Моноклональные антитела человека к белку программируемой смерти 1 (pd-1) и способы лечения рака с использованием анти-pd-1-антител самостоятельно или в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами

Моноклональные антитела человека к белку программируемой смерти 1 (pd-1) и способы лечения рака с использованием анти-pd-1-антител самостоятельно или в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящее изобретение является национальной фазой международной заявки РСТ/JP06/0309606, поданной 2 мая 2006, по которой испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США No. 60/679466, поданной 9 мая 2005, предварительной патентной заявки США No. 60/738434, поданной 21 ноября 2005, и предварительной патентной заявки США No. 60/748919, поданной 8 декабря 2005, каждая из которых приведена в описании в качестве ссылки в полном объеме.

Перечень последовательностей

В приложении к описанию также представлен перечень последовательностей, направленный посредством EFS 31 октября 2007 согласно 37 C.R.F. § I.52(e)(5); текстовой файл перечня последовательностей обозначен 077375,0499SEQLISTING.txt имеет размер 48642 байта и создан 3 октября 2007. Перечень последовательностей, поданный в электронной версии, не ограничивает рамки описания и не содержит новых объектов.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение главным образом относится к иммунотерапии при лечении заболевания человека и уменьшению ее побочных эффектов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению анти-PD-1-антител и к применению комбинированной иммунотерапии, включая комбинацию анти-CTLA-4 и анти-PD1-антител, для лечения рака и/или для уменьшения частоты или тяжести побочных эффектов, связанных с лечением такими отдельно используемыми антителами.

Уровень техники

Белок программируемой смерти 1 (PD-1) является ингибиторным членом семейства рецепторов CD28, которое включает в себя также CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется активированными В-клетками, Т-клетками и миелоидными клетками (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennet et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Первоначальные члены данного семейства, CD28 и ICOS, были обнаружены по функциональным действиям на увеличение пролиферации Т-клеток после добавления моноклональных антител (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260). PD-1 был обнаружен скринингом на дифференциальную экспрессию в апоптотических клетках (Ishida et al. (1992) EMBO J 11:3887-95). Другие члены данного семейства, CTLA-4 и BTLA, были обнаружены скринингом на дифференциальную экспрессию в цитотоксических Т-лимфоцитах и TH1-клетках, соответственно. CD28, ICOS и CTLA-4, все, имеют неспаренный остаток цистеина, дающий возможность гомодимеризации. В противоположность этому, предполагается, что PD-1 существует в виде мономера, не имея неспаренного остатка цистеина, характерного для других членов семейства CD28.

Ген PD-1 является трансмембранным белком типа I 55 кДа, который является частью суперсемейства генов Ig (Agata et al. (1996) Int Immunol 8:765-72). PD-1 содержит мембранопроксимальный иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) и мембранодистальный мотив переключения на основе тирозина (ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J Exp Med 181:1953-6; Vivier, E и Daeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91). PD-1, хотя и является структурно сходным с CTLA-4, лишен мотива MYPPPY, который является критическим для связывания B7-1 и B7-2. Были идентифицированы два лиганда для PD-1, PD-L1 и PD-L2, которые, как было показано, отрицательно регулируют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Как PD-L1, так и PD-L2 являются гомологами B7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28. Один лиганд для PD-1, PD-L1, является изобилующим в различных типах рака человека (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к уменьшению инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, уменьшению опосредованной рецептором Т-клеток пролиферации и ускользанию от иммунологического надзора раковых клеток (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). Иммуносупрессия может быть обращена ингибированием локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, и это действие является аддитивным при блокировании взаимодействия PD-1 с PD-L2 (Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).

PD-1 является ингибирующим членом семейства CD28, экспрессируемым на активированных B-клетках, T-клетках и миелоидных клетках (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). PD-1-недостаточные животные развивают различные аутоиммунные фенотипы, включая аутоиммунную кардиопатию и подобный волчанке синдром с артритом и нефритом (Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22). Кроме того, было обнаружено, что PD-1 играет роль в аутоиммунном энцефаломиелите, системной красной волчанке, болезни трансплантат против хозяина (GVHD), диабете типа I и ревматоидном артрите (Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78; Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 13:510). Было показано, что в линии мышиных опухолевых В-клеток ITSM PD-1 является необходимым для блокирования BCR-опосредованного вхождения Ca²⁺ и фосфорилирования тирозина, находящихся ниже по ходу процесса эффекторных молекул (Okazaki et al. (2001) PNAS 98:13866-71).

Таким образом, желательными являются агенты, которые распознают PD-1, и способы применения таких агентов.

Описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает выделенные моноклональные антитела, в частности, моноклональные антитела человека, которые связываются с PD-1 и которые проявляют многочисленные желаемые свойства. Такие свойства включают, например, высокую аффинность связывания с PD-1 человека, но отсутствие существенной перекрестной реактивности с CD28, CTLA-4 или ICOS человека. Кроме того, было показано, что антитела настоящего изобретения модулируют иммунные реакции. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к способам модуляции иммунных реакций с использованием анти-PD-1-антител. В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования роста опухолевых клеток in vivo с использованием анти-PD-1-антител.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, где данное антитело проявляет по меньшей мере одно из следующих свойств:

(а) связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-7М или менее;

(b) по существу не связывается с CD28, CTLA-4 или ICOS человека;

(с) увеличивает пролиферацию Т-клеток в анализе реакции лимфоцитов в смешанной культуре (MLR);

(d) увеличивает продуцирование интерферона-гамма в анализе MLR;

(е) увеличивает секрецию интерлейкина-2 (IL-2) в анализе MLR;

(f) связывается с PD-1 человека и PD-1 собакоподобной обезьяны;

(g) ингибирует связывание PD-L1 и/или PD-L2 с PD-1;

(h) стимулирует антигенспецифические ответные реакции памяти;

(i) стимулирует ответные реакции антител;

(j) ингибирует рост опухолевых клеток in vivo.

Предпочтительно, данное антитело является антителом человека, хотя в альтернативном варианте осуществления данное антитело может быть мышиным антителом, химерным антителом или гуманизированным антителом.

В более предпочтительных вариантах осуществления данное антитело связывается с PD-1 человека с K_D 5×10^-8М или менее, связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-8М или менее, связывается с PD-1 человека с K_D 5×10^-9М или менее, или связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-8М - K_D 1×10^-10М.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

(а) вариабельную область тяжелой цепи человека, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, которая содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14;

В различных вариантах осуществления ссылочное антитело содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

или ссылочное антитело содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9;

или ссылочное антитело содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10;

или ссылочное антитело содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11;

или ссылочное антитело содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12;

или ссылочное антитело содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13;

или ссылочное антитело содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7; и

(b) вариабельную область легкой цепи человека, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена V_H 3-33, где данное антитело специфически связывает PD-1. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена V_H 4-39, где данное антитело специфически связывает PD-1. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена V_K L6, где данное антитело специфически связывает PD-1. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее вариабельную область легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена V_K L15, где данное антитело специфически связывает PD-1.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

(а) вариабельную область тяжелой цепи гена V_H 3-33 человека; и

(b) вариабельную область легкой цепи гена V_K L6 человека;

где данное антитело специфически связывается с PD-1.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

(а) вариабельную область тяжелой цепи гена V_H 4-39 человека; и

(b) вариабельную область легкой цепи гена V_K L15 человека;

где данное антитело специфически связывается с PD-1.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело человека, или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где

(а) последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35, и их консервативных модификаций;

(b) последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:50, 51, 52, 53, 54, 55 и 56, и их консервативных модификаций; и

(с) данное антитело специфически связывается с PD-1 человека.

Предпочтительно, последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28, и их консервативных модификаций; и последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:43, 44, 45, 46, 47 и 49, и их консервативных модификаций. Предпочтительно, последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21, и их консервативных модификаций; и последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:36, 37, 38, 39, 40, 41 и 42, и их консервативных модификаций.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(а) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7;

(b) вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14;

(с) данное антитело связывается с PD-1 человека с K_D 1×10^-7М или менее; и

(d) данное антитело по существу не связывается с CD28, CTLA-4 или ICOS человека.

В предпочтительном варианте осуществления данные антитела дополнительно обладают по меньшей мере одним из следующих свойств:

(а) данное антитело увеличивает пролиферацию Т-клеток в анализе MLR;

(b) данное антитело увеличивает продуцирование интерферона-гамма в анализе MLR или

(с) данное антитело увеличивает секрецию IL-2 в анализе MLR.

Дополнительно или альтернативно, данное антитело может обладать одним или несколькими другими признаками, перечисленными выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащее:

(а) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28;

(с) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:36, 37, 38, 39, 40, 41 и 42;

(е) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:50, 51, 52, 53, 54, 55 и 56;

где данное антитело специфически связывает PD-1.

Предпочтительная комбинация содержит:

(а) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:15;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:22;

(с) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:29;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:36;

(е) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:43, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:50.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:16;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:23;

(с) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:30;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:37;

(е) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:44, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:51.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:17;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:24;

(с) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:31;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:38;

(е) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:45, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:52.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:18;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:25;

(с) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:32;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:39;

(е) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:46, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:53.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:19;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:26;

(с) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:33;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:40;

(е) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:47, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:54.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:20;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:27;

(с) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:34;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:41;

(е) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:48, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:55.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:21;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:28;

(с) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO:35;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:42;

(е) CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:49, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO:56.

Другие предпочтительные антитела настоящего изобретения, или их антигенсвязывающие части, содержат:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14;

где данное антитело специфически связывает PD-1.

Предпочтительная комбинация содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13.

Другая предпочтительная комбинация содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14.

Антитела настоящего изобретения могут быть, например, полноразмерными антителами, например, изотипа IgG1 или IgG4. Альтернативно, данные антитела могут быть фрагментами антител, такими как Fab или F(ab')₂ фрагменты, или одноцепочечными антителами.

Настоящее изобретение обеспечивает также иммуноконъюгат, содержащий антитело настоящего изобретения или его антигенсвязывающую часть, связанные с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин или радиоактивный изотоп. Настоящее изобретение обеспечивает также биспецифическую молекулу, содержащую антитело или его антигенсвязывающую часть настоящего изобретения, связанные со второй функциональной частью, имеющей другую специфичность связывания, чем указанное антитело или его антигенсвязывающая часть.

Обеспечены также композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающую часть, или иммуноконъюгат или биспецифическую молекулу настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие данные антитела или их антигенсвязывающие части настоящего изобретения, также включены в настоящее изобретение, а также экспрессирующие векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие экспрессирующие векторы. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает трансгенную мышь, содержащую трансгены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека, причем указанная мышь экспрессирует антитело настоящего изобретения, а также гибридомы, полученные из такой мыши, причем указанная гибридома продуцирует антитело настоящего изобретения.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ модуляции иммунной реакции у субъекта, предусматривающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающей части настоящего изобретения таким образом, что иммунная реакция у данного субъекта модулируется. Предпочтительно, антитело настоящего изобретения усиливает, стимулирует или увеличивает иммунную реакцию у данного субъекта.

В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества анти-PD-1-антитела или его антигенсвязывающей части. Антитела настоящего изобретения предпочтительны для применения в данном способе, хотя вместо них могут быть использованы другие анти-PD-1-антитела (самостоятельно или в комбинации с анти-PD-1-антителом настоящего изобретения). Например, в способе ингибирования роста опухоли может быть использовано химерное, гуманизированное или полностью анти-PD-1-антитело человека.

В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения инфекционного заболевания у субъекта, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества анти-PD-1-антитела или его антигенсвязывающей части. Антитела настоящего изобретения предпочтительны для применения в данном способе, хотя вместо них могут быть использованы другие анти-PD-1-антитела (самостоятельно или в комбинации с анти-PD-1-антителом настоящего изобретения). Например, в способе лечения инфекционного заболевания может быть использовано химерное, гуманизированное или полностью анти-PD-1-антитело человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ усиления иммунной реакции на антиген у субъекта, предусматривающий введение данному субъекту: (i) антигена и (ii) анти-PD-1-антитела или его антигенсвязывающей части таким образом, что иммунная реакция на данный антиген у субъекта усиливается. Таким антигеном может быть, например, опухолевый антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген или антиген из патогена. Антитела настоящего изобретения предпочтительны для применения в данном способе, хотя вместо них могут быть использованы другие анти-PD-1-антитела (самостоятельно или в комбинации с анти-PD-1-антителом настоящего изобретения). Например, в способе усиления иммунной реакции на антиген у субъекта может быть использовано химерное, гуманизированное или полностью анти-PD-1-антитело человека.

Настоящее изобретение обеспечивает также способы получения анти-PD-1-антител «второй генерации» на основе последовательностей анти-PD-1-антител настоящего изобретения. Например, настоящее изобретение обеспечивает способ получения анти-PD-1-антитела, предусматривающий:

(а) обеспечение: (i) последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:15, 16, 17, 18, 19, 20 и 21, и/или последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28; и/или последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35; или (ii) последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:36, 37, 38, 39, 40, 41 и 42, и/или последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49, и/или последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:50, 51, 52, 53, 54, 55 и 56;

(b) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка по меньшей мере в одной последовательности вариабельной области антитела, причем указанная последовательность выбрана из последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела; и

(с) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие. Содержание всех цитируемых ссылок, вводов GenBank, патентов и опубликованных заявок на патент специально включено в данное описание посредством ссылки.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:57) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 17D8. Области CDR1 (SEQ ID NO:15), CDR2 (SEQ ID NO:22) и CDR3 (SEQ ID NO:29) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V, D и J.

На фиг.1В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:64) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 17D8. Области CDR1 (SEQ ID NO:36), CDR2 (SEQ ID NO:43) и CDR3 (SEQ ID NO:50) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.2А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:58) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 2D3. Области CDR1 (SEQ ID NO:16), CDR2 (SEQ ID NO:23) и CDR3 (SEQ ID NO:30) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.2В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:65) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:9) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 2D3. Области CDR1 (SEQ ID NO:37), CDR2 (SEQ ID NO:44) и CDR3 (SEQ ID NO:51) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.3А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:59) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 4Н1. Области CDR1 (SEQ ID NO:17), CDR2 (SEQ ID NO:24) и CDR3 (SEQ ID NO:31) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.3В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:66) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:10) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 4Н1. Области CDR1 (SEQ ID NO:38), CDR2 (SEQ ID NO:45) и CDR3 (SEQ ID NO:52) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.4А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:60) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 5С4. Области CDR1 (SEQ ID NO:18), CDR2 (SEQ ID NO:25) и CDR3 (SEQ ID NO:32) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.4В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:67) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:11) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 5С4. Области CDR1 (SEQ ID NO:39), CDR2 (SEQ ID NO:46) и CDR3 (SEQ ID NO:53) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.5А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:61) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:5) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 4А11. Области CDR1 (SEQ ID NO:19), CDR2 (SEQ ID NO:26) и CDR3 (SEQ ID NO:33) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.5В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:68) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 4А11. Области CDR1 (SEQ ID NO:40), CDR2 (SEQ ID NO:47) и CDR3 (SEQ ID NO:54) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.6А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:62) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 7D3. Области CDR1 (SEQ ID NO:20), CDR2 (SEQ ID NO:27) и CDR3 (SEQ ID NO:34) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.6В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:69) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:13) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 7D3. Области CDR1 (SEQ ID NO:41), CDR2 (SEQ ID NO:48) и CDR3 (SEQ ID NO:55) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.7А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:63) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:7) вариабельной области тяжелой цепи моноклонального антитела человека 5F4. Области CDR1 (SEQ ID NO:21), CDR2 (SEQ ID NO:28) и CDR3 (SEQ ID NO:35) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.7В показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:70) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:14) вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела человека 5F4. Области CDR1 (SEQ ID NO:42), CDR2 (SEQ ID NO:49) и CDR3 (SEQ ID NO:56) показаны прерывистой линией и указаны деривации (источники) зародышевой линии V и J.

На фиг.8 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 и 7D3 с аминокислотной последовательностью V_H 3-33 зародышевой линии человека (SEQ ID NO:71).

На фиг.9 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 17D8, 2D3 и 7D3 с аминокислотной последовательностью V_k L6 зародышевой линии человека (SEQ ID NO:73).

На фиг.10 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 4Н1 и 5С4 с аминокислотной последовательностью V_k L6 зародышевой линии человека (SEQ ID NO:73).

На фиг.11 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи 4А11 и 5F4 с аминокислотной последовательностью V_H 4-39 зародышевой линии человека (SEQ ID NO:72).

На фиг.12 показано сопоставление аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи 4А11 и 5F4 с аминокислотной последовательностью V_k L15 зародышевой линии человека (SEQ ID NO:74).

На фиг.13А-13В показаны результаты экспериментов с проточной цитометрией, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека 5С4 и 4Н1, направленные против PD-1 человека, связываются с клеточной поверхностью клеток СНО, трансфицированных полноразмерным PD-1 человека. На фиг.13А показан график проточной цитометрии для 5С4. На фиг.13В показан график проточной цитометрии для 4Н1. Тонкая линия представляет связывание с клетками СНО, и жирная линия представляет связывание с СНО-hPD-1-клетками.

На фиг.14 показывает график, демонстрирующий, что моноклональные антитела 17D8, 2D3, 4H1, 5C34 и 4А11, направленные против PD-1 человека, специфически связываются с PD-1, но не с другими членами семейства CD28.

На фиг.15А-15С показаны результаты экспериментов с проточной цитометрией, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека 5С4 и 4Н1, направленные против PD-1 человека, связываются с PD-1 на клеточной поверхности. На фиг.15А показано связывание с активированными Т-клетками человека. На фиг.15В показано связывание с Т-клетками собакоподобной обезьяны. На фиг.15С показано связывание с трансфицированными клетками СНО, экспрессирующими PD-1.

На фиг.16А-16С показаны результаты экспериментов, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека против PD-1 человека стимулируют пролиферацию Т-клеток, секрецию IFN-гамма и секрецию IL-2 в анализе реакции лимфоцитов в смешенной культуре. Фиг.16А является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации пролиферацию Т-клеток; фиг.16В является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации секрецию IFN-гамма; фиг.16С является диаграммой в виде столбцов, показывающей зависимую от концентрации секрецию IL-2.

На фиг.17А-17В показаны результаты экспериментов с проточной цитометрией, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека против PD-1 человека блокируют связывание PD-L1 и PD-L2 с трансфицированными клетками СНО, экспрессирующими PD-1. Фиг.17А является графиком, показывающим ингибирование связывания PD-L1; фиг.17В является графиком, показывающим ингибирование связывания PD-L2.

На фиг.18 показывает результаты экспериментов с проточной цитометрией, демонстрирующие, что моноклональные антитела человека против PD-1 человека не стимулируют апоптоз Т-клеток.

На фиг.19 показывает результаты экспериментов, демонстрирующие, что анти-PD-1-HuMab имеют зависимое от концентрации действие на секрецию IFN-гамма PBMC из CMV-положительных доноров, когда PBMC стимулировали лизатом CMV и анти-PD-1-антителом.

На фиг.20 показывает результаты экспериментов по росту опухоли на системе мышиной модели, демонстрирующие, что лечение опухоли мыши in vivo анти-PD-1-антителами ингибирует рост опухоли.

На фиг.21А-21D показан объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым имплантировали опухолевые клетки ободочной кишки МС38 (PD-1^-) и в тот же день подвергали одной из следующих терапий: (A) IgG мыши (контроль), (B) анти-CTLA-4-антитело, (C) анти-PD-1-антитело и (D) анти-CTLA-4-антитело и анти-PD-1-антитело. Мышей подвергали последующей обработке антителами в дни 3, 6 и 10, как описано в примере 13, и объем опухоли подвергали мониторингу на протяжении 60 дней.

На фиг.22 показан средний объем опухоли мышей, показанный на фиг.21

На фиг.23 показана медиана объема опухоли мышей, показанного на фиг.21.

На фиг.24A-24D показан объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым были имплантированы опухолевые клетки MC38 ободочной кишки (PD-L1^-) и спустя одну неделю были подвергнуты одной из следующих терапий: (A) IgG мыши (контроль), (B) анти-CTLA-4-антитело, (C) анти-PD-1-антитело и (D) анти-CTLA-4-антитело и анти-PD-1-антитело. Объем опухоли в первый день обработки составлял приблизительно 315 мм³. Мышей подвергали последующей обработке антителами в дни 3, 6 и 10, как описано в примере 14.

На фиг.25 показан средний объем опухоли мышей, показанный на фиг.24.

На фиг.26 показана медиана объема опухоли мышей, показанного на фиг.24.

На фиг.27 показан средний объем опухоли во времени у отдельных мышей, которым были имплантированы опухолевые клетки MC38 ободочной кишки (PD-L1^-) (день -7) и затем были подвергнуты в дни 0, 3, 6 и 10 после имплантации (как описано в примере 15) одной из следующих терапий: (A) IgG мыши в качестве контроля (20 мг/кг, X₂₀) (B) анти-PD-1-антитело (10 мг/кг) и IgG мыши (10 мг/кг) (P₁₀X₁₀), (C) анти-CTLA-4-антитело (10 мг/кг) и IgG мыши (10 мг/кг) (C₁₀X₁₀), (D)