Применение последовательности, кодирующей с-концевой домен тяжелой цепи токсина столбняка, в качестве лекарственного средства

Применение последовательности, кодирующей с-концевой домен тяжелой цепи токсина столбняка, в качестве лекарственного средства

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению последовательности, кодирующей С-концевой домен тяжелой цепи токсина столбняка в качестве лекарственного средства, предпочтительно для лечения бокового амиотрофического склероза (болезни Шарко), а также полипептида, кодируемого указанной последовательностью, для лечения указанного заболевания.

Уровень техники

Боковой амиотрофический склероз (болезнь Луи Герига или Шарко) представляет собой прогрессирующее, неизлечимое, смертельное заболевание, которое приводит к дегенерации двигательных нейронов на медуллярном уровне, уровне продолговатого мозга и двигательной области коры головного мозга. В Испании данное заболевание обнаруживается у 2/100000 человек, а уровень распространения составляет 1/10000, что означает, что данное заболевание в течение жизни разовьется приблизительно у 40000 испанцев (источник: Ассоциация Бокового Амиотрофического Склероза Испании - ADELA-).

Несмотря на то, что указанное заболевание было описано значительное время назад, до сих пор точно не известны причины возникновения этого заболевания, и хотя существуют генетические формы данного заболевания, известны также случаи, когда болезнь не имеет наследственного происхождения. Таким образом, предполагается, что 10% случаев имеют генетическое происхождение и представляют собой семейные формы заболевания, из которых 15-20% соответствуют мутации фермента супероксид дисмутазы (SOD-1), при этом мутацию этого фермента наблюдали при спорадических формах данного заболевания (Brown, R.H. Jr. (1997). Arch. Neurol. 54(10) 1246-1250). Мутация гена NFH, который кодирует тяжелую цепь нейрофиламента, также в виде исключения была обнаружена у пациентов, страдающих Бокового амиотрофического склероза.

Таким образом, большой интерес представляет исследование путей генетического наследования данного заболевания.

В последние годы создание моделей указанного заболевания на животных стало одним из самых важных инструментов экспериментальных исследований, направленных на поиск возможных способов лечения; что помогло прояснить некоторые вопросы, относящиеся к причинам данного заболевания, хотя его причины до сих пор в значительной степени не ясны. Ни мыши с нокаутом фермента SOD-1, ни трансгенные животные, несущие различные мутации фермента SOD-1 человека не позволили получить клиническую картину заболевания, характерную для человека. Развитие болезни наиболее схожее с заболеванием человека наблюдали у животных, которые являются трансгенными, и несут несколько копий супероксид дисмутазы с мутацией в 93 положении, так называемой SOD1 G93A (Tu, P.H., et al. (1996.) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93(7): 3155-3160.), который можно получить от Jackson Laboratory.

Несмотря на многочисленные исследования, проведенные для того, чтобы понять причины заболевания, также его механизм, для данной болезни не существует классического, эффективного способа лечения. В настоящее время ведутся исследования по трем направлениям, основанным на применении антагонистов глутамата, нейротрофических факторов и антиоксидантов, хотя на сегодняшний день ни одно из направлений не привело к созданию эффективного способа лечения.

В течение уже нескольких лет известно, что нейротрофические факторы могут спасать моторные нейроны от дегенерации. Большой интерес был вызван опытом применения генной терапии на животных моделях с применением аденовирусных векторов, которые экспрессировали различные нейротрофические факторы (GDNF, CNTF, N1-4, IGF-1); что показало обнадеживающие результаты. Тем не менее, большой иммунный ответ, который вызывает аденовирусные вектора, представляет собой значительный недостаток данного способа, что приводит к необходимости применения их только на новорожденных животных. Таким образом, хотя результаты были обнадеживающими, остается потребность в создании менее иммуногенных векторов, которые являются необходимыми для создания эффективных средств лечения ALS.

Что касается клинических испытаний, исследования проведенные в начале 1996 года группой Dr.Schuelp, не дали удовлетворительных результатов (http://www.wiley.co.uk/genetherapy). Возможными причинами этой неудачи являются природа нейротрофического фактора, использованного в тестировании (CNTF), и/или в отсутствии способности проникать в центральную нервную систему для данных факторов. В 1999 году группа доктора Axel Kahn доказала, что способ введения вышеупомянутого нейротрофического фактора в животных моделях является важной составляющей положительного терапевтического эффекта (Haase et al. (1999) Ann. Neurol. 45(3) 296-304). Отсутствие специфичности также было предложено в качестве возможной причины неудачи при введении BDNF людям при подкожной инъекции.

Кроме того, нейротрофические факторы, которые вводят системным образом применяли к существующим проблемам, хотя они могут являться создают проблемы токсичности в отношении других тканей. Несмотря на все указанные недостатки, продолжаются исследования терапевтических возможностей нейротрофических факторов в связи с их многообещающими результатами на доклинической стадии исследований. В частности, последние клинические испытания, проведенные в Рочестер Медикал Центр (Миннесота), вновь основаны на введении нейротрофического фактора - IGF-1.

Описание изобретения

Авторы данного изобретения показали, что нетоксичный С-конец тяжелой цепи токсина столбняка (НсТеТх) (который посредством создания рекомбинантных белков до сих пор использовали при лечении ALS только в качестве носителя для различных нейротрофических факторов, так же как и фермент SOD-1), сам по себе способен продлевать жизнь зараженных животных.

Таким образом, в первом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению полинуклеотида, который содержит последовательность, кодирующую изолированный НсТеТх, его аллельный вариант или функциональный фрагмент для создания лекарственного препарата, предпочтительного для лечения ALS. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения последовательность, кодирующая НсТеТх охватывает триплет кодирующий аминокислоту V (валин) в последовательности М-конца НсТеТх и триплет, кодирующий аминокислоту D (аспарат), желательно с аминокислоты V (854) по аминокислоту D (1315) в последовательности с номером доступа (NCBI.: P04958). В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения последовательность, кодирующая НсТеТх представляет собой SEQ ID NO: 1, а фрагмент НсТеТх соответствует последовательности SEQ ID NO: 5. Далее по тексту этот полинуклеотид обозначают, как «полинуклеотид согласно настоящему изобретению».

В другом предпочтительном варианте реализации полинуклеотид согласно настоящему изобретению может быть получен мутацией (удаление, вставка, инверсия, точечная мутация и т.д.), причем вышеупомянутая мутация не влияет на его способность действовать, как лекарственное средство, в частности, для лечения ALS. Сохранение терапевтического эффекта мутировавшего полинуклеотида согласно настоящему изобретению может быть проверено путем воспроизведения любого из примеров I или II. На протяжении всего описания такой мутированный полинуклеотид должен рассматриваться, как аллельный вариант.

В предпочтительном варианте реализации полинуклеотид согласно настоящему изобретению также может включать промоторную, терминаторную последовательность или последовательность сайленсера, последовательность, которая способствуют интеграции в хромосому или в любой тип структуры, организующей генетический материал и т.д.

Второй аспект изобретения относится к применению вектора, который содержит полинуклеотид согласно настоящему изобретению для создания лекарственного препарата, предпочтительно для лечения ALS, причем указанный вектор выбран из группы, включающей (без любого ограничения) плазмиды, фаги, искусственные хромосомы дрожжей (YAC), искусственные хромосомы бактерий (ВАС), искусственные хромосомы человека (НАС), вирусные вектора такие, как аденовирусы, ретровирусы или любой другой тип молекул ДНК или РНК, способный к репликации в прокариотической или эукариотической клетке. В дальнейшем указанный вектор называют «вектор согласно настоящему изобретению».

Третий аспект настоящего изобретения относится к применению трансгенной клетки для создания лекарственного препарата, предназначенного для лечения ALS, согласно которому указанная клетка содержит полинуклеотид согласно настоящему изобретению или вектор согласно настоящему изобретению.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к применению изолированного нуклеотида, который содержит последовательность, кодирующую изолированный НсТеТх, его аллельный вариант или его функциональный фрагмент для создания лекарственного препарата для лечения ALS. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, последовательность НсТеТх содержит аминокислоты от кислоты V(854) до D(13151) последовательности с номером доступа (NCBI.: P04958). В еще более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения последовательность НсТеТх представляет собой SEQ ID NO: 2 и фрагмент НсТеТх представляет собой SEQ ID NO: 6. Далее по тексту указанный полинуклеотид обозначают как «полинуклеотид согласно настоящему изобретению».

В другом предпочтительном варианте реализации полипептид согласно настоящему изобретению содержит мутацию (удаление, вставку, инверсию, точечное замещение аминокислоты и т.д.), но данная мутация не влияет на его способность действовать в качестве лекарственно средства для лечения ALS. Сохранение терапевтического эффекта мутированного полинуклеотида согласно настоящему изобретению можно проверить путем воспроизведения примеров 1 и 2.

Для введения препарата или фармацевтического состава полинуклеотида, вектора, трансгенной клетки или полипептида согласно настоящему изобретению будут получены в фармацевтической форме, пригодной для их введения с помощью выбранного пути введения. Для этого указанная фармацевтическая смесь должна содержать в себя носитель и вспомогательные вещества, которые фармацевтически приемлемы и необходимы для осуществления введения препарата. Информация о вспомогательных веществах и носителе, которые можно использовать для создания указанного лекарственного препарата, а также о фармацевтических формах для введения активных составляющих в обобщенном виде представлена в книге "Treatise of the Galenic Pharmacy", by C. Fauli i Trillo, 1st Edition, 1993, Luzan 5, SA de Ediciones.

Указанная фармацевтическая композиция содержит в достаточном для достижения терапевтического эффекта количестве по меньшей мере один элемент из группы, включающей: полинуклеотид, вектор, трансгенную клетку или полипептид согласно настоящему изобретению. Выражение «терапевтически эффективное количество», используемое в данном описании, означает, что количество выбранного элемента рассчитано для достижения заданного эффекта и в целом зависит от характеристик самого полипептида, помимо всего прочего, терапевтического действия, которое надо получить, от расположенности к лечению каждого отдельного пациента, от тяжести заболевания и т.д. В дальнейшем, указанную фармацевтическую композицию обозначают, как «фармацевтическая композиция или лекарственный препарат согласно настоящему изобретению».

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить в организм любым подходящим способом, например, пероральным, парентеральным, назальным (через слизистую оболочку) и т.д., типичным образом, парентерально, преимущественно внутримышечно или подкожно. Кроме того, данная фармацевтическая композиция в любой форме, пригодной для ее введения, например, в твердой форме (в виде таблетки, капсулы, гранул и т.д.), в жидкой форме (раствора, суспензии, эмульсии) и т.д., в зависимости от выбранного пути введения указанной композиции. В предпочтительном варианте реализации, указанную фармацевтическую композицию получают в фармацевтической форме для единичного дозирования.

В предпочтительном варианте реализации фармацевтическая композиция может быть представлена в лекарственной форме, для перорального введения в твердом виде, более предпочтительно в жидком виде, наиболее предпочтительно для внутримышечного введения. Примеры фармацевтических форм для введения препарата перорально представляют собой таблетки, капсулы, гранулы, растворы, суспензии и т.д., и могут содержать традиционные наполнители, такие как агглютинаты, разбавители, разрыхляющие вещества, лубриканты, увлажнители и т.д., и могут быть изготовлены обычными способами. В другом предпочтительном варианте реализации фармацевтическая композиция может быть адаптирована для парентерального введения, в виде, например, раствора, суспензии или лиофилизированного, стерильного продукта, в соответствующих лекарственных дозах; в данном случае фармацевтическая композиция будет включать в себя вспомогательные вещества, такие как буферные растворы, поверхностно-активные вещества и т.д. В любом случае, вспомогательные вещества должны быть выбраны, исходя из выбранной формы введения препарата. Обзор различных форм введения лекарств и их подготовка могут быть найдены в книге «Tretise the Galenic Pharmacy", by С.Faull i Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones, приведенная ранее. Кроме того, лекарственная композиция может содержать и другие полипептиды, полинуклеотиды, векторы и клетки, которые будут способствовать более высокой эффективности лекарственного средства.

Определения

Термин «полинуклеотид», при использовании в данном документе, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины и может представлять как ДНК, так и РНК. Этот термин относится исключительно к первичной структуре молекулы. Таким образом, данный термин охватывает как одно- и двуцепочную ДНК, так и одно- и двуцепочную структуру РНК.

Термин «изолированный», встречающийся в описании, при использовании его в сочетании с НсТеТх или с его кодирующей последовательностью, относится не только к тому факту, что вещества выделены из человеческого тела, но также обозначает, что они не являются частью рекомбинантных белков или ферментов, который выполняют терапевтическую функцию.

Под выражением «функциональный фрагмент НсТеТх, его аллельный вариант или кодирующая последовательность» понимается описание пептида или полинуклеотида, которые включают часть НсТеТх, его аллельный вариант и кодирующую его последовательность, которые сохраняют способность действовать в качестве лекарственного средства, в особенности для лечения ALS, а их терапевтический потенциал может быть проверен путем воспроизведения примеров 1-3.

В данном описании термин «аллельный вариант» относится к полипептиду, гомологичному и функционально эквивалентному С-концу тяжелой цепи токсина столбняка. Пептид гомологичен вышеупомянутой области токсина, когда его последовательность аминокислот соответствует последовательности токсина, по меньшей мере, на 60%, 70%, 85%, предпочтительно, на 95%. Предпочтительно, чтобы последовательность кислот указанного окончания токсина представляла собой SEQ ID NO: 2. Этот термин также употребляется в данном описании в отношении полинуклеотида, который кодирует гомологичный полипептид, функционально эквивалентный НсТеТх. В этом случае полинуклеотид может быть гомологичен НсТеТх, по меньшей мере, на 40%, 50%, 60%, 70%, 85% или 90%, последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 1.

Выражение «функционально-эквивалентный» означает, что полипептид или полинуклеотид сохраняет свою функцию лекарственного средства, в частности для лечения ALS, а его терапевтический потенциал можно проверить посредством воспроизведения примеров 1 или 2.

Для специалистов в данной области, преимущества и характеристики изобретения будут ясны из совокупности описания изобретения и практического осуществления настоящего изобретения. Следующие примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения и они не должны рассматриваться, как ограничивающие данное изобретения.

Краткое описание фигур

Фигура 1. ПЦР-амплификация для выявления экспрессии НсТеТх. Через 10 дней после внутримышечной инъекции плазмиды pCMV-HcTeTx (n=2, дорожки 1 и 2) и пустой плазмиды pCMV (n=2, дорожки 3 и 4) из мышцы выделили РНК, и провели обратную-транскрипцию. Полученную кДНК амплифицировали с помощью ПЦР для гена НсТеТх. Дорожка 5 показала положительный контроль (плазмиды pCMV-HcTeTx), на дорожку 6 загрузили продукт реакции, на дорожке М нанесен маркер размером 100 pb.

Фигура 2. Эффект курса лечения незащищенной (чистой) ДНК, кодирующей НсТеТх, при возникновении симптомов заболевания ALS SOD1 G93A у испытуемых мышей. Проявление симптомов заболевания существенно задерживалось у группы, получившей НсТеТх (n=10), по сравнения с контрольной группой (n=10). Суммарная вероятность была рассчитана с применением процедуры Kaplan-Meier Survival Analysis (SPSS 13.0).

Фигура 3. Эффект курса лечения незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх, в отношении выживаемости мышей в модели заболевания ALS SOD1 G93A. Выживаемость значительно увеличилась в группе, проходившей лечение с помощью НсТеТх (n=10), по сравнению с контрольной группой (n=10). Суммарная вероятность была рассчитана с применением процедуры Kaplan-Meier Survival Analysis (SPSS 13.0).

Фигура 4. Эффект курса лечения незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх. Двигательную активность определили при помощи ротатора, вращающегося с постоянной скоростью 14 об/мин, с максимальным временем прохождения препятствия 180 с. Большая двигательная активность наблюдалась в группе, проходившей лечение с помощью НсТеТх (n=10), по сравнению с контрольной группой (n=10).

Фигура 5. Влияние внутримышечных инъекций незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх, на SOD1 G93A мышей. Сила мышц и моторная функция были протестированы с применением подвешенной проволоки. В каждой группе было по 10 мышей (n=10)

Фигура 6. Влияние внутримышечных инъекций незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх, на SOD1 G93A мышей. Изменение веса трансгенных мышей, проходивших лечение с помощью НсТеТх. В каждой группе было по 10 мышей (n=10).

Фигура 7. Анализ экспрессии генов, участвующих в сигнальных путях апоптоза спинного мозга мышей с симптомами SOD1 G93A, возраст которых составлял 110 дней. Приведено среднее содержание информационной РНК для генов Casp1, Casp3, Вах и Bcl2 у контрольной (цель) группы и у группы мышей, проходивших лечение с применением НсТеТх, (серые). Предыдущая группа мышей была сопоставлена с дикими мышами (черные), (n=5 мышей в группе).

Фигура 8. Анализ белков, участвующих в сигнальных путях апоптоза спинного мозга мышей с симптомами SOD1 G93A, возраст которых составлял 110 дней. Western-Blot анализ белков pro-Casp3, активной Casp3, Вах и Bcl2, присутствующих в спинном мозге мышей, проходивших лечение с помощью НсТеТх (серые линии), и контрольной группы мышей (черные линии) в сравнении с дикими мышами (черные) (n=5 мышей в каждой группе).

Фигура 9. Western-Blot анализ фосфолирования в белках Akt и Erk 1/2. Были проанализированы образцы от 5 мышей в каждой группе. IDV (Значение плотности интенсивности). Величины, полученные при Western-Blot анализе, выражены в виде отношения к количеству р-тубулина относительно значений, характерных для мышей дикого типа. (*Р<0.05, **Р<0.01; погрешность отображает SEM). Полосы отражают те же группы, что и в предыдущем примере.

Фигура 10. Влияние внутрибрюшного лечения полипептидом, содержащим С-конец тяжелой цепи токсина столбняка (НсТеТх), на выживаемость мышей ALS SOD1 G93A. Выживаемость значительно увеличилась в группе, проходящей лечение НсТхТе (n=3), по сравнению с контрольной группой (n=3, сплошная линия). Суммарная вероятность была рассчитана с применением процедуры Kaplan-Meier Survival Analysis (SPSS 13.0).

Фигура 11. Внутримышечное лечение мышей, инъецированием НсТеТх, влияет на экспрессию генов, связанную с гомеостазом кальция в спинном мозге трансгенных мышей SOD1 G93A. Были определены уровни экспрессии генов Ncs1 и Rrad у трансгенных мышей с НсТеТх (серый) или с пустой плазмидой (белый). Изменения в уровне информационной РНК у мышей обеих указанных групп были сопоставлены с группой мышей дикого типа (черный). (*Р<0.05, **Р<0.01; погрешность отображает SEM, n=5 мышей в каждой группе).

Подробное описание вариантов реализации настоящего изобретения

Ниже настоящее изобретения иллюстрируется посредством тестов, проведенных авторами, которые демонстрируют эффективность НсТеТх, а так же кодирующей его последовательности в качестве лекарственного средства, в особенности для лечения ALS.

Пример 1

Введение НсТеТх в виде внутримышечной инъекции незащищенной ДНК замедляет проявление симптомов и продлевает продолжительность жизни SOD1 G93A мышей.

Получение трансгенных животных с внедренным человеческим геном супероксиддисмутазы-1 (SOD-1), который содержит различные мутации, послужило моделью для изучения заболевания ALS. У данных животных наблюдают клинические и патологические характеристики аналогичные мышам, которые больны ALS. Лучше всего изучены и охарактеризованы трансгенные мыши SOD1 G93A, которые содержат мутацию фермента SOD-1 в виде замены глицина на аланин в положении 93. Данная животная модель была успешно протестирована с применением различных терапевтических средств. Однако при клинических испытаниях на людях эффективность указанных средств не подтвердилась или по причине неподходящего пути введения препарата и/или ограниченной биодоступности терапевтических молекул к целевым клеткам. Некоторые методики генной терапии включают применение аденоассоциированного вируса (AAV), который ретроградным способом транспортируется к моторным нейронам при помощи внутримышечной инъекции. Однако существует вероятность, что применение вирусов-переносчиков может привести к еще большему ущербу для здоровья у пациентов. Применение незащищенной ДНК является более безопасной и подходящей методикой для осуществления генной терапии у пациентов.

Материалы и методы

1.1. Незащищенная ДНК, кодирующая НсТеТх

Ген, кодирующий НсТеТх (С-конец тяжелой цепи токсина столбняка - SEQ ID NO: 2 из 462 аминокислот), был клонирован в эукариотическую экспрессионную плазмиду pcDNA3.1 (Invitrogen) под контролем промотора цитомегаловируса (ЦМВ). Вектора получали в химически компетентных бактериях Escherichia coli (DH5a) и очищали с применением набора Sigma-Aldrich maxi prep GenElute.

1.2. Трансгенные мыши

Трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют ген SOD1 человека с мутацией G93A (B6SJL-TgN(SOD1-93AJ1 Gur), были получены в Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Гемизиготные мутанты были использованы во всех экспериментах (мутированную мужскую особь скрещивали с не трансгенной женской особью). Трансгенных мышей идентифицировали с помощью ПЦР-амплификации ДНК, извлеченной из хвоста, по методике, описанной в Gurney et al. (Gurney et al., 1994 «Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation», Science, 264 (5166): 1772-5). Животных содержали в Mixed Research Unit университета Сарагоса. Пищу и воду предоставляли без ограничений. Все проведенные эксперименты и процесс ухода за животными были разработаны в соответствии со стандартами университета Сарагоса и международного руководства по использованию лабораторных животных.

1.3. Внутримышечная инъекция незащищенной ДНК и извлечение мышцы

В возрасте 8 недель трансгенным мышам SOD1 G93A внутримышечной инъекцией вводили 300 мг pCMV-HcTeTx в четырехглавые мышцы (2 инъекции по 50 мг в каждую мышцу) и трехглавые мышцы (1 инъекция по 50 мг в каждую мышцу). Контрольной группе ввели аналогичное количество пустой плазмиды. Через 10 дней после инъекций привитые мышцы были извлечены, заморожены жидким азотом, а затем хранились при -70°С.

1.4. Экстракция РНК, синтез кДНК и ПЦР-амплификация

Ткани были заморожены в жидком азоте, а затем растерты в порошок в холодной ступке. Тотальную РНК мышц экстрагировали в соответствии с протоколом TRIzol Reagent (Invitrogen). Для синтеза кДНК был использован комплект SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen), начиная с 1 мг РНК в конечном объеме в 20 мкл. ПЦР-реакции были проведены в окончательном объеме в 20 мкл с 150 мкМ каждого инициатора, 150 нМ dNTPs, 2 мМ de MgCl2, 1X буфера, 0.2U Taq pol и 2 мкл для каждой кДНК, разбавленным в 10 раз для амплификации фрагмента гена НсТеТх. Все ПЦР-реакции проводили в приборе GeneAmp@ Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Тепловые параметры цикла были следующие: инкубация при 94°С в течение 3 минут и 35 циклов при 94°С в течение 30 секунд, 30 секунд при 61°С и 30 секунд при 72°С. Факт амплификации гена НсТеТх наблюдали на агарозном геле, окрашенном 2% бромистым этидием. В качестве прямой и обратной последовательности инициатора были использованы SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно. Ампликон имел размер 355 пн.

1.5. Ротатор-тест, тест с решеткой и тест на выживание.

Тест с решеткой был использован для определения мышечной силы и начала проявления симптомов ALS. Животные проходили этот тест один раз в неделю, начиная с 8-недельного возраста. Каждую мышь помещали на решетку, которая использовалась в качестве крышки для обычной клетки. Затем решетку поворачивали на 180° и поддерживалась на расстоянии 60 см от мягкой поверхности во избежание травм. У каждой мыши было три попытки удержаться на перевернутой решетке в течение максимум 180 секунд, лучшее время было записано.

Ротатор тест был использован для оценки координации движений, силы и возможности удерживать равновесие. Животные были помешены на вращающийся стержень прибора (ROTA-ROD/RS, LE8200, LSI-LETICA Scientific Instruments). Было записано время, в течение которого животное может удерживаться на стержне при постоянной скорости вращения 14 об/мин. У каждой маши было три попытки, и лучше время, в течение которого животное оставалось на стержне, было записано, лимит времени был произвольным образом выбран в 180 секунд.

Окончательным этапом в жизни мыши считали ее неспособность перевернуться со спины, когда ее помещали в это положение.

Результаты

2.1 Обнаружение экспрессии плазмиды в мышцах

Первоначально, подтвердили способность сконструированного pCMV-HcTeTx экспрессировать кодирующий ген в мышечных клетках трансгенных мышей SOD1 G93A. Поскольку эндогенная экспрессия гена НсТеТх у этих мышей отсутствует, проводили ПЦР-амплификацию фрагмента гена, который был введен в мышцы посредствам инъекции с целью обнаружения экспрессии мРНК данной молекулы. Как показано на фигуре 1, экспрессию гена НсТеТх не наблюдали в контрольной группе с пустыми плазмидами. ПЦР анализ показал наличие амплификации гена НсТеТх в мышцах, инокулированным кодирующим его вектором, это означает, что вектор успешно достиг мышечных клеток, произошел процесс транскрипции данного гена.

2.2 НсТеТх задерживает появление симптомов, повышает моторную активность и увеличивает выживаемость трансгенных SOD1 G93A мышей.

Внутримышечное лечение незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх, приводило к задержке проявления симптомов, улучшало двигательную активность и отсрочивало гибель мышей, с мутацией G93A гена SOD1 человека, которые служили моделью для ALS. Проявление симптомов диагностировали в первый день, когда мыши не могли удержаться на перевернутой решетке в течение трех минут. Время проявление симптомов значительно увеличилось, примерно до 8 дней, у группы, инъецированной НсТеТх, по сравнению с контрольной группой (фигура 2, таблица 1). Как видно из фигуры 3 и таблицы 1, максимум выживания наблюдали у мышей группы, инъецированной НсТеТх, и в среднем достигал 136 дней, на 16 дней больше, чем у контрольной группы. В период 12-13 недели у контрольной группы было замечено значительное снижение активности на вращающемся стержне, а у проходившей лечении группы снижение активности не наблюдали до 16-той недели.

	Control (контрольная группа) (n=10)	НсТеТх (трансгенные особи) (n=10)	P Value
Начало проявления симптомов (дни)	102.4±2.4	110.9±2.0	0.0295
Летальный исход (дни)	120.5±3.9	136.0±3	0.0093
Ухудшение моторной функции (дни)	18.1	25.1

Таблица 1. В таблице приведены данные, касающиеся начала проявления симптомов заболевания, выживаемости животных, как для контрольной группы мышей, так и для проходившей лечение группы, а также Р-значение (Log Rank, Mantel-Cox).

Эффективность лечения также проверили на мышах, начиная с 8-недельного возраста, при помощи теста «подвешенного шнура» (фигура 5). На 14-той неделе SOD1G93A мыши показали первые признаки слабости, а группа мышей с НсТеТх оказалась сильнее на 14-16 неделях. Кроме того, контрольная группа мышей начала терять вес на 14-той неделе, что было связано с развитием заболевания. При этом, лечение НсТеТх препятствовало потере веса, данная группа мышей показала максимальный вес на 15 неделе (фигура 6).

Пример 2.

Ингибирование апоптоза в спинном мозге мышей SOD1 G93A при помощи инъекции незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх. Материалы и методы

1.1 Незащищенная ДНК, кодирующая НсТеТх

Ген, кодирующий НсТеТх (С-конец тяжелой цепи токсина столбняка - SEQ ID NO: 1), был клонирован в эукариотическую экспрессионную плазмиду pcDNA3.1 (Invitrogen) под контролем промотора цитомегаловируса (ЦМВ). Вектора получали в химически компетентных бактериях Escherichia coli (DH5a) и очищали с применением набора Sigma-Aldrich maxi prep GenElute.

1.2 Трансгенные мыши

Трансгенные мыши, которые сверх экспрессировали ген SOD1 с мутацией G93A (B6SJL-TgN(SOD1-93AJ1 Gur), были получены от Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Во всех экспериментах использовали гемизиготные мутанты (мужскую мутированную особь скрещивали с нетрансгенной женской особью). Трансгенных мышей определяли с помощью ПЦР-амплификации ДНК, извлеченной из хвоста, по методике, описанной в Gurney et al. (Gurney et al., 1994 «Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation», Science, 264 (5166): 1772-5). Животных содержали в Mixed Research Unit университета Сарагоса. Пищу и воду давали без ограничений. Все проведенные эксперименты и процесс ухода за животными были разработаны в соответствии со стандартами университета Сарагоса и международного руководства по использованию лабораторных животных. В общей сложности было использовано 12 животных: дикие мыши (n=5), мыши SOD1G93Ac pcDNA3.1 (n=5), и мыши SOD1G93A мыши, проходящие лечение с применением НсТеТх.

1.3 Внутримышечная инъекция незащищенной ДНК и извлечение спинного мозга

В возрасте 8 недель трансгенным мышам SOD1 G93A внутримышечной инъекцией ввели 300 мг pCMV-HcTeTx в четырехглавые мышцы (2 инъекции по 50 мг в каждую мышцу) и трехглавые мышцы (1 инъекция по 50 мг в каждую мышцу). Контрольной группе ввели аналогичное количество пустых плазмид.

Через 110 дней после инъекций привитые извлекали спинной мозг замораживали жидким азотом, а затем хранили при -70°С. Ткани были заморожены в жидком азоте, а затем растерты в порошок в холодной посуде. Половину образцов использовали для извлечения РНК, а другую половину для экстракции белка.

1.4 Экстракция РНК из спинного мозга и синтез кДНК.

Суммарную РНК из спинного мозга экстрагировали в соответствие с протоколом RNeasy@ Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen). Для синтеза кДНК был использован SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen) комплект, начиная с 1 мг РНК в конечный объем 20 мл.

1.5 ПЦР в режиме реального времени

ПЦР-реакции в режиме реального времени были проведены в окончательном объеме 10 мкл при помощи 1Х of TaqMan@ Universal PCR Master Mix, No AmpErase@ UNG (Applied Biosystems), 1Х смесь не маркированного инициатора и TaqMan@ MGB (Applied Biosystems) зондов для каждого гена и 1 мкл на одну кДНК реакцию, разбавленную в 10 раз. Для стандартизации использовали 3 эндогенных гена (18s rRNA, GAPDH and .-actin). Обозначения для используемых смесей инициатора и зондов, предназначенных для амплификации каждого изучаемого гена, был следующими: caspasa-3 (Mm00438023_m1), caspasa-1 (Mm00438023_m1), NCS-1 (Mm00490552_m1), Rrad (Mm00451 053_m1), 18s rRNA (Hs99999901), GAPDH (4352932E) and (S-actin (4352933E). Все ПЦР-реакции проводили по тепловому циклу ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Тепловые параметры цикла следующие: инкубация при 94°С в течение 10 минут, 40 циклов при 94°С в течение 15 секунд и при 60°С по 1 секунде. Экспрессию нормировали по отношению к caspase-3, caspase-1, NCS-1 и Rrad путем применения среднего геометрического трех эндогенных генов.

1.6 Экстракция белка из спинного мозги и Western Blot анализ.

Образцы спинного мозга мышей дикого типа и мышей SOD1 G93A, проходивших лечение при помощи НсТеТх, были гомогенизированы в жидком азоте с экстрактивным буферным раствором следующего состава: 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl pH=7,5, 1% дезоксиколата, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1 мМ NaOVa, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 г/мл леупептина и апротинина и 1 мг/мл пепстатина. Смесь центрифугировали при 4°С в течение 10 минут при 3000 д. Далее определяли количество белка, сконцентрированного из супернатанта каждой пробы, при помощи способа ВСА (9643 Sigma). 25 мг белка было загружено в 10% акриламидный гель. Для процесса переноса использовали поливинилиденфторидные мембраны, которые блокировали с помощью TTBS раствора с 5% обезжиренного молока (20 мМ Tris base, 0.15М NaCl, pH=7.5, 0.1% Tween) в течение часа. Позже мембраны инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4°С (antip-Akt (sc-7985R, Santa Cruz)). После инкубационного периода первичные антитела и мембраны промывали TTBS и инкубировали вместе с вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре. На последнем этапе белки были визуализированы при помощи химической люминесценции (Western Blotting Luminol Reagent, sc-2048 Santa Cruz). Пленки были отсканированы и проанализированы с помощью программного обеспечения AlphaEase FC (Bonsai Technologies). Статистический анализ был проведен с применением ANOVA теста и Student-Neuman-Keuls теста.

Результаты

В данной работе представлены результаты применения НсТеТх для мышей SOD1 G93A, служащих моделью для ALS, у которых наблюдают дегенерацию двигательных нейронов. Результаты исследования транскрипции в спинном мозге мышей в симптоматической стадии представлены на фигуре 7. Сравнение транскрипционной регуляции генов caspase-1, caspase-3, Bax and Bcl2, вовлеченных в апоптоз клеток спинного мозга в конце симптоматической стадии (в возрасте 110 дней), диких мышей и у мышей SOD1 G93A показало значительную индукцию генов caspase-1 (Р<0.05), caspase-3 (Р<0.05) и Bcl2 (Р<0.01), но не было никакого существенного различия в профиле гена контрольной группы мышей SOD1 G93A по сравнению с группой мышей дикого типа (фигура 7). В группе мышей, получившей лечение НсТеТх, уровень экспрессии генов caspase-1 and caspase-3 был равен уровню мышей дикого типа, а существенные различия были отмечены только при сравнении с группой, не проходившей лечение (Р<0.05 and P<0.01, соответственно). Однако лечение net не повлияло на экспрессию генов Bax и Bcl2 (Р>0.05) в спинном мозге трансгенных мышей (Фигура 7).

Для оценки действия НсТеТх на механизмы, которые обращает процесс апоптоз, вызывающий смерть клеток спинного мозга мышей SOD1 G93A провели исследование белка. Данные показали, что активация гена caspase-3 (P<0.05) заметно уменьшалась у мышей, которым вводили НсТеТх, по сравнению с контрольной группой, достигнув уровня мышей дикого типа, в то время как уровень белка pro-caspase-3 у трансгенных мышей не изменялись. В отличие от результатов анализа экспрессии согласно способом Western-Blot, было отмечено, что количество белков Вах и Bcl2 было ниже у мышей, инъецированных НсТеТх (фигура 8).

Один из способов действия НсТеТх - это фосфорилирование Akt (Gil et al., 2003. Biochem J. 373:613-620), протеинкиназы, которая активизируется различными факторами роста, участвующими в блокировке путей, опосредуемых фосфатидилинозитол-3-киназой. Денситометрический количественный анализ показал, что у животных, получивших НсТеТх, уровень Akt фосфорилированной по Ser473 был более чем в два раза выше, чем у инъецированной пустым переносчиком группы (Р<0.05), при исследовании способом Western-Blot, при котором использовали фосфор-специфичные антитела (фигура 9). Эквимолярная нагрузка белков была подтверждена при использовании антител против тубулина. Фосфорилирование ERK1/2 по НсТеТх было показано ранее в культивируемых нейронах коры мозга (Gil et al., 2003. Biochem J. 373:613-620). Для подтверждения участия НсТеТх в пути MAP киназы был проведен анализ Western-Blot экстракта спинного мозга SOD1 G93A мышей, как подвергавшихся лечению, так и не подвергавшихся, в возрасте 110 дней. Результат показал растущую активацию ERK ¹/₂ у контрольной группы мышей по сравнению с группой, получавшей НсТеТх, при этом уровень экспрессии соответствовал уровню у мышей дикого типа.

Пример 3

Выживаемость SOD1 G93A мышей увеличилась после внутрибрюшного введения полипептида, включающего С-конец тяжелой цепи токсина столбняка (НсТеТх).

Материалы и методы

1.1 Экстракция полипептида, включающего С-конец тяжелой цепи токсина столбняка (НсТеТх).

Используемый полипептид (НсТеТх) соответствует С-концу тяжелой цепи токсина столбняка и содерж