизнеспособных клеток является полезным инструментом для оценки количества белка, продуцируемого на протяжении культивирования.

Термин «высокомолекулярные агрегаты» относится в основном к белкам с неверной укладкой цепи или неправильной ассоциацией по крайней мере двух полипептидов. Ассоциации могут возникать любыми путями, включая, но, не ограничиваясь: ковалентные, нековалентные, дисульфидные или необратимые взаимодействия. В некоторых вариантах реализации способы и композиции согласно настоящему изобретению успешно применяют для уменьшения накопления высокомолекулярных агрегатов.

Термин «антиоксидант» относится здесь к соединению, которое обладает способностью предотвращать окислительное повреждение липидов, белков, ДНК и других важных макромолекул путем блокирования свободных радикалов.

Термин «антитело» здесь включает белки, содержащие по крайней мере один, но, как правило, два VH-домена (вариабельные домены тяжелой цепи) или их участков и/или по крайней мере один, но, как правило, два VL-домена (вариабельные домены легкой цепи) или их участков. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой тетрамер, состоящий из двух тяжелых цепей иммуноглобулина и двух легких цепей иммуноглобулина, в котором тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина соединены между собой, например, дисульфидным связями. Антитела или их части могут быть получены из любого источника, исключают включая, но не ограничиваясь: антитела и части антител грызунов, приматов (например, человек и отличные от человека), верблюдов, а также полученные рекомбинантным способами, например химерные, гуманизированные и/или образованные in vitro, как описано в настоящем документе более подробно.

Примеры связывающих фрагментов антитела, объединенных термином «антиген-связывающий фрагмент», включают, но не ограничиваются: (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, состоящий из двух Fab-фрагментов, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирой области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) dAb-фрагмент, состоящий из домена VH; (vi) верблюжий или подобный верблюжьему домен; (vii) одноцепочечный Fv (scFv); (viii) биспецифичное антитело; и (ix) один или более фрагментов молекулы иммуноглобулина, соединенных с областью Fc. Кроме того, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются различными генами, их можно соединить методами рекомбинации синтетическим линкером, который позволяет им образовывать единую белковую цепь, в которой области VL и VH соединены с образованием моновалентной молекулы (известна, как одноцепочечный Fv (scFv); см, например. Bird et al. (1988) Science 242: 423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879-83). Подразумевается, что подобные одноцепочечные антитела такжи входят в понятие «антиген-связывающий фрагмент» антитела. Такие фрагменты могут быть получены традиционными методиками, известными специалистам в данной области, и функциональности данных фрагментов оценивают так же, как и функциональность интактных антител.

«Антиген-связывающий фрагменты» могут, возможно, дополнительно содержать группировку, которая увеличивает одно или более свойств, таких как, например, стабильность, функция эффекторной клетки или фиксация комплемента. Например, антиген-связывающий фрагмент может дополнительно содержать пегилированные группировки, альбумин или константную область тяжелой и/или легкой цепи.

Подразумевается, что у антитела, отличного от «биспецифических» или «бифункциональных» антител, все сайты связывания идентичны. «Биспецифические» или «бифункциональные антитела» представляют собой искусственные гибридные антитела, состоящие из двух различных пар тяжелая/легкая цепь и двух различных сайтов связывания. Биспецифические антитела можно получить различными способами, включая слияние гибридом или соединение Fab-фрагментов. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J.Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Для получения антител или их антигенсвязывающих сайтов можно применять множество методов, известных специалистам в данной области. Например, моноклональные антитела можно получать путем генерирования гибридом в соответствии с известными способами. Из гибридом, полученных подобным образом, отбирают (как правило, с использованием стандартных методов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и поверхностный плазменный резонанс (Biacore™)), одну или более гибридом, которые продуцируют антитело, которое специфически связывается с определенным антигеном. В качестве иммуногена можно применять любую форму заданного антигена, например рекомбинантный антиген, формы, встречающиеся в природе, любые их варианты и фрагменты, а также их антигенные пептиды.

Один из характерных способов получения антител включает скрининг библиотеки экспрессии белков, например библиотек фагового или рибосомального дисплея. Фаговый дисплей описан, например, в Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; and WO 90/02809.

В дополнение к использованию дисплеев можно применять указаный антиген для иммунизации не являющегося человеком животного, например грызуна, например мыши, хомячка или крысы. В некоторых вариантах реализации не являющееся человеком животное содержит по крайней мере часть гена иммуноглобулина человека. Например, можно создать линию мышей с нарушенной продукцией антител мыши с большими фрагментами локусов Ig человека. При помощи гибридомной технологии можно получить и отобрать антиген-спецефичные моноклональные антитела, полученные из генов, с желаемой специфичностью. См., например XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, US 2003 - 0070185, WO 96/34096, опубликовано 31 октября 1996, и Заявка РСТ No. PCT/US96/05928, поданная 29 Апреля, 1996.

В некоторых вариантах реализации моноклональные антитела получают из животного, которое не является человеком, и затем модифицируют: например, получают гумманизированные, деиммунизированные, химерные антитела с использованием технологий рекомбинантной ДНК, известных из уровня техники. Описано множество подходов, пригодных для получения химерных антител. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Boss et al.. Патент США №. 4,816,397; Tanaguchi et al.. Европейская патентная публикация EP 171496; Европейская патентная публикация 0173494 Патент Великобритании GB 2177096 B. Гуманизированные антитела также могут быть получены, например, с использованием трансгенных мышей, которые экспрессируют гены тяжелой и легкой цепей человека, но неспособны экспрессировать гены эндогенных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина мышей. У Winter описан пример способа прививки CDR (гипервариабельных участков), который можно использовать для приготовления описанных в настоящей заявке гуманизированных антител (Патент США №5,225,539). Можно заменить все гипервариабельные участки конкретного антитела человека по крайней мере частью CDR организма, не являющегося человеком, или можно заменить только некоторые из гипервариабельных участков на CDR организма, не являющегося человеком. Необходимо заменить лишь определенное число CDR, необходимых для связывания гуманизированного антитела с соответствующим антигеном.

Гуманизированные антитела или их фрагменты могут быть получены путем замены последовательность последовательности вариабельного Fv-домена, который не вовлечен напрямую в связывание с антигеном, на эквивалетную последовательность вариабельного Fv-домена человека. Примеры способов получения гуманизированных антител или их фрагментов приведена в Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; by Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; и в US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205 и US 6,407,213. Такие методы включают выделение, модифицирование и экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют вариабельные Fv-домены иммуноглобулина (полностью или их части), принадлежащие, по крайней мере одной из цепей: тяжелой и легкой. Такие нуклеиновые кислоты можно получить из гибридом, продуцирующих антитело к определенной мишени, как описано выше, а также из других источников. Рекомбинантные ДНК, кодирующие молекулы гуманизированного антитела, впоследствии можно клонировать в подходящем векторе экспрессии.

В некоторых вариантах реализации гуманизированные антитела оптимизируют путем введения: консервативных замен, замен консенсусных последовательностей, замещн зародышевой линии и/или обратных мутаций. Такие измененные молекулы иммуноглобулинов могут быть получены любым из способов, известных в данной области (например, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. EnzymoL, 92: 3-16, 1982), a также могут быть получены согласно идеям, изложенным в публикациях РСТ WO 92/06193 или EP 0239400.

Антитело или его фрагмент можно модифицировать путем специфического удаления эпитопов T-клеток человека или путем «деиммунизации» способами, описанными в WO 98/52976 и WO 00/34317. Вкратце, можно провести анализ вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела на пептиды, которые связываются с ГКГС II-ого типа; данные пептиды представляют собой потенциальные эпитопы T-клеток (как определено в WO 98/52976 и WO 00/34317). Для определения потенциальных эпитопов Т-клеток, можно применять подход компьютерного моделирования, получивший название «peptide threading» (название пептидов), и, кроме того, можно провести поиск в базе данных пептидов, связывающих ГКГС человека II-ого, на мотивы, представленные в последовательностях VH и VL, как описано в WO 98/52976 и WO 00/34317. Данные мотивы связывают любой из 18 основных DR-аллотипов ГКГС II, и таким образом представляют собой потенциальные эпитопы T-клеток. Выявленные потенциальные эпитопы T-клеток можно уничтожить путем замены небольшого числа остатков аминокислот в вариабельных доменах, или, более предпочтительно, путем замены одной аминокислоты. Как правило, делают консервативные замены. Часто, но не обязательно, используют аминокислоту, имеющую позицию, характерную для последовательности антитела зародышевой линии человека. Последовательности зародышевых линий человека раскрыты, например, в Tomlinson et al. (1992) J.Mol.Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol.16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799-817; и Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628-4638. Каталог V BASE предоставляет всестороннюю информацию о последовательностях вариабельных областей иммуноглобулинов человека (составлено Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Кембридж, Великобритания). Эти последовательности можно применять в качестве источника последовательности человека, например каркасных участков или CDR. Можно также использовать консенсусные рамочные участки, например, как описано в US 6,300,064.

В некоторых вариантах реализации антитело может содержать измененную константную область иммуноглобулина или Fc-область. Например, антитело, полученной в соответствии с идеями настоящего изобретения, может связывать более прочно или с большей специфичностью эффекторную молекулу, такую как комплемент и/или рецептор Fc, которая может контролировать несколько иммунных функций антитела, таких как активность эффекторных клеток, лизис, активность, опосредуемую комплементом, выведение антител из организма и период полувыведения антител. Как правило, к рецепторам Fc, которые связываются с Fc-регионом антитела (например, IgG антитела) относятся, но не ограничиваются ими, подкалассы рецепторов FcyRI, FcyRII и FcyRIII и FcRn, в том числе аллельные варианты и образованные в результате альтернативного сплайсинга формы этих рецепторов. Рецепторы Fc описаны в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods 4: 25-34, 1994; and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41, 1995.

Термин «биореактор» относится здесь к резервуару, который может содержать культуральную среду, и внутренние параметры которого, такие как pH и температура, можно контролировать в ходе культивирования.

«Культивирование с подпиткой» обозначает способ культивирования клеток, при котором сначала клетки вносят в биореактор в инокуляционной среде. В ходе производственного цикла, стадиях в культуральную среду один или более раз вносят питательную среду, содержащую питательные компоненты и/или другие добавки.

«Периодическое культивирование» обозначает способ культивирования клеток, при котором клетки вносят в биореактор вместе со всеми питательными веществами и добавками, необходимыми для прохождения полного производственного цикла. На протижении производственного цикла в среду не вносят никаких питательных добавок.

«Перфузионное культивирование» обозначает способ культивирования клеток, отличный от культивирования с подпиткой и от периодического культивирования, в котором процесс культивирования не прекращают, или возможно не прекращают перед выделением и/или очисткой экспрессированного белка, представляющего интерес, и в котором новые питательные вещества и другие компоненты периодически или непрерывно добавляют в культуру, и в течение которого экспрессированный белок периодически или непрерывно собирают. Состав добавляемых питательных веществ можно менять в ходе культивировании клеток, в зависимости от потребностей клеток, требований оптимального выхода белка и/или множества любых других факторов, известных средним специалистам в данной области.

Термин «экспрессия» относится к транскрипции и трансляции, которые проходят внутри клетки-хозяина. Уровень экспрессии обозначает обычно количество белка, продуцируемого клеткой-хозяином.

Термины «белок» или «белковый продукт» обозначает одну или более цепей аминокислот. В настоящей заявке термин «белок» является синонимом термина «полипептид» и, как принято в данной области, обозначает по крайней мере одну цепь аминокислот, соединенных пептидными связями. В некоторых вариантах реализации «белок, представляющий интерес» представляет собой белок, кодируемый экзогенной молекулой нуклеиновой кислоты, которую трансформировали в клетку-хозяина. В некоторых вариантах реализации «белок, представляющий интерес» представляет собой белок, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая является эндогенной по отношению к клетке-хозяину. В некоторых вариантах реализации экспрессию такого эндогенного белка, представляющего интерес, меняют путем трансформации клеток-хозяев экзогенной молекулой нуклеиновой кислоты, которая может, например, содержать одну или более регуляторных последовательностей и/или кодировать белок, увеличивающий экспрессию белка, представляющего интерес. Способы и композиции согласно настоящему изобретению можно быть применять для получения любого белка, представляющего интерес, включая, но не ограничиваясь, белки, имеющие терапевтическое, фармацевтическое, диагностическое, сельскохозяйственное и/или любое другое из множества значений, подходящих для коммерческих, экспериментальных и/или других приложений. В некоторых вариантах реализации белки, полученные с применением способов и/или композиций согласно настоящему изобретению, возможно, подвергают дальнейшей обработке или модифицируют. Например, белки, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть гликозилированы.

«Удельная продуктивность клеток» и тому подобное относится к удельному, в расчете на клетку, уровню экспрессии продукта. Удельную продуктивность клеток, как правило, измеряют в микрограммах белка, произведенного 10⁶ клетками за день, или в пикограммах белка, произведенного 10⁶ клетками за день.

Термин «титр» относится здесь к суммарному количеству экспрессируемого рекомбинантного белка, продуцируемого клеточной культурой в определенном количестве объема среды. Титр, как правило, выражают в миллиграммах или микрограммах белка на миллилитр среды.

Специалисту в данной области будет ясно, что способы, описанные здесь, можно использовать для культивирования множества хорошо известных клеток млекопитающих, которые повседневно используют и культивируют в данной области техники, т.е. применение способов, описанных здесь, не ограничивается только данным описанием.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Было обнаружено, что использование соединения, препятствующего старению, такого как карнозин, влияет на жизнеспособность и продуктивность культуры клеток. Например, добавление карнозина сохраняет жизнеспособность клеток, а также улучшает продуктивность клеток и улучшает качество целевого белкового продукта.

Карнозин является антиоксидантом и соединением, препятствующим старению, которое также является природным дипептидом, высокий уровень которого присутствует (до 20 Мм) в мышечных и нервных тканях у животных. Будучи антиоксидантом, карнозин к тому же является поглотителем свободных радикалов ингибитором гликации.

В целом, карнозин трансформирует химически активные группировки в нереакционноспособные, защищая, таким образом, белки, ДНК и другие важные макромолекулы. Как соединение, препятствующее старению, карнозин способен продлевать продолжительность жизни клеток диплоидных фибробластов человека и легких человеческого эмбриона (первичные клеточные линии) при концентрации от 20 мМ в культуральной среде. Согласно настоящему изобретению неожиданно было обнаружено преимущество применения соединения, препятствующего старению (включая, но не ограничиваясь, карнозином), в клеточной культуре для получения белка, представляющего интерес. В некоторых вариантах реализации использование подобного соединения, препятствующего старению, в клеточной культуре для получения белка, представляющего интерес, приводит к улучшению одной или нескольких характеристик культуры клеток, включая, но не ограничиваясь: увеличение титра, увеличение удельной продуктивности клеток, увеличенние жизнеспособности клеток, увеличение интегральной плотности жизнеспособных клеток, уменьшение накопления высокомолекулярных агрегатов и/или уменьшение накопления кислотных молекул.

Было показано, что карнозин цитотоксичен для трансформированных и опухолевых клеток человека и грызунов в минимальной питательной среде (Minimal Essential Medium, MEM, Sigma), которая содержит более низкие уровни глюкозы, однако не является таковым в среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMEM, Sigma), содержащей 1 мМ пируват (Holliday et al, Biochemistry (Москва), 65: 843-848,846). Кроме того, диализированная фетальная сыворотка крупного рогатого скота с удаленными низкомолекулярными компонентами увеличивала цитотоксический эффект карнозина. Там же. Было также установлено, что 1 мМ оксолоацетата и 1 мМ α-кетоглутарата, ни один из них не являлся компонентом инокуляционной или питательной среды в примерах с использованием карноз