Вектор экспрессии млекопитающих

Вектор экспрессии млекопитающих

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии млекопитающих для экспрессии целевого полипептида, а также к способам экспрессии целевого полипептида в клетках-хозяевах млекопитающих с применением соответствующего вектора и клеток-хозяев, включающих указанный вектор.

Способность клонировать и экспрессировать рекомбинантные пептиды и белки в больших количествах в последние годы стала особенно актуальной. Способность очищать белки до высокой степени очистки важна в области фармацевтики человека и биотехнологии, например, для получения белковых лекарственных средств, а также для исследований, например, для кристаллизации белков для определения их трехмерной структуры. С другой стороны, белки, которые трудно получить в значительном количестве, могут быть подвергнуты сверхэкспрессии в клетках-хозяевах, затем выделены и очищены.

Выбор системы сверхэкспрессии для получения рекомбинантных белков зависит от многих факторов, включая показатели роста клеток, уровни экспрессии, внутриклеточную и внеклеточную экспрессию, посттрансляционные модификации и биологическое действие целевого белка, а также результаты регуляции и экономические соображения при получении терапевтических белков. Ключевыми преимуществами клеток млекопитающих по сравнению с другими системами экспрессии, например, бактериями или дрожжами, являются способность осуществлять правильное сворачивание белка, сложное N-связанное гликозилирование и аутентичное O-связанное гликозилирование, а также широкий спектр других посттрансляционных модификаций. Ввиду указанных преимуществ, клетки млекопитающих в настоящее время являются предпочтительной системой экспрессии для получения сложных лекарственных белков, например, моноклональных антител. Первой стадией получения линии рекомбинантных клеток является конструкция вектора экспрессии. Вектор экспрессии является ключевым элементом для стимуляции экспрессии гетерологичного гена в клетках-хозяевах и для обеспечения селективных маркеров для получения линии рекомбинантных клеток. Важными элементами векторов экспрессии млекопитающих обычно являются конститутивный или индуцибельный промотор, способный проявлять сильное транскрипционное действие; сигналы оптимизированного процессинга иРНК и трансляции, которые обычно включают последовательность Kozak, кодон терминации трансляции, сигналы расщепления иРНК и полиаденилирования, а также сигналы сплайсинга иРНК; терминатор транскрипции; селективные маркеры для получения стабильных линий клеток и для амплификации гена; прокариотический репликатор и селективные маркеры размножения вектора в бактериях.

В последние годы разработки в данной области были сосредоточены на конструировании улучшенных векторов для экспрессии генов в клетках млекопитающих. Несмотря на избыток имеющихся векторов, устойчивая выработка полипептида/белка в клетках млекопитающих все еще требует приложения сил. Некоторые факторы могут влиять на рекомбинантную экспрессию в клетках млекопитающих, в том числе сила промотора, окружение 5' нетранслируемой области и области инициации трансляции, эффективность 3' нетранслируемой области, на полиаденилирование и терминацию транскрипции, сайт инсерции беспорядочно интегрированного рекомбинантного гена в хромосому хозяина и число интегрированных копий подвергаемого экспрессии гена. Повышение числа генных копий в большинстве случаев достигается амплификацией гена при использовании линии клеток, недостаточных по ферменту, например, дигидрофолатредуктазе (DHFR; dihydrofolate reductase - DHFR) или глутаминсинтетазе (СГ), в соединении с векторами экспрессии, содержащими гены, которые кодируют некоторые ферменты и агенты, например, метотрексат (МТ), ингибирующий DHFR, и метионинсульфоксамин (МСА), который ингибирует СГ. Используя векторы экспрессии, содержащие рекомбинантный ген под контролем сильного промотора и гены, кодирующие DHFR или ГС, трансфектанты DHFR⁺ или ГС⁺, соответственно, получены впервые и генную амплификацию затем достигают выращиванием трансфектантов при постепенно повышающихся концентрациях МТ или MAC.

Задачей настоящего изобретения является получение улучшенного экспрессирующего вектора, а также системы экспрессии для экспрессии целевого полипептида в клетках млекопитающего.

Таким образом, предусмотрена нуклеиновая кислота вектора для экспрессии по меньшей мере одного целевого полипептида в клетках млекопитающего, включающая:

(а) по меньшей мере одну кассету экспрессии (POI) для экспрессии целевого полипептида (polypeptide of interest - POI);

(б) кассету экспрессии (MSM), включающую ген селективного маркера млекопитающих (mammalian selectable marker gene - MSM);

(в) кассету экспрессии (MASM), включающую амплифицируемый ген селективного маркера млекопитающих (mammalian amplifiable, selectable marker gene - MASM);

причем кассета экспрессии (POI) фланкирована с 5'-конца кассетой экспрессии (MASM), кассета экспрессии (MSM) локализована с 3'-конца от кассеты экспрессии (POI), причем в указанной нуклеиновой кислоте кассеты экспрессии (MASM), (POI) и (MSM) расположены в той же ориентации от 5' к 3'.

Понятие «нуклеиновая кислота вектора» по настоящему изобретению относится к полинуклеотиду, который несет по меньшей мере один чужеродный фрагмент нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота вектора функционирует в качестве «молекулярного носителя», высвобождающего фрагменты нуклеиновых кислот, соответственно полинуклеотидов, в клетке-хозяине. Она включает по меньшей мере одну кассету экспрессии, включающую регуляторные и кодирующие последовательности. Кассета экспрессии осуществляет правильную экспрессию инкорпорированного полинуклеотида. Кассеты экспрессии, применимые в настоящем изобретении, подробно описаны ниже. Чужеродные полинуклеоиды, например, кодирующие целевой полипептид, могут быть инсертированы в кассеты экспрессии нуклеиновой кислоты вектора для экспрессии. Нуклеиновая кислоты вектора по настоящему изобретению может быть в кольцевой или линейной форме. Указанный сайт может быть, например, сайтом множественного клонирования (multiple cloning site - MCS).

Экспрессирующая кассета (POI) означает экспрессирующую кассету для экспрессии целевого полипептида (polypeptide of interest - POI). Указанная кассета экспрессии (POI) включает или полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, или сайт, пригодный для инсерции соответствующего полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид.

Понятие «полипептид» относится к молекуле, представляющий полимер из аминокислот, объединенных пептидными связями. Полипептиды могут быть какой-либо длины, в том числе белки (например, имеющие более 50 аминокислот) и пептиды (например, из 2-49 аминокислот). К полипептидам относятся белки и/или пептиды какого-либо действия или биологической активности. Соответствующие примеры рассматриваются ниже.

Кассета экспрессии (MSM) означает кассету экспрессии, включающую ген селективного маркера млекопитающих (mammalian selectable marker gene - MSM). Гены селективного маркера млекопитающих позволяют отбирать клетки-хозяева млекопитающих, включающие указанные гены, и таким образом клетки-хозяева млекопитающих, включающие вектор. Соответствующие примеры подробно описаны ниже.

Кассета экспрессии (MASM) означает кассету экспрессии, включающую амплифицируемый ген селективного маркера млекопитающих (mammalian amplifiable, selectable marker gene - MASM). Амплифицируемые гены селективных маркеров млекопитающих позволяют отбирать содержащие вектор клетки-хозяева млекопитающих, а также генную амплификацию. Соответствующие примеры подробно описаны ниже.

Обозначения «5'» и «3'» традиционно используются для описания свойств последовательности нуклеиновой кислоты, касающихся или положения генетических элементов, и/или направления (от 5' до 3'), например, транскрипции РНК полимеразой, или осуществляемой рибосомой трансляции, которая происходит в направлении от 5' к 3'. Синонимами являются понятия «расположенный выше по цепи» или «5'» и «расположенный ниже по цепи» или «3'». Условно последовательности ДНК, генные карты, карты векторов и последовательности РНК показаны от 5'-конца к 3'-концу слева направо, или в направлении от 5' к 3', обозначенном стрелками, причем наконечники стрелок указывают в направлении к 3'. Таким образом, 5' (выше по цепи) означает генетические элементы, расположенные с левой стороны, а 3' (ниже по цепи) означает генетические элементы, расположенные с правой стороны, при соблюдении принятого условного правила.

Сборка и ориентация кассет экспрессии в векторах по настоящему изобретению имеют большое значение. По настоящему изобретению кассета экспрессии (POI) фланкирована 5' кассетой экспрессии (MASM). Таким образом, кассета экспрессии (MASM) локализована 5' рядом с кассетой экспрессии (POI) и в тесной близости к ней. Безусловно, последовательности основы векторов могут разделять кассеты экспрессии (MASM) и (POI). Однако, предпочтительно, когда между кассетой экспрессии (MASM) и кассетой экспрессии (POI) нет других кассет экспрессии. Кассета экспрессии (MSM) локализована 3' от кассеты экспрессии (POI). Другие кассеты экспрессии могут быть инсертированы между кассетами экспрессии (POI) и (MSM), например, дополнительная кассета экспрессии (POI') для экспрессии дополнительного целевого полипептида (подробно описанного ниже). Все кассеты экспрессии (MASM), (POI) и (MSM) расположены в той же от 5' к 3' ориентации. В настоящем изобретении установлено, что такая конкретная конфигурация нуклеиновой кислоты вектора позволяет быстро размножить линии высокопродуктивных клеток.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения кассета экспрессии (POI) не включает полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид. Таким образом, предусмотрен вектор экспрессии с «пустой» кассетой экспрессии (POI). Однако, указанный полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, может быть инкорпорирован в кассету экспрессии (POI), используя соответствующие методы клонирования, например, используя ферменты рестрикции для инсерции полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид в кассете экспрессии (POI). Для этой цели кассета экспрессии (POI) может включать, например, сайтом множественного клонирования (MCS), который может, например, применяться во всех рамках считывания. Соответствующие сайты MCS подробно описаны ниже. Соответствующая нуклеиновая кислота «пустого» вектора может, например, быть получена пользователями, которые затем инсертируют подвергаемые экспрессии специфические целевые полинуклеотиды в кассету экспрессии (POI). Кассета экспрессии (POI) также может включать замещающий полинуклеотид или ложную последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть иссечена и замещена полинуклеотидом, кодирующим целевой полипептид. Настоящее изобретение также предусматривает нуклеиновую кислоту вектора, описанную выше, включающую кассету экспрессии (POI), включающую полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид. Такой вариант осуществления настоящего изобретения принадлежит в основном к получаемой в итоге нуклеиновой кислоте вектора, которую трансфецируют для экспрессии в клетке-хозяине.

Полинуклеотид является полимером из нуклеотидов, которые обычно связаны между одной и другой дезоксирибозой (или рибозой). Понятие «полинуклеотид» не подразумевает какие-либо ограничения по размеру и кроме того охватывает полинуклеотиды, включающие модификации, в частности модифицированные нуклеотиды.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота вектора является кольцевой и кассета экспрессии (MSM) расположена в направлении 3' от кассеты экспрессии (POI) и кассета экспрессии (MASM) расположена в направлении 3' от кассеты экспрессии (MSM). В другом варианте описание кольцевого вектора по настоящему изобретению касается кольцевой нуклеиновой кислоты вектора для экспрессии по меньшей мере одного целевого полипептида в клетках млекопитающих, включающей:

(а) по меньшей мере одну кассету экспрессии (POI) для экспрессии целевого полипептида;

(б) кассету экспрессии (MSM), включающую ген селективного маркера млекопитающих;

(в) кассету экспрессии (MASM), включающую амплифицируемый ген селективного маркера млекопитающих;

причем кассета экспрессии (MSM) расположена в направлении 3' от кассеты экспрессии (POI) и кассета экспрессии (MASM) расположена в направлении 3' от кассеты экспрессии (MSM), причем кассеты экспрессии (MASM), (POI) и (MSM) расположены в той же ориентации от 5' к 3'.

Нуклеиновая кислота вектора может быть трансфецирована в клетки-хозяева в кольцевой форме. Суперскрученные молекулы векторов обычно могут быть конвертированы в линейные молекулы в ядре из-за действия эндо- и экзонуклеаз. Однако линеаризация нуклеиновой кислоты вектора перед трансфекцией часто улучшает эффективность стабильной трансфекции. На эту эффективность также влияет контроль точки линеаризации, если вектор линеаризируют перед трансфекцией.

Таки образом, по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии включает заранее определенный сайт рестрикции, который можно использовать для линеаризации нуклеиновой кислоты вектора перед трансфекцией. Продуманное размещение указанного сайта рестрикции для линеаризации имеет важное значение, поскольку указанный сайт рестрикции определяет, где нуклеиновая кислота вектора открывается/линеаризируется и таким образом определяет порядок/сборку кассет экспрессии, когда конструкцию интегрируют в геном клеток млекопитающих.

Таким образом, нуклеиновая кислота вектора может включать сайт рестрикции для линеаризации вектора, причем указанный сайт рестрикции для линеаризации локализован между кассетами экспрессии (MSM) и (MASM). Предпочтительно указанный сайт рестрикции для линеаризации является уникальным и один раз содержится в нуклеиновой кислоте вектора экспрессии. Например, может использоваться сайт рестрикции для линеаризации, который распознается ферментом рестрикции, имеющим низкую частоту разрезания, для того, чтобы обеспечить расщепление вектора только по сайту рестрикции для линеаризации, но не расщепления (или такое расщепление происходит редко), например, в кассетах (кассете) экспрессии или в основе вектора. Такое положение может поддерживаться, например, путем обеспечения сайта рестрикции для фермента рестрикции, который распознает последовательность из более шести пар оснований или который распознает последовательности, которые недостаточно представлены в хромосомальной ДНК. Соответствующим примером является фермент SwaI, и, следовательно, вектор может включать сайт распознавания ферментом SwaI в качестве уникального сайта рестрикции для линеаризации. Если указанный сайт линеаризации содержится более одного раза в последовательности нуклеиновой кислоты вектора (включая полинуклеотиды, кодирующие целевой полипептид), или если используют фермент рестрикции, который разрезает несколько раз последовательность нуклеиновой кислоты вектора, эти случаи также входят в рамки охвата настоящего изобретения, например, для изменения/мутирования сайтов рестрикции помимо сайта рестрикции для линеаризации, который локализован~между кассетами экспрессии (MSM) и (MASM), для элиминации таких дополнительных сайтов рестрикции и для получения уникального или по меньшей мере редкого сайта рестрикции для линеаризации.

Если вектор применяют в качестве стандартного вектора экспрессии, предназначенного, например, для использования в качестве инструмента для экспрессии нескольких разных полипептидов, целесообразно обеспечить сайт рестрикции для линеаризации, включая сайты множественного распознавания для ферментов с низкой частотой разрезания. Ферменты рестрикции, выбранные для линеаризации, предпочтительно не должны разрезать внутри кассет экспрессии для селективных маркеров или других последовательностей основы вектора, чтобы убедиться, что фермент разрезает только один раз для правильной линеаризации вектора. Путем обеспечения сайта рестрикции для линеаризации, включая сайты множественного распознавания для ферментов рестрикции, имеющих низкую частоту разрезания, может быть выбран соответствующий фермент рестрикции для линеаризации из имеющихся возможностей, чтобы надежно избежать рестрикции внутри полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид. Однако, согласно описанному выше, дополнительные сайты рестрикции могут быть мутированы или может быть осуществлена частичная рестрикция.

Размещение сайта рестрикции для линеаризации между кассетой экспрессии (MSM) и кассетой экспрессии (MASM) приводит к тому, что кассета экспрессии (POI) (и другие кассеты экспрессии для экспрессии целевых полипептидов, если они имеются) фланкирована в направлении 5' кассетой экспрессии (MASM). Кассета экспрессии (MSM) локализована в направлении 3' от кассеты экспрессии (POI) при линеаризации. Таким образом, кассеты экспрессии (MSM) и (MASM) разделены при линеаризации кольцевой нуклеиновой кислоты вектора. Если имеется кассета экспрессии (PSM) бактериального селективного маркера (см. ниже), сайт рестрикции для линеаризации предпочтительно размещен между кассетами экспрессии (PSM) и (MASM). При этом бактериальный ген селективного маркера расположен ниже по цепи (3') и поэтому находится «вне» частей линеаризованной нуклеиновой кислоты вектора «млекопитающего». Такая сборка предпочтительна, поскольку бактериальные гены по-видимому не несут преимуществ при экспрессии в млекопитающих, поскольку бактериальные последовательности могут привести к повышенному метилированию или другим эффектам сайленсинга в клетках млекопитающих.

К неограничительным примерам генов селективных маркеров млекопитающих, которые могут быть включены в кассету экспрессии (MSM), относятся гены устойчивости к антибиотикам, например, гены, обеспечивающий устойчивость к антибиотикам: G418; гигромицину (hyg или hph, коммерческий продукт фирмы Life Technologies, Inc. Gaithesboro, Мерилэнд.); неомицину (пео, коммерческий продукт фирмы Life Technologies, Inc. Gaithesboro, Md.); зеоцину (Sh Ble, коммерческий продукт фирмы Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния); пуромицину (рас, пуромицин-N-ацетилтрансфераза, продукт фирмы Clontech, Palo Alto Calif.), уабаину (oua, продукт фирмы Pharmingen) и бластицидину (фирма Invitrogen). Соответствующие гены селективных маркеров млекопитающих известны и позволяют отбирать клетки-хозяева млекопитающих, включающих указанные гены, и таким образом, клетки-хозяева, включающие вектор. Понятие «ген» в контексте настоящего изобретения относится к природному или синтетическому полинуклеотиду, кодирующему функциональный вариант селективного маркера, обеспечивающего обозначенную устойчивость. Поэтому к данному понятию относятся также усеченные или мутантные версии гена дикого типа или синтетические полинуклеотиды до тех пор, пока они обеспечивают соответствующую устойчивость. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанная кассета экспрессии (MSM) включает ген, кодирующий ферментативно функциональную неомицинфосфотрансферазу (I или II). Данный вариант осуществления настоящего изобретения высоко эффективен в сочетании с применением гена, кодирующего ферментативно функциональную DHFR, в качестве амплифицируемого гена селективного маркера.

Амплифицируемые гены селективных маркеров млекопитающих позволяют проводить отбор клеток-хозяев млекопитающих, содержащих вектор, и выявлять амплификацию гена. Неограничительным примером амплифицируемого гена селективного маркера млекопитающих является ген дигидрофолатредуктазы (DHFR). Другие используемые в настоящее время системы применяют наряду с системой глутаминсинтетазы (ГС) (Bebbington и др., 1992) и производной от гистидинола системой селекции (Hartmann и Mulligan, 1988). Такие амплифицируемые маркеры также являются селективными маркерами и, следовательно, могут применяться для отбора тех клеток, которые приобрели вектор. DHFR и глутаминсинтетаза обеспечивают хорошие результаты. В обоих случаях отбор обычно происходит в отсутствии соответствующего метаболита (гипоксантина и тимидина в случае DHFR, глутамина в случае ГС), предотвращающего рост нетрансформированных клеток. С такими системами амплификации, например, системой DHFR, экспрессия рекомбинантного белка может быть повышена путем экспозиции клеток определенными агентами, стимулирующими генную амплификацию, например, антифолатами (например, метотрексатом (МТ)) в случае системы DHFR. Соответствующим ингибитором амплификации гена индукции ГС является метионинсульфоксимин (MAC). Экспозиция MAC также приводит к генной амплификации. По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная кассета экспрессии (MASM) включает ген, кодирующий ферментативно функциональную глутаминсинтетазу (ГС) или дигидрофолатредуктазу (DHFR).

По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная кассета экспрессии (MSM) включает ген, кодирующий ферментативно функциональную неомицинфосфотрансферазу, и указанная кассета экспрессии (MASM) включает ген, кодирующий ферментативно функциональную дигидрофолатредуктазу (DHFR).

Вектор может включать по меньшей мере одну дополнительную кассету экспрессии (POI') для экспрессии дополнительного целевого полипептида. Указанная дополнительная кассета экспрессии (POI') расположена между кассетой экспрессии (POI) и кассетой экспрессии (MSM). Указанная кассета экспрессии (POI') расположена в той же ориентации от 5' к 3', что и кассеты экспрессии (POI) и (MSM). По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения она включает полинуклеотид, кодирующий дополнительный целевой полипептид.

Таким образом, нуклеиновая кислота вектора по настоящему изобретению может включать более одной кассеты экспрессии для экспрессии целевых полипептидов. Следовательно, может быть несколько кассет экспрессии ((POI), (POI'), (POI") и др.) для экспрессии разных целевых полипептидов, расположенных в нуклеиновую кислоту вектора экспрессии по настоящему изобретению. Такие кассеты экспрессии фланкированы в направлении 5' кассетой экспрессии (MASM) и в направлении 3' кассетой экспрессии (MSM). Следовательно, настоящее изобретение также предусматривает нуклеиновую кислоту вектора, включающую более одной кассеты экспрессии, кодирующей, например, субъединицы димерных или в более высокой степени мультимерных белков. Кассеты экспрессии, кодирующие разные субъединицы мультимерных белков, причем каждая инкорпорирована в отдельную кассету экспрессии, могут быть размещены рядом друг с другом. Для мультимерных белков, кодируемых по меньшей мере двумя разными генами (например, легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина или их функциональных фрагментов, например, по меньшей мере вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина), полинуклеотиды, кодирующие требуемые субъединицы целевого полипептида, инсертированы в кассеты экспрессии (POI) и (POI'). Соответствующий вариант осуществления настоящего изобретения, с использованием по меньшей мере двух кассет экспрессии (POI) и (POI') для экспрессии целевых полипептидов, особенно предпочтителен для экспрессии молекул иммуноглобулина, например, антибиотиков или их функциональных фрагментов. Таким образом, нуклеиновая кислота вектора предусмотрена для экспрессии молекулы иммуноглобулина, включающая в каждой кассете экспрессии (POI) и (POI') полинуклеотид, кодирующий и легкую, и тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или ее фрагментов, причем каждая кассета экспрессии (POI) и (POI') включает один из указанных полинуклеотидов. Таким образом, кассета экспрессии (POI) может включать или полинуклеотид для экспрессии легкой цепи, или полинуклеотид для экспрессии тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина.

По одному из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения кассета экспрессии (POI) включает полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере часть легкой цепи указанной молекулы иммуноглобулина или ее функционального фрагмента, и кассета экспрессии (POI') включает полинуклеотид, кодирующий часть тяжелой цепи указанной молекулы иммуноглобулина или ее функционального фрагмента. Подтверждено, что сборка кассеты экспрессии для легкой цепи в направлении 5' к кассете экспрессии тяжелой цепи, полезно в плане уровня экспрессии молекул иммуноглобулина. По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота вектора экспрессии сконструирована таким образом, что кассета (кассеты) экспрессии уже включает полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере часть константных областей молекулы иммуноглобулина. Фрагменты полинуклеотида, кодирующие вариабельные части молекул иммуноглобулина, могут быть инсертированы пользователем в кассеты экспрессии, используя соответствующие стратегии клонирования для получения итогового вектора экспрессии.

Кассеты экспрессии, содержащиеся в векторе экспрессии по настоящему изобретению, сконструированы таким образом, что они допускают экспрессию инкорпорированных полинуклеотидов/генов в клетках млекопитающих. Для этой цели кассеты экспрессии обычно включают необходимые регуляторные последовательности, например, последовательность промотора и/или терминатора транскрипции, например, сайта полиА.

Векторы, используемые для экспрессии целевых полипептидов, обычно содержат элементы контроля транскрипции, применимые для индукции транскрипции, например, промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, сигналы паузы или терминации транскрипции, например, элементы кассеты экспрессии. Для правильной экспрессии полипептидов соответствующие элементы контроля трансляции предпочтительно включают в вектор, например, 5' нетранслируемые области, приводящие к структурам 5' кэп с, пригодным для рекрутинга рибосом и стоп-кодоны для терминации процесса трансляции. В частности полинуклеотид, который выступает в качестве генов селективных маркеров, кроме того, полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид, может транскрибироваться под контролем элементов транскрипции, имеющихся в соответствующих промоторах. Получаемые транскрипты генов селективных маркеров и генов целевого полипептида сохраняют элементы функциональной трансляции, которые существенно облегчают уровни экспрессии белка (т.е. трансляцию) и должную терминацию трансляции. Функциональная единица экспрессии, способная должным образом осуществлять экспрессию инкорпорированного полинуклеотида, в настоящем изобретении также относится к «кассете экспрессии». Предпочтительно она включает 3' нетранслируемую область (3' UTR).

Таким образом, предусмотрены нуклеиновые кислоты векторов, в которых кассеты экспрессии включают по меньшей мере один элемент промотора, и/или промотора/энхансера. Хотя физические границы между такими двумя контрольными элементами не всегда ясны, понятие «промотор» обычно относится к сайту молекулы нуклеиновой кислоты, с которым связываются РНК-полимераза и/или какие-либо ассоциированные факторы и с которого начинается транскрипция. Энхансеры усиливают действие промотора во времени и в пространстве. Многие промоторы обладают способностью индуцировать транскрипцию в широком диапазоне типов клеток. Промоторы можно разделить на два класса, а именно, на конститутивные и те, которые регулируются индукцией или дерепрессией. Промоторы, которые используют для осуществления на высоком уровне выработки белков в клетках млекопитающих, должны быть сильными и предпочтительно действующими в широком диапазоне типов клеток для осуществления качественной и количественной оценки рекомбинантного полипептида. Промотор может быть выбран из группы, состоящей из промотора SV40, промотора ЦМВ, промотора EF1 альфа, промотора RSV, промотора BROAD3, промотора murine rosa 26, промотора pCEFL и промотора β-актина. Сильные конститутивные промоторы, которые индуцируют экспрессию в клетках многих типов, включают, но ими не ограничиваются, главный поздний промотор аденовируса, сверхранний промотор цитомегаловируса человека, промотор вируса SV40 и вируса саркомы Рауша, промотор 3-фосфоглицераткиназы грызунов и EF1a. Хорошие результаты получены с вектором экспрессии по настоящему изобретению, если промотор и/или энхансер получены из ЦМВ и/или SV40.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения кассета (кассеты) экспрессии для экспрессии целевого полипептида (полипептидов) включает усиленный промотор и/или энхансер по сравнению с кассетами экспрессии для экспрессии селективных маркеров. Такая сборка приводит к тому, что вырабатывается больше транскрипта целевого полипептида, а не селективных маркеров. Преимущество заключается в том, что получение целевого полипептида, который секретируется, является доминантом относительно выработки селективных маркеров, поскольку способность к выработке отдельными клетками гетерологичных белков не ограничена и может таким образом сосредотачиваться на целевом полипептиде.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения кассеты экспрессии (POI) и (POI') (при наличии), которые используют для экспрессии целевого полипептида, включают промотор/энхансер ЦМВ. Конкретные примеры подробно описаны ниже. Кассеты экспрессии (MSM) и (MASM), которые предпочтительно экспрессируют DHFR и гены-маркеры неомицина, включают промотор SV40 или промотор/энхансер SV40. Известно, что промотор ЦМВ является одним из наиболее сильных промоторов, пригодных для экспрессии у млекопитающих, и приводит к очень хорошей степени экспрессии. Полагают, что он дает существенно большее количество транскрипта, чем промотор SV40.

Кроме того, кассеты экспрессии могут включать соответствующий сайт терминации транскрипции. Так непрерывная транскрипция с расположенного выше по цепи промотора через вторую единицу транскрипции может ингибировать функцию расположенного ниже по цепи промотора - явление, называемое окклюзией промотора или интерференцией транскрипции. Это явление было описано и у прокариот, и у эукариот. Правильное размещение сигналов терминации транскрипции между двумя единицами транскрипции может предупредить окклюзию промотора. Сайты терминации транскрипции описаны и показано, что их инкорпорация в векторы экспрессии обладает множественными полезными воздействиями на генную экспрессию.

Большинство возникающих эукариотических иРНК имеет полиА хвост с 3'-конца, который добавляется во время комплексного процесса, который включает расщепление первичного траснкрипта и спаренную реакцию полиаденилирования. Хвост полиА является благоприятным для стабильности и перемещаемости иРНК. Следовательно, кассеты экспрессии вектора по настоящему изобретению обычно включают сайт полиаденилирования. Имеется несколько эффективных сигналов полиА, которые могут применяться в векторах экспрессии млекопитающих, включая производные генов от гормона роста крупного рогатого скота (bovine growth hormone - bgh), бета-глобина мыши, ранней единицы транскрпции SV40 и тимидинкиназы вируса Herpes simplex. Однако, также известны синтетические сайты полиаденилирования (см., например, вектор экспрессии pCI-neo фирмы Promega по работе Levitt и др., Genes Dev. 3, (7), 1989, сс.1019-1025). Сайт полиаденилирования может быть выбран из группы, состоящей из сайта 8У40полиА, например, позднего и раннего поли-А сайта SV40 (см., например, плазмиду pSV2-DHFR в описании Subramani и др., Mol. Cell. Biol. 1981, сс.854-864), синтетического сайта полиА (см., например, вектор экспрессии pCI-neo фирмы Promega по работе Levitt и др., Genes Dev. 1989, 3, (7), сс.1019-1025) и сайта bgh полиА (гормона роста крупного рогатого скота).

Кассеты экспрессии могут включать энхансер (см. выше) и/или интрон. По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения кассета (кассеты) экспрессии для экспрессии целевого полипептида включает интрон. Большинство генов высших эукариот содержат интроны, которые удаляют при процессировании РНК. Установлено, что геномные конструкции экспрессируются более эффективно в трансгенных системах по сравнению с идентичными конструкциями, утратившими интроны. Обычно интроны помещают с 5'-конца открытой рамки считывания. Таким образом, интрон может быть включен в кассету (кассеты) экспрессии для экспрессии целевого полипептида (полипептидов) для повышения степени экспрессии. Указанный интрон может быть локализован между элементом (элементами) промотора и/или промотора/энхансера и 5'-концом открытой рамки считывания экспрессируемого полипептида. Следовательно, предусмотрена нуклеиновая кислота вектора, причем по меньшей мере кассета экспрессии (POI) включает интрон, который расположен между промотором и стартовым кодоном полинуклеотида для экспрессии целевого полипептида. Известно несколько соответствующих интронов в данной области, которые могут использоваться в связи с настоящим изобретением.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения интрон, используемый в кассетах экспрессии для экспрессии целевых полипептидов, является синтетическим интроном, например, SIS или RK интроном. RK интрон является сильным синтетическим интроном, который предпочтительно помещен перед стартовым кодоном ATG целевого гена. RK интрон состоит из сайта сплайсинга донора интрона промотора ЦМВ и сайта сплайсинг акцептора вариабельной области тяжелой цепи IgG мыши (см., например, Eaton и др., Biochemistry 25, 1986, сс.8343-8347, Neuberger и др., ЕМВО J. 2 (8), 1983, сс.1373-1378; он может быть получен от вектора pRK-5 (фирма BD PharMingen)).

Кроме того, неожиданно было установлено, что помещение интрона с 3'-конца открытой рамки считывания гена DHFR оказывает полезные воздействия на степень экспрессии/амплификации конструкции. Интрон, используемый в кассете экспрессии DHFR, приводит к меньшему, но функциональному варианту гена DHFR (Grillari и др., J. Biotechnol. 87, 2001, сс.59-65). Таким образом понижается уровень экспрессии гена DHFR. Это приводит к повышенной чувствительности к МТ и более жестким условиям отбора. Таким образом, предусмотрена нуклеиновая кислота вектора, в которой кассета экспрессии (MASM) включает интрон, который локализован в направлении 3' амплифицируемого гена селективного маркера. Соответствующий интрон может быть получен из вектора pSV2-DHFR (например, описанного выше).

Указанный вектор может включать по меньшей мере одну дополнительную кассету экспрессии (PSM), содержащую ген прокариотического селективного маркера. Указанная кассета экспрессии (PSM) локализована между кассетами экспрессии (MSM) и (MASM). Указанный селективный маркер может обеспечить устойчивость к антибиотикам, например, ампициллину, канамицину, тетрациклину и/или хлорамфениколу. Указанная кассета экспрессии (PSM) предпочтительно расположена в ориентации от 5' к 3' подобно другим кассетам экспрессии (POI), (MSM) и (MASM).

Ген DHFR действует в качестве маркера и гена генной амплификации. Отбор может осуществляться путем культивирования клеток в отсутствии соответствующих метаболитов (гипоксантина и тимидина), тем самым препятствуя росту нетрансформированных клеток. С системой DHFR экспрессия целевых полипептидов может быть повышена путем обработки клеток антифолатами, например, метотрексатом (МТ) - лекарственным средством, которое блокирует действие DHFR. Через некоторое время обработки МТ большинство клеток погибает, но небольшое число клеток с повышенной выработкой DHFR обычно выживает. При обработке МТ с повышением концентрации выжившие клетки могут часто содержать от нескольких сотен до нескольких тысяч копий интегрированного вектора, погруженного в хромосомы, которые часто удлинены. Большинство соответственно амплифицируемых клеток вырабатывает больше рекомбинантного белка, чем неамплифицируемые клетки.

Несколько ферментов DHFR и, следовательно, генов, известно в предшествующем уровне техники и они могут применяться в связи с настоящим изобретением. Фермент DHFR может быть DHFR дикого типа, или функциональным вариантом, или его производным. Понятие «вариант» или «производное» включает ферменты DHFR, имеющие одну или несколько замен в аминокислотных последовательностях (например, делеций, замещений или дополнений), а именно аминокислотной последовательности соответствующего фермента DHFR, гибридные белки, включающие фермент DHFR или его функциональный фрагмент, и ферменты DHFR, которые могут быть модифицированы для обеспечения дополнительной структуры и/или функции, а также функциональные фрагменты вышеупомянутых соединений, которые все еще обладают по меньшей мере одной функцией