Пептидные аналоги альфа-меланоцитстимулирующего гормона

Пептидные аналоги альфа-меланоцитстимулирующего гормона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к пептидным аналогам. В частности, изобретение относится к пептидным аналогам природного альфа-меланоцитстимулирующего гормона (α-MSH), селективным в отношении рецептора меланокортина 1 (MC1R), к фармацевтическим препаратам, а также к применению этих аналогов для лечения заболеваний в медицине и ветеринарии.

Предшествующий уровень техники

Нейропептиды представляют собой небольшие биологически активные пептиды, которые широко распространены в организме и выполняют функции от нейромедиаторов до факторов роста. Многочисленные данные указывают на то, что нейропептиды обладают противовоспалительными свойствами. Одним из представителей множества нейропептидов являются меланокортиновые пептиды (меланокортины), которые связываются с рецепторами меланокортина (MC) и стимулируют их. Примером меланокортина служит α-меланоцитстимулирующий гормон (α-MSH), известный, в основном, благодаря своей способности регулировать внешнюю пигментацию; известно также, что он обладает противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами. Нейропептид α-MSH был обнаружен в некоторых органах и вырабатывается нейронами, гипофизом, кишечником, кожей и иммунными клетками.

Иммуномодулирующие способности α-MSH были показаны на моделях контактной гиперчувствительности, где гаптенспецифическая толерантность была вызвана инъекцией α-MSH, и при подавлении воспаления, опосредованного бактериальным эндотоксином. Было показано также, что α-MSH имеет терапевтическую активность на многих животных моделях заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника, артриты и экспериментальная пересадка сердца. Другие животные модели воспаления мозга, повреждения почек и воспаления печени показали противовоспалительные эффекты, связанные с этим нейропептидом. α-MSH подавляет выработку провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-6 и IL-1, и ингибирует хемокины, что снижает миграцию макрофагов и нейтрофилов к участкам воспаления. Оксид азота (NO) является общим медиатором для различных форм воспаления. Показано также, что синтез NO эндотоксин-стимулированными макрофагами и нейтрофилами ингибируется α-MSH. Кроме воздействия на выработку цитокинов, α-MSH снижает экспрессию MHC класса I, CD86 и CD40 моноцитов и дендритных клеток, что влияет на презентацию антигена и ко-стимуляцию. Известно также, что α-MSH усиливает образование интерлейкина 10 (IL-10) моноцитами, что, как полагают, является важным компонентом иммуносупрессивных воздействий.

Хотя молекулярные механизмы иммуномодулирующих эффектов α-MSH до конца неясны, возможный механизм действия α-MSH заключается в его способности ингибировать активацию ядерного фактора-κB в клетках. Ингибирование NF-κB приводит к подавлению выработки провоспалительных цитокинов и синтеза оксида азота макрофагами. α-MSH действует путем связывания со специфическими рецепторами, которые относятся к группе сопряженных с G-белком рецепторов с семью трансмембранными доменами. Эти рецепторы содержат рецепторы меланокортина 1 и меланокортина 3 (MCR-1 и MCR-3) на макрофагах, посредством связывания с которыми α-MSH ингибирует NF-κB. Многие из иммуномодулирующих эффектов α-MSH опосредуются также через накопление цАМФ. Связывание α-MSH с меланокортиновыми рецепторами увеличивает уровни цАМФ, что может подавлять деградацию IκB и, таким образом, ингибировать транслокацию NF-κB и выработку оксида азота.

Рецепторы MC1, с которыми связывается и которые стимулирует α-MSH, вовлечены в различные типы противовоспалительного и иммуномодулирующего ответа. Обнаружены пять типов меланокортиновых рецепторов, MC1-MC5. MC1-рецепторы обнаружены на меланоцитах, клетках меланомы, макрофагах, нейтрофилах, клетках глиомы, астроцитах, моноцитах, эндотелиальных клетках, в определенных областях мозга, яичках и яичниках. Существует постоянный интерес в получении соединений и разработке способов стимуляции MC1-рецепторов и индукции эффективного противовоспалительного и иммуномодулирующего ответа.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к по существу чистому соединению, которое селективно связывается с рецептором меланокортина 1 (MC1R); указанное соединение содержит основной тетрапептид с последовательностью His Xaa₁ Arg Trp (SEQ ID NO:1) или D-Trp D-Arg Xaa₂ D-His (SEQ ID NO:2); где Xaa₁ представляет собой D-Cha, D-Phe или Cha, и Xaa₂ представляет собой D-Cha, D-Phe или Phe; или его фармацевтически приемлемой соли. В некоторых вариантах осуществления C-концевая последовательность представляет собой D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO:3).

Настоящее изобретение также относится к по существу чистому соединению, которое селективно связывается с рецептором меланокортина 1 (MC1R); указанное соединение содержит полипептид с последовательностью:

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃,

где Xaa₁ представляет собой D-Val, D-Ala или D-Lys;

Xaa₂ представляет собой D-Pro, D-Ala или D-Lys;

Xaa₃ представляет собой D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala или D-Lys;

Xaa₄ представляет собой Gly или D-Ala;

Xaa₅ представляет собой D-Trp, Trp, D-3-бензотиенил-Ala, D-5-гидрокси-Trp, D-5-метокси-Trp, D-Phe или D-Ala;

Xaa₆ представляет собой D-Arg, D-His или D-Ala;

Xaa₇ представляет собой D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-фтор-Phg, D-3-пиридил-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-нитро-Phe или D-Ala;

Xaa₈ представляет собой D-His, His, D-Arg, Phe или D-Ala;

Xaa₉ представляет собой D-Glu, D-Asp, D-цитруллин, D-Ser или D-Ala;

Xaa₁₀ представляет собой D-Met, D-бутионин, D-Ile или D-Ala;

Xaa₁₁ представляет собой D-Ser, D-Ile или D-Ala;

Xaa₁₂ представляет собой D-Tyr, D-Ser или D-Ala;

Xaa₁₃ представляет собой D-Ser или D-Ala;

где не более, чем один Xaa_1-13 представляет собой D-Ala, за исключением, когда все Xaa_1-3 представляют собой D-Ala, и не более, чем один Xaa_1-3 представляет собой L-аминокислоту;

или к его фармацевтически приемлемой соли.

Еще в одном из аспектов настоящее изобретение относится к по существу чистому соединению, содержащему полипептид с последовательностью:

D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO:4);

D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO:5);

Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO: 6); или

D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser (SEQ ID NO:7);

или к его фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды по изобретению являются пегилированными.

В некоторых вариантах осуществления соединения по изобретению могут быть конъюгированы с биологически активной частью.

В некоторых вариантах осуществления соединения по изобретению селективно связываются с MC1R. В некоторых вариантах осуществления соединения обладают, по меньшей мере, одним из следующих свойств: способностью селективно активировать MC1R, стабильностью в плазме in vitro и устойчивостью к деградации протеазами.

В одном из аспектов изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит любое по существу чистое соединение по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения аутоиммунных заболеваний или состояний у пациента, содержащему введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый эксципиент и терапевтически эффективное количество соединения по изобретению. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза, сахарного диабета типа 1, апластической анемии, болезни Грейвза, целиакии, болезни Крона, волчанки, артрита, остеоартрита, аутоиммунного увеита и миастении гравис.

Еще в одном из аспектов изобретение относится к способу лечения воспаления у пациента, содержащему введение указанному пациенту фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый эксципиент и терапевтически эффективное количество соединения по изобретению. В некоторых вариантах осуществления воспаление связано с заболеванием, выбранным из группы, которая состоит из воспалительного заболевания кишечника, ревматоидного артрита, аллергии, атеросклероза, псориаза, гастрита и ишемической болезни сердца.

В одном из аспектов изобретение относится к способу уменьшения или замедления отторжения трансплантата у пациента, содержащему введение указанному пациенту фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый эксципиент и терапевтически эффективное количество соединения по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения меланомы у пациента, содержащему введение указанному пациенту фармацевтического препарата, содержащего фармацевтически приемлемый эксципиент и терапевтически эффективное количество соединения по изобретению.

Еще в одном из аспектов изобретение относится к способу лечения меланомы у пациента, содержащему введение указанному пациенту фармацевтического препарата, содержащего фармацевтически приемлемый эксципиент и терапевтически эффективное количество соединения по изобретению, которое конъюгировано с противоопухолевой полезной нагрузкой. Противоопухолевая полезная нагрузка может быть радионуклидом, радиосенсибилизирующим веществом, фотосенсибилизирующим веществом, химиотерапевтическим средством или токсином.

В дополнительном аспекте изобретение предлагает набор, содержащий фармацевтическую композицию соединения по изобретению, и, необязательно, инструкцию по применению.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показано уменьшение увеита под действием нативного α-MSH. На фиг.1A показаны данные мышей B10.RIII, которым ежедневно внутривенно вводили нативный α-MSH (100 мкг/мышь), когда их клинические показатели были 2-3. Увеит достоверно уменьшился по сравнению с контролем (p<0,01), не получавшими лечения. На фиг.1B показаны данные мышей B10.RIII, которым ежедневно внутрибрюшинно вводили нативный α-MSH (100 мкг/мышь) или дексаметазон (0,2 мг/кг или 2,0 мг/кг), когда их клинические показатели были 1-2 (n=5). Воспаление сетчатки уменьшилось после начала лечения (p<0,05). Звездочкой отмечены достоверные различия с контролем.

На фиг.2 проиллюстрировано улучшение увеита на поздних стадиях заболевания под действием RI α-MSH и нативного α-MSH. EAU индуцировали у мышей B10.RIII, и с 12 дня, когда у мышей развивалась поздняя стадия заболевания (показатели 3), им ежедневно внутривенно вводили нативный α-MSH, RI α-MSH или PBS в дозе 100 мкг/мышь. На фиг.2A показаны данные мышей, которым вводили нативный α-MSH или ретро-RI α-MSH и которые указывают на уменьшение глазных показателей при увеите по сравнению с контрольными мышами с PBS. На фиг.2B показаны индивидуальные максимальные глазные показатели у мышей в каждой группе на 16 день после индукции EAU (n=8). Звездочкой отмечены достоверные различия между группами (p<0,05).

На фиг.3 показаны изображения сетчатки и индивидуальные глазные показатели животных, которым вводили α-MSH или RI α-MSH. EAU индуцировали у мышей B10.RIII, и, начиная с 13-го дня, когда мыши достигали поздней стадии заболевания, проводили ежедневное внутривенное введение нативного α-MSH, RI α-MSH или PBS в дозе 100 мкг/мышь. Показаны фундоскопические изображения сетчатки, отражающие средние величины глазных показателей каждой группы после 13-ти дней лечения (n=11). У мыши, которая получала PBS, с глазным показателем 3, были отмечены воспалительные бляшки в нескольких квадрантах глаза и васкулит рядом с оптическим нервом (фиг.3A). Мыши, которые получали α-MSH и RI α-MSH, с глазными показателями 1, показывают разрешение увеита с воспалением только вокруг оптического нерва (фиг.3B и 3C, соответственно). Сетчатки отражают среднюю величину глазного показателя для каждой группы. Индивидуальные глазные показатели мышей из каждой группы на 13-й день лечения представлены на графике. Звездочкой отмечены достоверные различия между группами (p<0,01).

На фиг.4 проиллюстрирована гистопатология мышей с EAU, которые получали RI α-MSH и нативный α-MSH. Самкам B10.RIII мышей делали инъекцию IRBP+CFA для того, чтобы индуцировать EAU. Когда у мышей глазные показатели достигали 3, их ежедневно внутривенно вводили ретроинверсо α-MSH, нативным α-MSH или PBS в дозе 100 мкг/мышь. Группа мышей, которая получала RI α-MSH или α-MSH, показала снижение глазных воспалительных реакций (p<0,05). На фотографии показаны глаза, окрашенные гематоксилином и эозином, через 10 дней после начала лечения, и отражены средние величины глазных показателей групп мышей, которые получали PBS (фиг.4A), α-MSH (фиг.4B) и RI α-MSH (фиг.4C). Увеличение в 100 раз.

На фиг.5 показано действие на увеит ежедневной дозы ретроинверсо α-MSH, вводимой внутрибрюшинно, по сравнению с контрольным скремблированным пептидом. Мышам B10.RIII, начиная с 11 дня с начала индукции заболевания, ежедневно вводили посредством внутрибрюшинных инъекций, содержащих 100 мкг RI α-MSH или скремблированного D-аминокислотного пептидного контроля. Данные демонстрируют клинические средние глазные показатели групп мышей, которые получали RI α-MSH (n=4) и скремблированным контрольным пептидом (n=5). Мыши получали лечение в течение 13 дней. Представлены данные двух экспериментов. Звездочкой отмечены достоверные различия между группами (p<0,04).

На фиг.6 проиллюстрирована эффективность RI α-MSH при лечении воспаления сетчатки. Мышам B10.RIII ежедневно вводили посредством внутрибрюшинных инъекций RI α-MSH (3, 10 или 100 мкг/мышь), если их клинические показатели были 4. Скремблированный пептидный контроль вводили инъекцией в дозе 100 мкг/мышь ежедневно. График отображает клинические показатели в динамике по времени. Наблюдали уменьшение воспаления сетчатки после начала лечения дозой 100 или 10 мкг/мышь. Ограниченный благоприятный клинический ответ наблюдали у мышей, которым вводили низкие дозы RI α-MSH (3 мкг/мышь) или PBS или контрольный скремблированный пептид (n=4). Звездочкой отмечены достоверные различия между группами (p<0,05).

На фиг.7 показано влияние RI α-MSH на выработку цАМФ в клетках меланомы мыши. цАМФ измеряли в клетках меланомы B16-F1 после воздействия на клетки нативным α-MSH, ретроинверсо α-MSH или скремблированным контрольным пептидом в концентрациях 0,01-1000 нг/мл. На фиг.7A показано, что как нативный α-MSH, так и RI α-MSH значительно увеличивают уровни цАМФ. В качестве контроля для оценки измерения цАМФ использовали форсколин в концентрации 100 мкМ. На фиг.7B показаны данные аланинового сканирования. Аланинзамещенные пептиды RI α-MSH в концентрации 1 мкг/мл были проверены на увеличение уровней цАМФ на клеточной линии меланомы мыши B16-F1. Представлены данные двух экспериментов. Список последовательностей можно найти в таблице 1. Звездочкой отмечены достоверные различия между группами (p<0,01).

На фиг.8 проиллюстрировано течение EAE, вызванного MOG. EAE индуцировали у мышей C57BL/6 путем введения инъекций пептида MOG35-55 (200 мкг/мышь) и эмульсии CFA. Инъекцию токсина коклюша делали на 0 день и 2-й день. На 10-й день начинали ежедневное лечение α-MSH, RI α-MSH или PBS, внутрибрюшинно, дозами 100 мкг/мышь. На фиг.8A показаны клинические показатели заболевания, которые записывались ежедневно. На фиг.8B показаны индивидуальные показатели заболевания в каждой группе на 20-й день после индукции заболевания.

На фиг.9 показано снижение средних показателей EAE под влиянием RI α-MSH. EAE индуцировали у мышей C57BL/6 путем введения инъекций пептида MOG35-55 (200 мкг/мышь) и эмульсии CFA. Инъекцию токсина коклюша делали на 0 день и 2-й день. На 10-й день начинали ежедневное лечение дозами 100 мкг или 30 мкг/мышь α-MSH или RI α-MSH, 2 мг/кг дексаметазона, или PBS, внутрибрюшинно. Клинические показатели заболевания записывали ежедневно.

На фиг.10 показана гистология спинного мозга мышей, которым вводили RI α-MSH. EAE индуцировали у мышей C57BL/6 путем введения инъекций пептида MOG35-55 (200 мкг/мышь) и эмульсии CFA. Инъекцию токсина коклюша делали на 0 день и 2-й день. На 10-й день начинали ежедневное введение RI α-MSH в дозе 100 мкг/мышь, внутрибрюшинно. Спинной мозг собирали на 24-й день после индуцирования заболевания. Показаны две типичные мыши из каждой группы: которые получали PBS (фиг.10a и 10c) и которые получали RI α-MSH (фиг.10b и 10d). Стрелки показывают участки инфильтрации воспалительными клетками.

На фиг.11 показано количество мРНК TNFα и IL-10 в селезенке мышей, сенсибилизированных пептидом MOG, в течение стадии заболевания EAE. Мышей сенсибилизировали 200 мкг пептида MOG на 0 день и им вводили PBS, α-MSH (100 мкг) или RI α-MSH (100 мкг) ежедневно в дни 10-15. Селезенки собирали на 1 (фиг.11a и 11b), 4 (фиг.11с и 11d) и 7 (фиг.11e и 11f) дни после начала лечения и исследовали экспрессию мРНК TNFα и IL-10 с помощью количественной ПЦР. Данные показывают среднее значение для 4-х мышей в каждой из групп. Уровни РНК нормализованы по β-актину.

На фиг.12 проиллюстрирован вторичный иммунный ответ на пептид MOG 35-55. Мышей сенсибилизировали 200 мкг пептида MOG35-55 на 0 день. На 2-8 день мышам вводили путем инъекции внутрибрюшинно PBS, 100 мкг α-MSH или 100 мкг RI α-MSH (n=5). На 9-й день собирали клетки селезенки (фиг.12a) и лимфоузла (фиг.12b) и стимулировали 25 мкг/мл пептида MOG35-55 или пептида OVA in vitro. Клетки в культуре метили [³H]-тимидином на 3-й день. Данные представлены в виде среднего±SD. Через 24 часа собирали супернатант из культуры клеток селезенки, стимулированных пептидом MOG, и измеряли уровни цитокинов TNF-α, IFNγ (фиг.12c) и MCP-1 (фиг.12d) с помощью проточной цитометрии. Данные представлены в виде среднего±SD. Наивных мышей не сенсибилизировали пептидом MOG.

На фиг.13 проиллюстрированы цитокиновые профили в сыворотке и селезенке после введения RI α-MSH мышам, сенсибилизированных MOG. Мышей сенсибилизировали 200 мкг пептидом MOG35-55 на 0 день. На 2-8 день мышам вводили путем инъекции внутрибрюшинно PBS, 100 мкг α-MSH или 100 мкг RI α-MSH (n=5). На 9-й день собирали селезенки и сыворотки. На фиг.13a и 13b показаны уровни мРНК TNF-α и IL-10, соответственно, в селезенке, измеренные методом ПЦР в реальном времени. Данные показывают среднее значение для 4-х мышей в каждой из групп. Уровни РНК нормализованы по β-актину. Сыворотку также исследовали на уровни цитокинов методом проточной цитометрии. На фиг.13c показаны уровни TNF-α, MCP-1, IL-6 в сыворотке, и на фиг.13d показаны уровни IL-10 и IL-12 в сыворотке. Наивных мышей не сенсибилизировали пептидом MOG. Данные показаны в виде среднего±SD.

На фиг.14 показано влияние α-MSH и RI α-MSH на маркеры макрофагов. Мышей сенсибилизировали пептидом MOG in vivo и им вводили ежедневно α-MSH или RI α-MSH (100 мкг/мышь) на 1-7 день. Селезеночные макрофаги анализировали методом проточной цитометрии для измерения уровней экспрессии CD14, CD40 и CD86. Проводили селекцию клеточной популяции макрофагов по CD11b⁺ (фиг.14a) или F4/80⁺ (фиг.14b) клеткам. Данные показывают средний процент позитивных клеток в популяции макрофагов, прошедших селекцию (n=5).

На фиг.15 показано индуцированное LPS увеличение уровней мРНК mMC1R в перитонеальных макрофагах (фиг.15a) и селезенке (фиг.15b). Мышам C57BL/6 (n=4) делали внутрибрюшинные инъекции LPS (1 мкг/мышь). Перитонеальные макрофаги и селезенки собирали через 0,5 ч, 1 ч и 24 ч. Уровни мРНК mMC1R измеряли ПЦР в реальном времени. Уровни РНК были нормализованы по 18s.

На фиг.16 показано действие MSH на модели воспаления, индуцированного LPS in vivo. Мышам C57BL/6 делали внутрибрюшинные инъекции 1 мкг LPS. Через 30 мин мышей внутрибрюшинно лечили дексаметазоном (2 мг/кг) и α-MSH (фиг.16a-16c) или аналогом RI α-MSH 891 (фиг.16d-16f). Собирали сыворотки через 2 часа после стимуляции LPS. Уровни TNF-α (фиг.16a и 16d), MCP-1 (фиг.16b и 16e) и IL-10 (фиг.16c и 16f) измеряли с помощью цитометрического анализа на гранулах методом проточной цитометрии. Данные показывают индивидуальные измерения цитокинов и среднее для каждой группы (n=6).

На фиг.17 показана стабильность RI-α-MSH и α-MSH в плазме и сыворотке. На фиг.17A показана стабильность пептидов RI-α-MSH и α-MSH в плазме и PBS при 37ºC. На фиг.17B показано время полужизни в сыворотке пептидов RI-α-MSH и α-MSH после единичной внутривенной инъекции.

На фиг.18 показаны результаты исследования связывания MSH (фиг.18A) и RI-MSH (фиг.18B) с рецепторами меланокортина 1, 3, 4 и 5.

На фиг.19 показана инверсия основного тетрапептида HfRW и ретроинверсо MSH.

На фиг.20 проиллюстрировано замещение неприродных аминокислотных остатков в различных позициях RI-MSH.

На фиг.21 проиллюстрирован типичный анализ конкурентного связывания RI-MSH и его вариантов с MC1R.

На фиг.22 проиллюстрировано влияние аналогов RI α-MSH на уровни цАМФ в клетках меланомы мыши B16 F1. Фиг.22A: аналоги 890, 891 и 892; фиг.22B: аналоги 893, 894 и 895; фиг.22C: аналоги 880, 886 и 878; и фиг.22D: аналоги 872, 878 и 869.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Белки α-MSH и MC1R и нуклеиновые в соответствии с настоящими способами не ограничиваются определенным источником или видами. Так, белки и нуклеиновые кислоты могут быть выделенными или рекомбинантными.

α-меланоцитстимулирующий гормон (α-MSH) представляет собой полипептид с последовательностью Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO:8) (SYSMEHFRWGKPV). В настоящее время исследуются противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства α-MSH. α-MSH образуется при внутриклеточном протеолитическом расщеплении пропиомеланокортинового гормона (POMC). α-MSH нейропептид обнаруживается в нескольких органах и вырабатывается нейронами, гипофизом, кишечником, кожей и иммунными клетками. Сообщалось о том, что α-MSH подавляет эффекторные функции T-клеток, индуцирует регуляторные T-клетки и проявляет положительное воздействие на аутоиммунных и трансплантационных моделях.

"Конъюгат" или "конъюгированный" содержит два или более элементов, которые присоединены, соединены, спарены, образуют комплекс или другим образом ассоциированы друг с другом. Элементы могут быть присоединены друг к другу посредством ковалентных связей, ионных связей, электростатических взаимодействий, водородных связей, ван-дер-ваальсовых взаимодействий или физическими способами.

"Биологически активные" части содержат молекулу или соединение, которое вызывает или регулирует физиологический ответ. В одном из аспектов биологически активное соединение стимулирует рецепторы меланокортина, предпочтительно MC1-рецепторы.

Под "модулировать" и "модуляция" подразумевается, что активность одного или нескольких белков или белковых субъединиц усиливается или подавляется, таким образом, что экспрессия, уровень или активность больше или меньше, чем наблюдаемая в отсутствие регулятора. Например, термин "модулировать" может означать "ингибировать" или "стимулировать".

"C-концевая последовательность" относится к концу аминокислотной цепи, которая заканчивается обычно, но не обязательно, карбоксильной группой. Правило для записи пептидной последовательности состоит в том, чтобы поместить C-конец справа и писать последовательность от N- к C-концу. C-концевая последовательность может содержать от 1 до 100 аминокислот, предпочтительно, от 2 до 15 аминокислот, и даже более предпочтительно, от 3 до 10 аминокислот. C-концевая последовательность может оканчиваться карбоксильной группой, или конец может быть модифицирован хорошо известными в данной области способами содержания функциональных элементов (например, нацеливающей группы, сигнала задержки, липида и анкора).

Настоящее изобретение относится к "по существу чистому соединению". Термин "по существу чистое соединение" используют в настоящем документе для описания молекулы, такой как полипептид (например, полипептид, который связывает MC1R, или его фрагмент), который по существу свободен от других белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот и других биологических материалов, с которыми он связан в природе. Например, по существу чистая молекула, такая как полипептид, может быть, по меньшей мере, на 60%, по массе сухого вещества, интересующей молекулой. Чистоту полипептидов можно определить стандартными способами, содержащими, например, электрофорез в полиакриламидном геле (например, SDS-PAGE), хроматографию на колонках (например, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ)) и анализ аминоконцевой аминокислотной последовательности.

В одном из вариантов осуществления фраза "селективно связывается" означает, что соединение или полипептид, полученные или использованные по настоящему изобретению, предпочтительно, связываются с одним типом рецепторов, а не с другим, когда связывание происходит в присутствие смеси двух или более рецепторов (например, рецепторов меланокортина, MC1, MC2, MC3, MC4, MC5 рецепторы).

"Аминокислота" или "аминокислотная последовательность" содержит олигопептид, пептид, полипептид, или белковую последовательность, или фрагмент, часть или субъединицу любого из них, и относится к природной или синтетической молекуле. Термины "полипептид" и "белок" содержат аминокислоты, присоединенные друг к другу пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами, и могут содержать модифицированные аминокислоты, иные чем 20 закодированных в генах аминокислот. Термин "полипептид" также содержит пептиды и полипептидные фрагменты, мотивы и т.п. Заглавные однобуквенные аббревиатуры аминокислот относятся к природным L-изомерам. Строчные однобуквенные аббревиатуры аминокислот обозначают D-изомер.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо по отношению к аминокислотным полимерам любой длины. Пептиды и полипептиды могут либо полностью состоять из синтетических искусственных аналогов аминокислот, либо представлять собой химерную молекулу, частично из природных пептидных аминокислот и частично из неприродных аналогов аминокислот. В одном из аспектов, полипептид используется в композиции, клеточной системе или способе по изобретению (например, клетка-хозяин с плазмидной экспрессией, по меньшей мере, одого фермента по изобретению). Кроме того, полипептид может относиться к соединениям, состоящим из аминокислотных полимеров, ковалентно присоединенных к другой функциональной группе (например, водорастворимая группа, нацеливающая группа, ПЭГ, неаминокислотная группа или другое терапевтическое средство).

Названия аминокислот можно сокращать с использованием следующих обозначений в скобках: пролин (Pro), валин (Val), лизин (Lys), орнитин (Orn), норлейцин (Nle), глицин (Gly), триптофан (Trp), аланин (Ala), фенилаланин (Phe), аргинин (Arg), гистидин (His), глутаминовая кислота (Glu), аспарагиновая кислота (Asp), серин (Ser), метионин (Met), изолейцин (Ile), тирозин (Tyr), циклогексилаланин (Cha), 4-фтор-D-фенилглицин (4-фтор-D-Phg), 2-тиенил-D-аланин (D-Thi).

"Лечение", "подвергать лечению", "лечить" или "терапия" в настоящем документе относится к введению млекопитающему веществ, которые способны вызывать профилактический, исцеляющий или другой положительный эффект у индивидуума. Лечение может дополнительно приводить к смягчению или улучшению заболевания или симптомов заболевания у пациента.

В настоящем документе формы единственного числа содержат ссылки на множественное число, если не указано иначе. Например, «клетка-мишень» содержит одну или несколько клеток-мишеней.

Полипептидные композиции по изобретению могут содержать любые комбинации неприродных структурных компонентов. Отдельные пептидные остатки могут быть соединены пептидными связями, другими химическими связями или посредством связывания, как например, глутаральдегид, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида, бифункциональные малеимиды, N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) или N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC). Связывающие группы, которые могут быть альтернативой традиционному амидному связыванию ("пептидная связь") содержат, например, кетометилен (например, -C(=O)-CH₂- для -C(=O)-NH-), аминометилен (CH₂-NH), этилен, олефин (CH=CH), простой эфир (CH₂-O), тиоэфир (CH₂-S), тетразол, тиазол, ретроамид, тиоамид, или сложный эфир (смотрите, например, Spatola (1983) in Chemistry и Biochemistry of Aminoacids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp. 267-357', "Peptide Backbone Modifications", Marcel Dekker, NY, включенные в настоящий документ в качестве ссылки).

Полипептиды, используемые для осуществления на практике способа по изобретению, могут быть модифицированными любыми природными процессами, такими как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилирование, ацилирование и т.д.), или с помощью методов химической модификации, и полученными модифицированными пептидами. Модификации могут быть сделаны в любой части полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино или карбокси концы. Следует понимать, что одинаковый тип модификации может присутствовать в одинаковой или различных степенях в нескольких участках в полипептиде. Также данный полипептид может иметь много типов модификации. Модификации содержат ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, образование кольца с перекрестными сшивками, формирование дисульфидной связи, деметилирование, формирование ковалентных перекрестных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование гликофосфатидилинозитолового анкора, гидроксилирование, йодирование, метилирование, ацилирование остатком миристиловой кислоты, оксидирование, пегилирование, протеолитическое расщепление, фосфорилирование, пренилирование, селенонирование, сульфатирование, и т-РНК-опосредованное добавление аминокислот к белку, такое как аргинилирование. Смотрите, например, Creighton, T.E., Proteins - Structure и Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman и Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983), включенные в настоящий документ в качестве ссылки.

Дополнительные варианты осуществления соединений

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к по существу чистому соединению, которое селективно связывается с рецептором меланокортина 1 (MClR); указанное соединение содержит полипептид с последовательностью:

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃,

где Xaa₁ представляет собой D-Val, D-Ala или D-Lys;

Xaa₂ представляет собой D-Pro, D-Ala или D-Lys;

Xaa₃ представляет собой D-Lys, D-Orn, D-Nle, D-Ala или D-Lys;

Xaa₄ представляет собой Gly или D-Ala;

Xaa₅ представляет собой D-Trp, Trp, D-3-бензотиенил-Ala, D-5-гидрокси-Trp, D-5-метокси-Trp, D-Phe или D-Ala;

Xaa₆ представляет собой D-Arg, D-His или D-Ala;

Xaa₇ представляет собой D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-фтор-Phg, D-3-пиридил-Ala, D-Thi, D-Trp, D-4-нитро-Phe или D-Ala;

Xaa₈ представляет собой D-His, His, D-Arg, Phe, или D-Ala;

Xaa₉ представляет собой D-Glu, D-Asp, D-цитруллин, D-Ser или D-Ala;

Xaa₁₀ представляет собой D-Met, D-бутионин, D-Ile или D-Ala;

Xaa₁₁ представляет собой D-Ser, D-Ile или D-Ala;

Xaa₁₂ представляет собой D-Tyr, D-Ser или D-Ala;

Xaa₁₃ представляет собой D-Ser или D-Ala;

или его фармацевтически приемлемую соль.

В некоторых вариантах осуществления пептидные аналоги по изобретению селективно связывают MC1R и содержат полипептид с последовательностью: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃, где Xaa₁ представляет собой D-Val; Xaa₂ представляет собой D-Pro; Xaa₃ представляет собой D-Lys, D-Orn или D-Nle; Xaa₄ представляет собой Gly; Xaa₅ представляет собой D-Trp, Trp, D-3-бензотиенил-Ala, D-5-гидрокси-Trp, D-5-метокси-Trp или D-Phe; Xaa₆ представляет собой D-Arg или D-His; Xaa₇ представляет собой D-Cha, D-Phe, Phe, D-4-фтор-Phg, D-3-пиридил-Ala, D-Thi, D-Trp или D-4-нитро-Phe; Xaa₈ представляет собой D-His, His, D-Arg, Phe или D-Ala; Xaa₉ представляет собой D-Glu, D-Asp, D-цитруллин или D-Ser; Xaa₁₀ представляет собой D-Met, D-бутионин или D-Ile; Xaa₁₁ представляет собой D-Ser или D-Ile; Xaa₁₂ представляет собой D-Tyr или D-Ser; Xaa₁₃ представляет собой D-Ser, где не более, чем одна из Xaa_1-13 представляет собой L-аминокислоту; или его фармацевтически приемлемую соль.

В других вариантах осуществления пептидные аналоги по изобретению содержат полипептид с последовательностью: Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Xaa₁₂ Xaa₁₃, где Xaa₁ представляет собой D-Val; Xaa₂ представляет собой D-Pro; Xaa₃ представляет собой D-Lys, D-Orn или D-Nle; Xaa₄ представляет собой Gly; Xaa₅ представляет собой D-Trp или Trp; Xaa₆ представляет собой D-Arg; Xaa₇ представляет собой D-Cha, D-Phe, Phe или D-Thi; Xaa₈ представляет собой D-His или His; Xaa₉ представляет собой D-Glu или D-Ser; Xaa₁₀ представляет собой D-Met, D-бутионин или D-Ile; Xaa₁₁ представляет собой D-Ser или D-Ile; Xaa₁₂ представляет собой D-Tyr или D-Ser; Xaa₁₃ представляет собой D-Ser; где не более, чем одна из Xaa_1-13 представляет собой L-аминокислоту; или его фармацевтически приемлемую соль.

Соединения, приведенные в настоящем документе, содержат пептидные аналоги α-меланокортинстимулирующего гормона (α-MSH).

В альтернативном варианте осуществления, пептидные аналоги состоят из D-аминокислот. В других вариантах осуществления пептиды содержат D-аминокислоты, L-аминокислоты или смесь D- и L-аминокислот. В других вариантах осуществления пептиды содержат, по меньшей мере, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% D-аминокислот. Соединения по изобретению могут также содержать следующие неограничивающие примеры нестандартных аминокислот: D-орнитин, D-норлейцин, 3-бензотиенил-D-аланин, 5-гидрокси-D-Trp, 5-метокси-D-Trp, 4-фтор-D-фенилглицин (4-фтор-D-Phg), 3-пиридил-D-аланин, 2-тиенил-D-аланин (D-Thi), D-циклогексилаланин (D-Cha), 4-нитро-D-Phe, D-цитруллин, α-метил-D-Met и D-бутионин.

В некоторых вариантах осуществления, основной тетрапептид содержит аминокислотную последовательность His Phe Arg Trp или Trp Arg Phe His, предпочтительно в D-аминокислотной конфигурации. В другом варианте осуществления, основной тетрапептид содержит аминокислотную последовательность His D-Cha Arg Trp или Trp Arg D-Cha His, предпочтительно в D-аминокислотной конфигурации. В некоторых вариантах осуществления основной тетрапептид содержит 4 D-аминокислоты. В других вариантах осуществления, основной тетрапептид имеет, по меньшей мере, одну нестандартную аминокислоту.

Приведенные в данном документе соединения могут быть синтетическими или рекомбинантными. Соединения по изобретению могут быть получены обычными химическими способами, известными в данной области. Способы твердофазного синтеза описаны в опубликованной литературе, такой как Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (E. Atherton, et al. 1989). Соединения по изобретению также могут быть получены обычными молекулярно-биологическими способами, известными в данной области. В рамках настоящей заявки, если не указано иначе, определения терминов и объяснения методов можно найти в любой из некоторых хорошо известных публикаций, таких как: Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Goeddel, D., ed., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1991); "Guide to Protein Purification" in Deutshcer, M.P., ed., Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1989); Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed., Alan Liss, Inc. New York, NY (1987); Murray, E.J., ed., Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, The Humana Press Inc., Clifton, NJ and Lewin, B., Genes VI, Oxford University Press, New York (1997). Все цитируемые публикации включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

В некоторых вариантах осуществления пептидные аналоги по изобретению селективно связывают или активируют рецептор меланокортина-1 (MC1R). Для измерения связывания или активации MC1R может быть использован любой подходящий анализ. Например, для определения активации MC1R можно использовать индукцию цАМФ in vitro. Оценка in vitro может свидетельствовать об активации in vivo. Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения содержат любой полипептид, селективный для MC1-рецепторов. Выявление соединения, селективного для MCl-рецептора, может быть осуществлено подходящим методом скрининга. Неограничивающий пример анализа связывания MCl-рецептора описан в примере 4. В некоторых вариантах осуществления, предпочтительные MC1-рецепторы содержат рецептор меланокортина 1 homo sapiens (GenBank Accession No: NP_002377).

Другие варианты осуществления изобретения относятся к соединениям, которые изменяют уровни цАМФ, оксида азота (NO), TNF-α, мРНК TNF-α, мРНК IL-10, IL-10, IFNγ, IL-6, IL-12 и/или MCP-1. В некоторых вариантах осуществления соединения повышают уровни цАМФ. В других вариантах осуществления соединения нацелены на снижение или ингибирование уровней оксида азота (NO), TNF-α, мРНК TNF-α, мРНК IL-10, IL-10, IFNγ, IL-6, IL-12 и/или MCP-1. Идентичность соединений, которые изменяют в