Антитела-антагонисты против notch3 и их применение для профилактики и лечения связанных с notch3 заболеваний

Антитела-антагонисты против notch3 и их применение для профилактики и лечения связанных с notch3 заболеваний

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США No. 60/875597, поданной 18 декабря 2006, и предварительной патентной заявки США No. 60/879218, поданной 6 января 2007, описания которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам-антагонистам против Notch3 и их применению для облегчения, лечения или профилактики связанного с Notch3 заболевания или нарушения.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ген Notch впервые описан в 1917, когда было обнаружено, что штамм плодовой мушки Drosophila melanogaster обладает выемчатыми крыловыми пластинками (Morgan, Am Nat 51:513 (1917)). Ген клонировали почти семьдесят лет спустя, и, как определили, он является рецептором клеточной поверхности, играющим ключевую роль в развитии многих различных типов клеток и тканей у Drosophila (Wharton et al., Cell 43:567 (1985)). Как вскоре обнаружили, путь передачи сигнала Notch представляет собой механизм передачи сигнала, опосредованный контактом клетка-клетка, и является эволюционно консервативным от Drosophila до человека. Как обнаружено, рецепторы Notch принимают участие во многих клеточных процессах, таких как дифференцировка, определение судьбы клеток, поддержание стволовых клеток, клеточная подвижность, пролиферация и апоптоз в различных типах клеток в ходе развития и в тканевом гомеостазе (для обзора см. Artavanis-Tsakonas, et al., Science 268:225 (1995)).

Млекопитающие обладают четырьмя белками рецептора Notch (обозначенными Notch1-Notch4) и пятью соответствующими лигандами (обозначенными Delta-1 (DLL-1), Delta-3 (DLL-3), Delta-4 (DLL-4), Jagged-1 и Jagged-2). Гены рецепторов Notch млекопитающих кодируют белки ~300 кД, которые подвергаются расщеплению при транспортировке к клеточной поверхности и существуют в виде гетеродимеров. Внеклеточная часть рецептора Notch обладает тридцатью четырьмя повторами, подобными фактору роста эпидермиса (EGF), и тремя цистеин-богатыми Notch/LIN12-повторами. Ассоциация двух расщепленных субъединиц опосредована последовательностями, расположенными непосредственно к N-концу и C-концу от участка расщепления, и эти две субъединицы образуют гетеродимеризационные (HD) домены Notch (Wharton, et al., Cell 43:567 (1985); Kidd, et al., Mol Cell Biol 6:3431 (1986); Kopczynski, et al., Genes Dev 2:1723 (1988); Yochem, et al., Nature 335:547 (1988)).

В настоящее время все еще остается неясным, как происходит регуляция передачи сигнала Notch различными рецепторами или как различаются пять лигандов в отношении передачи сигнала или регуляции. Различия в передаче сигнала и/или регуляции можно контролировать с помощью их паттернов экспрессии в различных тканях или с помощью разных сигналов окружающей среды. Установлено, что белки лигандов Notch, включая Jagged/Serrate- и Delta/Delta-подобные, специфически связываются с областью EGF-повтора и индуцируют рецептор-опосредованную передачу сигнала Notch (рассмотрено в Bray, Nature Rev Mol Cell Biol. 7:678 (2006), и в Kadesch, Exp Cell Res. 260:1 (2000)). Среди EGF-повторов повторы с 10-го по 12-й необходимы для связывания лиганда с рецептором Notch, и другие EGF-повторы могут усиливать взаимодействие рецептор-лиганд (Xu, et al., J Biol Chem. 280:30158 (2005); Shimizu, et al., Biochem Biophys Res Comm. 276:385 (2000)). Хотя LIN12-повторы и димеризационный домен не вовлечены непосредственно в связывание лиганда, они играют важные роли в сохранении гетеродимерного белкового комплекса, предотвращая лиганд-независимое расщепление протеазой и активацию рецептора (Sanche-Irizarry, et al., Mol Cell Biol. 24:9265 (2004); Vardar et al., Biochem. 42:7061 (2003)).

Экспрессия мутантных форм рецепторов Notch в ходе развития эмбриона Xenopus серьезно нарушает нормальное развитие (Coffman, et al., Cell 73:659 (1993)). Обнаружено, что нокаут Notch1 является эмбрионально летальным у мышей (Swiatek, et al., Genes & Dev 8:707 (1994)). У человека существует несколько генетических заболеваний, включая рак, связанных с различными мутациями рецептора Notch (Artavanis-Tsakonas, et al., Science 284:770 (1999)). Например, патологическая активация рецептора Notch1, вызываемая транслокацией, может приводить к T-клеточному лимфобластному лейкозу (Ellisen, et al., Cell 66:649 (1991)). Определенные мутации в HD-доменах рецептора Notch1 усиливают передачу сигнала без связывания лиганда (Malecki, et al., Mol Cell Biol 26:4642 (2006)), что дополнительно указывает на их роли в активации рецептора Notch. Сигнал, индуцируемый связыванием лиганда, передается в ядро в ходе процесса, включающего два протеолитических расщепления рецептора с последующей ядерной транслокацией внутриклеточного домена (Notch-IC). Хотя LIN12-повторы и HD-домены, как предполагали, предотвращают передачу сигнала в отсутствие лигандов, все еще остается неясным, как связывание лиганда способствует событиям протеолитического расщепления.

Рецепторы Notch связаны с широким рядом заболеваний, включая рак, неврологические нарушения и иммунные заболевания, как показано в сообщениях о сверхэкспрессии рецепторов Notch в различных тканях и линиях клеток при заболеваниях человека по сравнению с нормальными или незлокачественными клетками (Joutel, et al. Cell & Dev Biol 9:619 (1998); Nam, et al., Curr Opin Chem Biol 6:501 (2002)). Рецептор Notch3 сверхэкспрессируется в различных солидных опухолях, включая немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) и рак яичника (Haruki, et al., Cancer Res 65:3555 (2005); Park, et al., Cancer Res 66:6312 (2006); Lu, et al., Clin Cancer Res 10:3291 (2004)), что позволяет предположить важность экспрессии рецептора Notch3 в солидных опухолях. Более того, экспрессия рецептора Notch3 активируется в новообразованиях из плазматических клеток, включая множественную миелому, плазмоклеточный лейкоз и экстрамедуллярную плазмацитому (Hedvat, et al., Br J Haematol 122:728 (2003)); рак поджелудочной железы (Buchler, et al., Ann Surg 242:791 (2005)); и T-клеточные острые лимфобластные лейкозы (T-ALL) (Bellavia, et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:3788 (2002); Screpanti, et al., Trends Mol Med 9:30 (2003)). Рецептор Notch3 также экспрессируется в субпопуляции линий клеток нейробластомы и служит в качестве маркера этого типа опухоли, который обладает конституциональными или опухоль-специфичными мутациями в гене гомеобокса Phox2B (van Limpt, et al., Cancer Lett 228:59 (2005)). Другие симптомы и заболевания, которые связаны с экспрессией рецептора Notch3, включают неврологические нарушения (Joutel, et al., Nature 383:707 (1996)), диабет (Anastasi, et al., J Immunol 171:4504 (2003), ревматоидный артрит (Yabe, et al., J Orthop Sci 10:589 (2005)), связанные с сосудами заболевания (Sweeney, et al., FASEB J 18:1421 (2004)) и синдром Алажиля (Flynn, et al., J Pathol 204:55 (2004)).

Хотя сверхэкспрессию рецептора Notch3 (включая амплификацию гена) наблюдали в различных видах рака, до сих пор отсутствуют сообщения об активирующих мутациях. Вероятно, повышение уровня рецепторов Notch3 в опухолях может быть активировано разными лигандами в стромальных клетках или опухолевых клетках, и оно приводит к усилению передачи сигнала Notch3. В частности, лиганды Notch локализованы в сосудистом эндотелии в ходе как развития, так и онкогенеза (Mailhos, et al., Differentiation 69:135 (2001); Taichman, et al., Dev Dyn 225:166 (2002)), позволяя предположить, что эндотелиальные клетки могут предоставлять лиганды для активации рецептора Notch3 в опухолях. Сходное взаимное влияние опухоли и стромы, опосредованное лигандом и рецептором Notch, показано для различных типов рака (Houde, et al., Blood 104:3697 (2004); Jundt, et al., Blood 103:3511 (2004); Zeng, et al., Cancer Cell 8:13 (2005)). Усиление передачи сигнала Notch3, вызываемое сверхэкспрессией внутриклеточного Notch3 (Notch3-IC), может приводить к онкогенезу у животных моделей T-ALL и рака молочной железы (Vacca, et al., The EMBO J 25:1000 (2006); Hu, et al., Am J Pathol 168:973 (2006)).

Передача сигнала Notch3 и его роль в клеточном самообновлении имеют место в раковых стволовых клетках, которые представляют собой минорную популяцию в опухолях и могут инициировать образование опухоли (Reya, et al., Nature 414:105 (2001)). Нормальные стволовые клетки из многих тканей, включая кишечные и нейрональные стволовые клетки, зависят от передачи сигнала Notch3 в отношении самообновления и определения судьбы (Fre, et al., Nature, 435:964 (2005); van Es, et al., Nature, 435:959 (2005); Androutsellis-Theotokis, et al., Nature, 442:823 (2006)). Сходные механизмы могут существовать в раковых стволовых клетках, и, как показано, ингибирование передачи сигнала Notch3 ингибиторами γ-секретазы истощает количество раковых стволовых клеток и блокирует приживление для эмбриональных опухолей мозга (Fan, et al., Cancer Res 66:7445 (2006)).

Ингибирование передачи сигнала Notch3 ингибитором γ-секретазы обладает поразительными антинеопластическими эффектами в экспрессирующих Notch трансформированных клетках in vitro и в моделях ксенотрансплантата (Weijzen, et al., Nat Medicine 8:879 (2002); Bocchetta, et al., Oncogene 22:81 (2003); Weng, et al., Science, 306:269 (2004)). Позднее показано, что ингибитор γ-секретазы эффективно уничтожает аденомы толстой кишки у мышей Apc (min+) (van Es, et al., Nature, 435:959 (2005)), хотя терапевтическое окно, благодаря его эффекту на нормальные стволовые клетки и ингибированию нескольких путей Notch, является очень узким. В отличие от Notch1, нокаут гена Notch3 у мышей не являлся эмбрионально летальным и вызывал незначительное число дефектов (Domenga, et al., Genes & Dev 18:2730 (2004)), позволяя предположить, что Notch3 является потенциально лучшей терапевтической мишенью, чем Notch1.

У Tournier-Lasserve et al. (заявка США 2003/0186290) сообщается об ассоциации рецептора Notch3 и CADASIL. В заявке описаны различные мутации в гене Notch3 и их возможная ассоциация с заболеванием CADASIL. В заявке предложено применение диагностических антител для детектирования таких мутаций. В заявке также предложены терапевтические антитела для лечения CADASIL, т.е. агонистические антитела, но не описаны конкретные антитела, и не описано, как получать такие антитела.

Ввиду большого количества заболеваний человека, связанных с путем передачи сигнала Notch3, важно выявлять новые способы профилактики и лечения этих заболеваний. Настоящее изобретение относится к новым анти-Notch3 антителам, пригодным для этой нерешенной медицинской проблемы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым антителам и их фрагментам, которые специфически связываются с конформационным эпитопом рецептора Notch3 человека, где эпитоп содержит домен LIN12 и гетеродимеризационный домен. Другой аспект изобретения относится к участку связывания эпитопа и антителам, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитела по настоящему изобретению. Антитела по настоящему изобретению ингибируют индуцированную лигандом передачу сигнала посредством рецептора Notch3.

Изобретение относится к аминокислотным последовательностям вариабельной тяжелой и легкой цепи антител и соответствующим последовательностям их нуклеиновых кислот. Другой вариант осуществления изобретения относится к последовательностям CDR этих антител. Другой вариант осуществления относится к гуманизированным формам этих антител.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к линиям клеток и векторам, несущим последовательности антител по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к конформационному эпитопу, распознаваемому антителами-антагонистами по изобретению. Настоящее изобретение также относится к антителам, которые связываются с этим конформационным эпитопом. Варианты осуществления относятся к конформационному эпитопу Notch3, содержащему домен LIN12, обладающий, по меньшей мере, 80%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 9, и димеризационный домен 2, обладающий, по меньшей мере, 80%, 85%, 90% или 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18. Более конкретно, конформационный эпитоп Notch3 содержит аминокислотные остатки 1395-1396, 1402-1404 и 1420-1422 домена L1 LIN12 и аминокислотные остатки 1576-1578 и 1626-1628 димеризационного домена D2. Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с этим конформационным эпитопом.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения состоит в использовании любого из этих антител для получения лекарственного средства или композиции для лечения заболеваний и нарушений, связанных с активацией рецептора Notch3.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения состоит в использовании любого из этих антител для лечения нарушений, связанных с активацией Notch3, включая ингибирование указанной активации, например, путем ингибирования передачи сигнала Notch3 или нейтрализации рецептора блокированием связывания с лигандом. Связанные с Notch3 нарушения могут включать в качестве неограничивающих примеров T-клеточный острый лимфобластный лейкоз, лимфому, заболевание печени, при котором имеет место патологическая васкуляризация, диабет, рак яичника, заболевания, при которых имеет место определение судьбы клеток сосудов, ревматоидный артрит, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легкого, новообразования из плазматических клеток (такие как множественная миелома, плазмоклеточный лейкоз и экстрамедуллярная плазмацитома) и нейробластому.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 представлена аминокислотная последовательность Notch3. Область EGF-повтора простирается от аминокислотного остатка 43 до 1383; домен LIN12 простирается от аминокислотного остатка 1384 до 1503; и димеризационный домен простирается от аминокислотного остатка 1504 до 1640.

На фиг.2 (A-H) представлено сравнение аминокислотных последовательностей Notch1, Notch2, Notch3 и Notch4 человека.

На фиг.3 представлена процентная идентичность Notch1, Notch2, Notch3 и Notch4.

На фиг.4A и 4B представлены последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи моноклонального антитела анти-Notch3 MAb 256A-4 (SEQ ID NO: 2) с подчеркнутыми областями CDR.

На фиг.5A и 5B представлены последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи моноклонального антитела анти-Notch3 MAb 256A-8 (SEQ ID NO: 4) с подчеркнутыми областями CDR.

На фиг.6 представлен анализ с использованием люциферазного репортера из примера 5, показывающий ингибиторные эффекты анти-Notch3 MAb на лиганд Notch3 Jagged1.

На фиг.7 представлен анализ с использованием люциферазного репортера, показывающий ингибиторные эффекты анти-Notch3 MAb на лиганд Notch3 Jagged2.

На фиг.8 представлен анализ с использованием люциферазного репортера, показывающий ингибиторные эффекты анти-Notch3 MAb на лиганд Notch3 DLL4.

На фиг.9 представлен анализ с использованием люциферазного репортера, показывающий ингибиторные эффекты анти-Notch3 MAb на нативный Notch3 в клетках рака яичника. (9A) - линия клеток рака яичника человека OV/CAR3 и (9B) - линия клеток рака яичника человека A2780.

На фиг.10 представлен анализ апоптоза из примера 6, показывающий, что эффект выживания клеток, индуцированный Jagged1, ингибировался анти-Notch3 MAb.

На фиг.11 представлен ингибиторный эффект анти-Notch3 MAb на миграцию (11A) и инвазию (11B) клеток из примера 7.

На фиг.12 представлена схематическая диаграмма белка с перестановкой доменов Notch1-Notch3, экспрессируемого в виде слитого белка с IgG/Fc человека, связанного с C-концом.

На фиг.13A представлен ELISA с использованием контрольного антитела к Fc человека в качестве антитела для детекции, показывающий, что белки фиг.12 экспрессировались в кондиционированной среде. На фиг.13B представлен ELISA с использованием 256A-4 в качестве антитела для детекции. На фиг.13C представлен ELISA с использованием 256A-8 в качестве антитела для детекции. На фиг.13D представлен ELISA с использованием антитела 256A-13 для положительного контроля в качестве антитела для детекции.

На фиг.14 представлено сравнение сконструированной последовательности, кодирующей лидерный пептид Notch3, с нативной последовательностью, кодирующей лидерный пептид Notch3 (депозитарный No. NCBI GenBank NM_000435), показывающее замены нуклеотидов (14A), и транслируемая аминокислотная последовательность сконструированной последовательности лидерного пептида Notch (14B).

На фиг.15 представлено получение конструкции с перестановкой доменов с помощью способа PCR-SOE. Стрелки представляют собой праймеры для PCR. Незакрашенный участок - последовательность Notch3. Закрашенный участок - последовательность Notch1.

На фиг.16 представлены аминокислотные последовательности, использованные для картирования эпитопа домена LIN12 Notch3 MAb 256A-4 и 256A-8.

На фиг.17 представлены аминокислотные последовательности, использованные для картирования эпитопа димеризационного домена Notch3 MAb 256A-4 и 256A-8.

На фиг.18 представлена схема участка связывания эпитопа для MAb 256A-4 и 256A-8.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение не ограничивается описанными в настоящем документе конкретными способами, протоколами, линиями клеток, векторами или реагентами, поскольку они могут варьировать. Более того, используемая в настоящем документе терминология предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения. Как используют в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки на формы множественного числа, если только из контекста ясно не следует иначе, например, ссылка на «клетку-хозяина» включает множество таких клеток-хозяев. Если только не указано иначе, все используемые в настоящем документе технические и научные термины и любые акронимы обладают одинаковыми значениями, общепринятыми для специалиста в данной области изобретения. Хотя любые способы и материалы, сходные с описанными в настоящем документе или эквивалентные им, можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения, в настоящем документе описаны иллюстративные способы, устройства и материалы.

Все упомянутые в настоящем описании патенты и публикации приведены в качестве ссылки в пределах, разрешаемых законом, с целью описания и сообщения о рассмотренных там белках, ферментах, векторах, клетках-хозяевах и способах, которые можно применять с настоящим изобретением. Однако ничего в настоящем описании не следует истолковывать как допущение того, что изобретение не является основанием, чтобы предвосхищать такое описание на основании предшествующего изобретения.

Определения

Термины, используемые на протяжении данной заявки, следует толковать в общепринятом и типичном значении для специалистов в данной области. Однако заявители выражают желание, чтобы следующим терминам давали конкретные определения, как определено ниже.

Фразу «по существу идентичный» в отношении последовательности полипептидной цепи антитела можно толковать как цепь антитела, обладающую, по меньшей мере, 70%, или 80%, или 90%, или 95% идентичностью последовательности с референсной полипептидной последовательностью. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты можно толковать как последовательность нуклеотидов, обладающую, по меньшей мере, приблизительно 85% или 90%, или 95%, или 97% идентичностью последовательности с референсной последовательностью нуклеиновой кислоты.

Термин «идентичность» или «гомология» следует понимать как обозначение процентной доли аминокислотных остатков в рассматриваемой последовательности, которые идентичны остаткам соответствующей последовательности, с которой ее сравнивают, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, при необходимости достижения максимальной процентной идентичности с целой последовательностью, и, не рассматривая любые консервативные замещения, как имеющие отношение к идентичности последовательности. Ни N-, ни C-концевые добавочные последовательности, ни вставки не следует толковать как снижающие идентичность или гомологию. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области. Идентичность последовательности можно измерять с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей.

Термин «антитело» используют взаимозаменяемо в самом широком смысле, и он конкретно относится к моноклональным антителам (например, полноразмерным моноклональным антителам), поликлональным антителам и полиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам), и фрагментам антител до тех пор, пока они обладают требуемой биологической активностью. Антитела (Ab) и иммуноглобулины (Ig) представляют собой гликопротеины, обладающие одинаковыми структурными характеристиками. В то время как антитела обладают специфичностью связывания в отношении конкретной мишени, иммуноглобулины включают как антитела, так и другие антителоподобные молекулы, которые лишены специфичности в отношении мишени. Антитела по изобретению могут представлять собой любой тип (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класс (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласс. Нативные антитела и иммуноглобулины обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами приблизительно 150000 Дальтон, образованными двумя идентичными легкими (L) цепями и двумя идентичными тяжелыми (H) цепями. Каждая тяжелая цепь содержит на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен на одном конце (V_L) и константный домен на другом конце.

Как используют в настоящем описании, «антитело анти-Notch3» означает антитело, которое специфически связывается с Notch3 человека таким образом, чтобы ингибировать или по существу снижать связывание Notch3 с его лигандами, или ингибировать передачу сигнала Notch3.

Термин «вариабельный» в контексте вариабельного домена антител, относится к тому факту, что последовательности определенных частей вариабельных доменов значительно различаются среди антител, и используется для связывания и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретной мишени. Однако вариабельность не распределена равномерно на протяжении вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR; т.е., CDR1, CDR2 и CDR3), также известными как гипервариабельные области в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называют каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов природных тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR-области, в значительной степени принимающие конфигурацию β-слоя, соединенную тремя CDR, которые формируют петли, соединяющие структуру β-слоев и, в некоторых случаях, формирующие ее часть. CDR в каждой цепи расположены вместе в непосредственной близости с помощью областей FR и, совместно с CDR другой цепи, участвуют в формировании связывающего мишень участка антител (см. Kabat et al., Sequences of Protein of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Как используют в настоящем описании, нумерацию аминокислотных остатков иммуноглобулинов осуществляют согласно нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулинов системы Kabat, et al., если не указано иначе.

Термин «фрагмент антитела» относится к части полноразмерного антитела, как правило, связывающей мишень или вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают F(ab)-, F(ab')-, F(ab')₂- и Fv-фрагменты. Фраза «функциональный фрагмент или аналог» антитела относится к соединению, обладающему количественной биологической активностью, подобной полноразмерному антителу. Например, функциональный фрагмент или аналог анти-Notch3 антитела представляет собой фрагмент или аналог, который может связываться с рецептором Notch3 таким образом, чтобы предотвращать или по существу снижать способность рецептора связываться со своими лигандами или инициировать передачу сигнала. Как используют в настоящем описании, «функциональный фрагмент» в отношении антител относится к Fv-, F(ab)- и F(ab')₂-фрагментам. «Fv-фрагмент» состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи с прочной нековалентной связью (димер V_H-V_L). Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием связывающего мишень участка на поверхности димера V_H-V_L. В совокупности шесть CDR придают антителу специфичность в отношении связывания мишени. Однако даже отдельный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных в отношении мишени) обладает способностью распознавать и связывать мишень, хотя и с меньшей аффинностью, чем полноразмерный связывающий участок.

«Одноцепочечные Fv-» или «sFv-» фрагменты антитела содержат V_H- и V_L-домены антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между V_H- и V_L-доменами, который позволяет sFv формировать требуемую структуру для связывания мишени.

Термин «димерные антитела» относится к малым фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими участками, где фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) на той же самой полипептидной цепи. При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и формировать два антигенсвязывающих участка.

F(ab)-фрагмент содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. F(ab')-фрагменты отличаются от F(ab)-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильный конец тяжелой цепи домена CH1, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антител. F(ab')-фрагменты получают расщеплением дисульфидной связи между цистеинами шарнирной области продукта расщепления F(ab')₂ пепсином. Дополнительные химические сшивки фрагментов антител известны специалистам в данной области.

Термин «моноклональное антитело», как используют в настоящем описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных естественно возникающих мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела в данной работе, в частности, включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, в то время как оставшаяся часть цепи(ей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагментов таких антител, при условии, что они обладают требуемой биологической активностью (патент США No. 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6851-6855 (1984)). Моноклональные антитела являются высоко специфичными, будучи нацеленными на единственный участок мишени. Более того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые, как правило, содержат различные антитела, нацеленные на различные детерминанты (эпитопы), каждое моноклональное антитело нацелено на единственный детерминант на мишени. В дополнение к специфичности моноклональные антитела обладают преимуществом в том, что их можно синтезировать в культуре гибридом, не контаминированной другими иммуноглобулинами. Модификатор «моноклональные» указывает на характер антитела, как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует толковать как требующий получение антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для использования с настоящим изобретением можно выделять из фаговых библиотек антител с использованием хорошо известных способов. Родительские моноклональные антитела для использования согласно настоящему изобретению можно получать гибридомным способом, впервые описанным в Kohler, et al., Nature 256:495 (1975), или можно получать рекомбинантными способами.

«Гуманизированные» формы не являющихся человеческими (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие связывающиеся с мишенью подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Как правило, гуманизированные антитела будут содержать по существу все, по меньшей мере, из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все области CDR соответствуют областям не являющегося человеческим иммуноглобулина, и все или по существу все области FR представляют собой области последовательности матрицы иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может также содержать, по меньшей мере, часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, часть из выбранной матрицы иммуноглобулина человека.

Термины «клетка», «линия клеток» и «культура клеток» включают потомство. Также понятно, что все потомство может не являться в точности идентичным по содержанию ДНК благодаря преднамеренным или случайным мутациям. Включают вариантное потомство, которое обладает той же функцией или биологическим свойством, на которое осуществляли скрининг исходно трансформированной клетки. «Клетки-хозяева», используемые в настоящем изобретении, как правило, являются прокариотическими или эукариотическими хозяевами.

«Трансформация» клеточного организма, клетки или линии клеток ДНК означает введение ДНК в клетку-мишень таким образом, что ДНК может реплицироваться или в качестве внехромосомного элемента или путем интеграции в хромосому. «Трансфекция» клетки или организма ДНК означает поглощение ДНК, например, экспрессирующего вектора, клеткой или организмом, где фактически любые кодирующие последовательности или экспрессируются, или не экспрессируются. Термины «трансфицированная клетка-хозяин» и «трансформированная» означают клетку, в которую введена ДНК. Клетку обозначают «клетка-хозяин», и она может являться или прокариотической или эукариотической. Типичные прокариотические клетки-хозяева включают различные штаммы E. coli. Типичные эукариотические клетки-хозяева являются клетками млекопитающих, такими как клетки яичника китайского хомяка или клетки человеческого происхождения. Введенная последовательность ДНК может быть из того же вида, что и клетка-хозяин, или из другого вида, чем клетка-хозяин, или она может представлять собой гибридную последовательность ДНК, содержащую до некоторой степени чужеродную и до некоторой степени гомологичную ДНК.

Термин «вектор» означает конструкцию ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая функционально связана с подходящей регуляторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию последовательности ДНК в подходящем хозяине. Такие регуляторные последовательности включают промотор для осуществления транскрипции, необязательную операторную последовательность для регуляции такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие участки связывания мРНК с рибосомой, и последовательности, которые управляют терминацией транскрипции и трансляции. Вектор может представлять собой плазмиду, фаговую частицу или просто потенциальную геномную вставку. При трансформации в подходящего хозяина, вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина, или, в некоторых случаях, может интегрироваться в сам геном. В настоящем описании термины «плазмида» и «вектор» иногда используют взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее обычно используемой формой вектора. Однако предполагается, что изобретение включает такие другие формы векторов, которые выполняют эквивалентные функции и которые известны или станут известными в данной области.

«Млекопитающее» для целей лечения относится к любому животному, классифицируемому в качестве млекопитающего, включая человека, домашних и сельскохозяйственных животных, не относящихся к человеку приматов и животных из зоопарка, спортивных или комнатных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д.

Слово «метка» при использовании в настоящем документе означает детектируемое соединение или композицию, которую можно конъюгировать непосредственно или опосредованно с молекулой или белком, например, антителом. Метку можно детектировать саму по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки), или, в случае ферментативной метки, она может катализировать химическое превращение субстратного соединения или композиции, которые являются детектируемыми.

Как используют в настоящем описании, «твердая фаза» означает неводную матрицу, к которой могут прикрепляться антитела по настоящему изобретению. Примеры относящихся к данной работе твердых фаз включают фазы, образованные частично или полностью из стекла (например, стекла с контролируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливинилового спирта и силиконов. В определенных вариантах осуществления в зависимости от контекста, твердая фаза может содержать лунку планшета для анализа; в других она представляет собой колонку для очистки (например, колонку для аффинной хроматографии).

Как используют в настоящем описании, термин «опосредованное Notch3 нарушение» означает состояние или заболевание, которое характеризуется сверхэкспрессией и/или гиперчувствительностью рецептора Notch3. В частности, его можно толковать, как включающий состояния, связанные с видами рака, такими как немелкоклеточный рак легкого, рак яичника и T-клеточный острый лимфобластный лейкоз. Другие виды рака, включая рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, новообразования из плазматических клеток (например, множественную миелому, плазмоклеточный лейкоз и экстрамедуллярную плазмацитому), нейробластому и экстрамедуллярную плазмацитому также входят в объем этого термина. Другие типы заболеваний включают лимфому, синдром Алажиля, заболевание печени, при котором имеет место патологическая васкуляризация, неврологические заболевания, диабет, заболевания, при которых имеет место определение судьбы клеток сосудов, и ревматоидный артрит.

ИММУНОГЕН НА ОСНОВЕ РЕЦЕПТОРА NOTCH3 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ

Растворимые мишени или их фрагменты можно использовать в качестве иммуногенов для получения антител. Антитело направлено против интересующей мишени. Предпочтительно, мишень представляет собой биологически важный полипептид, и введение антитела млекопитающему, страдающему заболеванием или нарушением, может оказывать благоприятное терапевтическое действие у этого млекопитающего. Целые клетки можно использовать в качестве иммуногена для получения антител. Иммуноген можно получать рекомбинантно или получать с использованием синтетических способов. Иммуноген можно также выделять из природного источника.

Для трансмембранных молекул, таких как рецепторы, их фрагменты (например, внеклеточный домен рецептора) можно использовать в качестве иммуногена. Альтернативно, клетки, экспрессирующие трансмембранную молекулу, можно использовать в качестве иммуногена. Такие клетки можно получать из природного источника (например, раковых линий клеток), или они могут являться клетками, которые трансформировали рекомбинантными способами для сверхэкспрессии трансмембранной молекулы. Другие формы иммуногена, пригодные для получения антител, будут очевидны для специалистов в данной области.

Альтернативно, ген или кДНК, кодирующие рецептор Notch3 человека, можно клонировать в плазмиду или другой экспрессирующий вектор и экспрессировать в любой из ряда экспрессионных систем согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области. Известны способы клонирования и экспрессии рецептора Notch3 и последовательности нуклеиновой кислоты рецептора Notch3 человека (см., например, патенты США No. 5821332 и 5759546). Вследствие вырожденности генетического кода можно использовать несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок или полипептиды рецептора Notch3. Можно варьировать нуклеотидную последовательность путем отбора сочетаний на основе возможных выборов кодонов. Эти сочетания получают согласно стандартному триплетному генетическому коду в приложении к нуклеотидной последовательности, которая кодирует рецептор Notch3 природного происхождения, и можно рассматривать все такие варианты. Любой из этих полипептидов можно использовать для иммунизации животного для получения антител, которые связываются с рецептором Notch3 человека.

Рекомбинантные белки Notch3 из другого вида можно также использовать в качестве иммуногена для получения антител вследствие высокой степени консервативности аминокислотной последовательности Notch3. Сравнение Notch3 человека и мыши показало идентичность аминокислотных последовательностей свыше 90% между двумя видами.

Иммуноген на основе рецептора Notch3 можно, в благоприятной ситуации, эк