Набор для получения иммуногенной композиции против neisseria meningitidis серологической группы в

Набор для получения иммуногенной композиции против neisseria meningitidis серологической группы в

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к области приготовления менингококковых вакцин.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время исследуются различные вакцины против Neisseria meningitidis серологической группы B («Men-B»), однако они обладают одной общей характерной особенностью.

Все продукты везикул внешней мембраны (OMV), выпускаемые Novartis (MENZB^TM), Институтом Finlay (VA-MENGOC-BC^TM), Норвежским институтом здравоохранения (MENBVAC^TM) и Нидерландским институтом вакцин (HEXAMEN^TM и NONAMEN^TM), содержат адъювант в виде гидроокиси алюминия. «Универсальная вакцина от менингококка серологической группы B», как сообщалось Novartis в ссылке 1, также включает адъювант в виде гидроокиси алюминия, равно как и бивалентная OMV-вакцина, о чем недавно сообщалось в ссылке 2.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

При разработке Men-B-вакцины от Novartis авторы изобретения обнаружили, что для оптимальной иммуногенности требуется присутствие адъюванта. Более того, они обнаружили, что адсорбция гидроокисью алюминия обеспечивает хорошую стабильность антигенов вакцин при хранении. Тем не менее, во избежание необходимости использования алюминиевых солей предпринимались поиски альтернативных вариантов.

Уже известно применение безалюминиевых адъювантов для Men-B-вакцин. Так, например, ссылка 3 сообщает об использовании эмульсии MF59 типа масло-в-воде в качестве адъюванта для везикул Men-B, а ссылка 4 описывает использование иммуностимулирующих олигонуклеотидов и/или MF59 в качестве адъювантов. Несмотря на то что данные по иммуногенности с MF59 были превосходными, и продолженное исследование показало, что данный адъювант может увеличивать штаммовое покрытие Men-B-вакцины по сравнению с гидроокисью алюминия, дальнейшая работа неожиданно показала, что иммуногены Men-B с адъювантами в виде эмульсий типа масло-в-воде обладают низкой долговременной стабильностью. Таким образом, предметом изобретения является предоставление путей улучшения устойчивости при хранении Men-B-вакцин при использовании адъювантов в виде эмульсий типа масло-в-воде.

Предшествующий опыт с эмульсиями типа масло-в-воде происходит из области вакцин против гриппа. Продукт FLUAD^TM включает эмульсию MF59 и поставляется в предварительно смешанном жидком формате в едином контейнере (подход «одного сосуда»). Этот предварительно смешанный состав представляет собой состав, который, как сейчас было обнаружено, характеризуется низкой стабильностью для Men-B-вакцин.

В качестве альтернативы составу «одного сосуда» с вакцинами с эмульсией типа масло-в-воде для гриппа (например, см. ссылку 5), для вируса герпеса (например, см. ссылку 6) и для ВИЧ (например, см. ссылку 7) был применен способ «двух сосудов», при котором вакцина и эмульсия поставляются вместе, обе в жидком виде, приготовленные для быстрого смешивания в момент применения.

В соответствии с настоящим изобретением для Men-B-вакцин придерживаются другого подхода с использованием двойного состава из (i) адъюванта с эмульсией типа масло-в-воде и (ii) иммуногенного компонента Men-B в лиофилизированной форме. Лиофилизированные антигены Men-B можно восстановить в жидкой форме с адъювантом в момент применения, готовой для введения пациенту. Было обнаружено, что этот состав дает прекрасные результаты как в плане стабильности, так и в плане иммуногенности.

Авторы изобретения также обнаружили, что лиофилизированный компонент может сохранять эффективность при включении одного или нескольких конъюгированных сахаридов из N. meningitidis серологических групп A, C, W135 и/или Y (Men-A, -C, -W135 и -Y). Комбинация антигенов для иммунизирования против многочисленных менингококковых серологических групп, включая серологическую группу B, с использованием единственного лиофилизированного компонента, является особенно предпочтительной.

Таким образом, изобретение предоставляет набор, содержащий: (i) первый контейнер, содержащий адъювант, включающий эмульсию типа масло-в-воде; и (ii) второй контейнер, содержащий лиофилизированную антигенную композицию, включающую иммуноген для индукции иммунного ответа против N. meningitidis серологической группы B. Лиофилизированная антигенная композиция может дополнительно содержать конъюгированный капсульный сахарид из N.meningitidis одной или нескольких серологических групп A, C, W135 и/или Y.

Изобретение также предоставляет способ получения иммуногенной композиции, включающий стадии смешивания: (i) адъюванта, содержащего эмульсию типа масло-в-воде; и (ii) лиофилизированной антигенной композиции, содержащей иммуноген для индукции иммунного ответа против N. meningitidis серологической группы B. Лиофилизированная антигенная композиция может дополнительно содержать конъюгированный капсульный сахарид из N.meningitidis одной или нескольких серологических групп A, C, W135 и/или Y.

Изобретение также предоставляет лиофилизированную антигенную композицию, содержащую (i) иммуноген для индукции иммунного ответа против N.meningitidis серологической группы B и (ii) конъюгированный капсульный сахарид из N.meningitidis одной или нескольких серологических групп A, C, W135 и/или Y. Эта лиофилизированная композиция пригодна для восстановления влагосодержания при помощи адъюванта, содержащего эмульсию типа масло-в-воде, и пригодна для использования в качестве компонента набора по изобретению.

Лиофилизированная антигенная композиция

В изобретении используют лиофилизированную антигенную композицию, которая включает иммуноген для индукции иммунного ответа против Men-B. Она может необязательно содержать конъюгированный капсульный сахарид из одной или нескольких Men-A, Men-C, Men-W135 и/или Men-Y.

Иммуноген Men-B может содержать мембранные везикулы из бактерий Men-B, и/или рекомбинантные белки Men-B, и/или липоолигосахарид (LOS) Men-B.

Лиофилизация OMV из Men-B известна в данной области [8], однако эти OMV последовательно вводили вместе с алюминиево-фосфатным адъювантом. Таким образом, о проблеме антигенной стабильности в сочетании с адъювантом с эмульсией типа масло-в-воде не сообщалось. Подобным образом, известна лиофилизация менингококковых конъюгированных антигенов, включая последовательное восстановление с MF59 [9], но не в комбинации с каким-либо антигеном Men-B.

Везикулы, содержащие компоненты Men-B

Везикулы для использования в качестве компонентов Men-B-вакцины включают любую протеолипосомную везикулу, полученную путем разрушения внешней мембраны для образования из этого везикул, которые включают белковые компоненты внешней мембраны. Таким образом, термин включает OMV (иногда называемые «пузырьками»), микровезикулы (MV [10]) и «нативные OMV» («NOMV» [11]).

MV и NOMV представляют собой природные мембранные везикулы, которые образуются спонтанно во время роста бактерий и которые высвобождаются в культуральную среду. MV можно получить путем культивирования Neisseria в питательной среде для культивирования, отделяя целые клетки от меньших MV в питательной среде для культивирования (например, путем фильтрации или путем низкоскоростного центрифугирования для осаждения только клеток, а не меньших везикул) и затем собирая MV из бесклеточной среды (например, путем фильтрации, путем неравномерного осаждения или агрегирования MV, путем высокоскоростного центрифугирования для осаждения MV). Штаммы для использования при продуцировании MV, как правило, можно отбирать на основе количества MV, получаемого в культуре, например ссылки 12 и 13 описывают Neisseria с высоким уровнем продуцирования MV.

OMV искусственно получают из бактерий, и их можно получать при помощи обработки детергентом (например, дезоксихолатом) или при помощи недетергентных средств (например, см. ссылку 14). Способы получения подходящих препаратов OMV раскрыты, например, в цитируемых в настоящем документе ссылках. Методики для образования OMV включают обработку бактерий детергентом на основе соли жирной кислоты (например, соли литохолевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, холевой кислоты, урсохолевой кислоты и т.д., дезоксихолатом натрия [15 и 16], предпочтительным для обработки Neisseria) при pH, достаточно высоких, чтобы детергент не выпал в осадок [17]. Другие методики можно выполнять последовательно в отсутствие детергента [14], используя методики, такие как обработка ультразвуком, гомогенизация, микрофлюидизация, кавитация, осмотический шок, перемалывание, французский жим, смешивание и т.д. Способы, не использующие детергент или использующие низкую концентрацию детергента, могут сохранять полезные антигены, такие как NspA [14]. В таком способе может применяться буфер для экстракции OMV с около 0,5% дезоксихолата или меньше, например около 0,2%, около 0,1%, <0,05% или вообще без него.

Подходящий процесс для получения OMV описан в ссылке 18 и включает ультрафильтрацию неочищенных OMV вместо высокоскоростного центрифугирования. Процесс может включать стадию ультрацентрифугирования после проведения ультрафильтрации.

Для использования в изобретении везикулы можно получать из любого штамма Men-B. Штаммы могут быть любого серологического типа (например, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16 и т.д.), любого серологического субтипа и любого иммунотипа (например, L1; L2; L3; L3,3,7; L10; и т.д.). Менингококк может представлять собой менингококк из любой подходящей линии, включая гиперинвазивные и гипервирулентные линии, например любой из следующих семи гипервирулентных линий: подгруппа I; подгруппа III; подгруппа IV-1; комплекс ET-5; комплекс ET-37; кластер A4; линия 3. Эти линии были охарактеризованы при помощи мультилокусного ферментного электрофореза (MLEE), однако мультилокусное сиквенс-типирование (MLST) также использовали для классифицирования менингококков [ссылка 19], например комплекс ET-37 представляет собой комплекс ST-11 по MLST, комплекс ET-5 представляет собой ST-32 (ET-5), линия 3 представляет собой ST-41/44 и т.д. Везикулы можно получать из штаммов, имеющих один из следующих субтипов: P1.2; P1.2,5; P1.4; P1.5; P1.5,2; P1.5,c; P1.5c,10; P1.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; P1.9; P1.15; P1.9,15; P1.12,13; P1.13; P1.14; P1.21,16; P1.22,14.

Везикулы, используемые в этом изобретении, можно изготовить из штаммов Men-B дикого типа или из мутантных штаммов. Так, например, ссылка 20 раскрывает препараты везикул, полученных из N.meningitidis с модифицированным геном fur. Ссылка 27 сообщает, что экспрессия nspA должна активироваться сопутствующим porA и нокаутом cps. Дополнительные мутанты N.meningitidis с нокаутом для продуцирования OMV раскрыты в ссылках с 27 по 29. Ссылка 21 раскрывает везикулы, у которых имеет место повышенная регуляция fHBP. Ссылка 22 раскрывает конструкцию везикул из штаммов, модифицированных для экспрессии шести различных субтипов PorA. Также можно использовать мутант Neisseria с низкими уровнями эндотоксина, полученный путем нокаута ферментов, вовлеченных в биосинтез LPS [23, 24]. Все эти или другие мутанты можно использовать в изобретении.

Таким образом, штамм Men-B, использованный в изобретении, в некоторых вариантах осуществления может экспрессировать более чем один подтип PorA. Предварительно были сконструированы 6-валентные и 9-валентные PorA-штаммы. Штамм может экспрессировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 из подтипов PorA: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1 и/или P1.18-1,3,6. В других вариантах осуществления у штамма может быть подавлена экспрессия PorA, например штамм, у которого количество PorA было уменьшено, по меньшей мере, на 20% (например, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95% и т.д.) или даже совсем отсутствовал PorA, по сравнению с уровнями дикого типа (например, по сравнению со штаммом H44/76, как раскрыто в ссылке 30).

В некоторых вариантах осуществления в штамме Men-B определенные белки могут быть сверхэкспрессированы (по сравнению с соответствующим штаммом дикого типа). Так, например, штаммы могут сверхэкспрессировать NspA, белок 287 [45], fHBP [21], TbpA и/или TbpB [25], Cu,Zn-супероксид-дисмутазу [25] и т.д.

В некоторых вариантах осуществления штамм Men-B может включать одну или несколько нокаутирующих и/или увеличивающих экспрессию мутаций, раскрытых в ссылках от 26 до 29. Предпочтительные гены для подавления экспрессии и/или нокаута включают: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [26]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [27]; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [28]; и (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB и/или SynC [29].

Если используют мутантный штамм, то в некоторых вариантах осуществления он может обладать одной, или несколькими, или всеми из следующих характерных особенностей: (i) подавленная экспрессия или нокаут LgtB и/или GalE для укорочения менингококкового LOS; (ii) увеличенная экспрессия TbpA; (iii) увеличенная экспрессия Hsf; (iv) увеличенная экспрессия Omp85; (v) увеличенная экспрессия LbpA; (vi) увеличенная экспрессия NspA; (vii) нокаут PorA; (viii) подавленная экспрессия или нокаут FrpB; (ix) подавленная экспрессия или нокаут Opa; (x) подавленная экспрессия или нокаут Opc; (xii) делетированный комплекс генов cps. Укороченный LOS может представлять собой LOS, который не содержит сиалиллакто-N-неотетраозный эпитоп, например это может быть лишенный галактозы LOS. LOS может не содержать α-цепь.

Если в везикуле присутствует LOS, тогда можно обработать везикулу для того, чтобы соединить ее LOS и белковые компоненты («внутриполостное» соединение [29]).

Изобретение можно применять со смесями везикул из различных штаммов. Так, например, ссылка 30 раскрывает вакцину, включающую композиции мультивалентных менингококковых везикул, содержащие первую везикулу, полученную из менингококкового штамма с серологическим подтипом, превалирующим в стране применения, и вторую везикулу, полученную из штамма, которому не нужно иметь серологический подтип, превалирующий в стране применения. Ссылка 31 также раскрывает пригодные комбинации различных везикул. В некоторых вариантах осуществления можно применять комбинацию везикул из штаммов с иммунотипами L2 и L3 у каждого.

Антигены на основе везикул можно получить из серологических групп, отличных от Men-B (например, ссылка 17 раскрывает процесс для Men-A). Соответственно, изобретение можно использовать с везикулами, подготовленными серологическими группами, отличными от Men-B (например, A, C, W135 и/или Y). Тем не менее, основное внимание сосредоточено на Men-B.

Компоненты Men-B, содержащие рекомбинантные белки

Также сообщалось о рекомбинантных белках для использования в качестве вакцинных иммуногенов против Men-B. Так, например, в ссылках с 32 по 40 сообщается о различных антигенах. Такие антигены можно использовать по отдельности или в комбинациях. Если комбинируется несколько очищенных белков, то целесообразно использовать смесь из 10 или менее (например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) очищенных антигенов.

Особенно полезная комбинация антигенов раскрыта в ссылках 1 и 40, и поэтому композиция по изобретению может включать 1, 2, 3, 4 или 5 из: (1) белок «NadA»; (2) белок «fHBP», прежде известный как «741»; (3) белок «936»; (4) белок «953»; и (5) белок «287». Другие возможные комбинации антигенов могут включать трансферрин-связывающий белок (например, TbpA и/или TbpB) и антиген Hsf. Другие возможные очищенные антигены включают белки, содержащие одну из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:650 из ссылки 32; SEQ ID NO:878 из ссылки 32; SEQ ID NO:884 из ссылки 32; SEQ ID NO:4 из ссылки 33; SEQ ID NO:598 из ссылки 34; SEQ ID NO:818 из ссылки 34; SEQ ID NO:864 из ссылки 34; SEQ ID NO:866 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1196 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1272 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1274 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1640 из ссылки 34; SEQ ID NO: 1788 из ссылки 34; SEQ ID NO:2288 из ссылки 34; SEQ ID NO: 2466 из ссылки 34; SEQ ID NO:2554 из ссылки 34; SEQ ID NO:2576 из ссылки 34; SEQ ID NO: 2606 из ссылки 34; SEQ ID NO: 2608 из ссылки 34; SEQ ID NO:2616 из ссылки 34; SEQ ID NO:2668 из ссылки 34; SEQ ID NO:2780 из ссылки 34; SEQ ID NO:2932 из ссылки 34; SEQ ID NO:2958 из ссылки 34; SEQ ID NO:2970 из ссылки 34; SEQ ID NO:2988 из ссылки 34, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая: (a) обладает 50%-ной или более идентичностью (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с указанной последовательностью; и/или (b) включает фрагмент из, по меньшей мере, n последовательных аминокислот указанной последовательности, где n представляет собой 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты из (b) содержат эпитоп из соответствующей последовательности. Может быть включен более чем один (например, 2, 3, 4, 5, 6) из этих полипептидов.

Антиген fHBP распадается на три отдельных варианта [39]. Компонент Men-B по изобретению может включать единственный вариант fHBP, однако будет полезно включать fHBP из каждого из двух вариантов или все три варианта. Таким образом, он может включать комбинацию из двух или трех различных очищенных fHBP, выбранных из: (a) первого белка, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, a%-ной идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, и/или включающего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из, по меньшей мере, x смежных аминокислот из SEQ ID NO: 1; (b) второго белка, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, b%-ной идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, и/или включающего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из, по меньшей мере, y смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2; и/или (c) третьего белка, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, c%-ной идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3, и/или включающего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента из, по меньшей мере, z смежных аминокислот из SEQ ID NO: 3.

Значение a представляет собой, по меньшей мере, 85, например 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Значение b представляет собой, по меньшей мере, 85, например 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Значение c представляет собой, по меньшей мере, 85, например 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Значения a, b и c по существу не связаны одно с другим.

Значение х представляет собой, по меньшей мере, 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Значение y представляет собой, по меньшей мере, 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Значение z представляет собой, по меньшей мере, 7, например 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250. Значения x, y и z по существу не связаны одно с другим.

В некоторых вариантах осуществления белок(ки) fHBP следует липидизировать, например, по N-концевому цистеину. В других вариантах осуществления их не следует липидизировать.

Пригодные композиции, основанные на очищенных белках, содержат смесь из: (i) первого полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4; (ii) первого полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7; и (iii) первого полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6. См. ссылки 1 и 40.

Компоненты Men-B, содержащие LOS

Сообщалось о менингококковых вакцинах на основе липоолигосахарида. LOS можно использовать сами по себе или конъюгированным с носителем. Если он конъюгирован, конъюгация может осуществляться через посредство части липида A в LOS или при помощи любой другой подходящей функциональной группы, например, его кетодезоксиоктаноатных (KDO) остатков. Если часть липида A у LOS отсутствует, то такое альтернативное соединение является существенно важным.

LOS может быть из любого иммунотипа, например L2, L3, L7 и т.д.

Вместо того, чтобы использовать нативный LOS, предпочтительнее использовать модифицированную форму. Эти модификации можно получить химически, однако удобнее удалить путем нокаута генов ферменты в Men-B, ответственные за определенные биосинтетические присоединения. Так, например, LOS можно модифицировать для удаления, по меньшей мере, концевой Gal нативной лакто-N-неотетраозной единицы, и эту модификацию можно получить путем нокаута одного или нескольких родственных ферментов. Ферменты, ответственные за добавление двух концевых моносахаридов в нативном LOS (сиаловой кислоты и галактозы), можно подвергнуть нокауту либо для удаления лишь концевой Sia, либо для удаления дисахарида Sia-Gal. Нокаут гена lgtB, например, устраняет Sia-Gal. Нокаут гена galE также обеспечивает пригодный модифицированный LOS. Ген липид A трансферазы жирных кислот можно подвергать нокауту [41].

По меньшей мере, из LOS можно удалить одну первичную O-присоединенную жирную кислоту [42]. Также можно использовать LOS, обладающий уменьшенным числом вторичных ацильных цепей на молекулу LOS [43]. LOS может не иметь α-цепи.

LOS может содержать GlcNAc-Нер₂фосфоэтаноламин-KDO₂-Липид А [44].

Смешанные компоненты Men-B

В качестве антигена Men-B в изобретении можно использовать везикулы, очищенные полипептиды или LOS. Также можно использовать комбинации этих трех антигенов, например (i) везикулы + очищенные полипептиды; (ii) везикулы + LOS; (iii) очищенные полипептиды + LOS; или (iv) везикулы + очищенные полипептиды + LOS. Эти комбинации можно создать путем раздельной подготовки отдельных компонентов и их последующего смешивания. Так, например, ссылка 45 раскрывает добавление очищенных белков к везикулам для предоставления композиции с расширенной эффективностью.

Серологические группы A, C, W135 и Y

Конъюгированные моновалентные вакцины против серологической группы C были одобрены для применения на людях и включают MENJUGATE^TM, MENINGITEC^TM и NEISVAC-C^TM. Известны смеси конъюгатов из серологических групп A+C [46, 47], и были сообщения о смесях конъюгатов из серологических групп A+C+W135+Y [48-51], которые были одобрены в 2005 г. в качестве водного продукта MENACTRA^TM.

Использованный в изобретении лиофилизированный компонент может включать один или несколько конъюгатов капсульных сахаридов из 1, 2, 3 или 4 менингококковых серологических групп A, C, W135 и Y, например A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, A+W135+Y, A+C+W135+Y и т.д. Компоненты, включающие сахариды всех четырех серологических групп A, C, W135 и Y, являются предпочтительными.

Капсульный сахарид менингококковой серологической группы A представляет собой гомополимер (α1→6)-присоединенного N-ацетил-D-маннозамин-1-фосфата с частичным O-ацетилированием в положениях C3 и C4. Ацетилирование в положении C-3 может составлять 70-95%. Условия, использованные для очистки сахарида, могут приводить к де-O-ацетилированию (например, при щелочных условиях), однако полезно сохранять O-ацетилирование в этом положении C-3. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, 50% (например, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более) остатков маннозамина в сахаридах серологической группы A являются O-ацетилированными в положении C-3. Ацетильные группы можно заместить блокирующими группами для предотвращения гидролиза [52], и такие модифицированные сахариды по-прежнему представляют собой сахариды серологической группы A в пределах предназначения изобретения.

Капсульный сахарид серологической группы C представляет собой гомополимер (α2→9)-присоединенной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовая кислота, или «NeuNAc»). Структура сахарида записывают как →9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(α2→. Большинство штаммов серологической группы C имеет O-ацетильные группы в положениях C-7 и/или C-8 остатков сиаловой кислоты, однако около 15% клинических изолятов не содержат этих O-ацетильных групп [53, 54]. Наличие или отсутствие OAc-групп порождает уникальные эпитопы, и специфичность антитела, связывающегося с сахаридом, может оказывать влияние на его бактерицидную активность в отношении O-ацетилированных (OAc+) и де-O-ацетилированных (OAc-) штаммов [55-57]. Сахариды серологической группы C, использованные в изобретении, можно получать либо из штаммов OAc+, либо из штаммов OAc-. Лицензированные Men-C конъюгатные вакцины содержат как сахариды OAc- (NEISVAC-C^TM), так и сахариды OAc+ (MENJUGATE^TM и MENINGITEC^TM). В некоторых вариантах осуществления штаммы для продуцирования конъюгатов серологической группы C являются штаммами OAc+, например штаммами серологического типа 16, серологического подтипа P1.7a,1 и т.д. Таким образом, можно использовать штаммы C:16:P1.7a,1 OAc+. Также пригодны штаммы OAc+ серологического подтипа P1.1, такие как штамм C11.

Сахарид серологической группы W135 представляет собой полимер дисахаридных единиц сиаловая кислота-галактоза. Он O-ацетилирован подобно сахариду серологической группы C, но в положениях сиаловой кислоты 7 и 9 [58]. Структура записывается как: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→.

Сахарид серологической группы Y сходен с сахаридом серологической группы W135, за исключением того, что повторяющаяся дисахаридная единица содержит глюкозу вместо галактозы. Подобно сахариду серологической группы W135, он обладает изменчивым O-ацетилированием по положениям сиаловой кислоты 7 и 9 [58]. Структура серологической группы Y записывается как: →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→.

Сахариды, используемые в соответствии с изобретением, могут быть O-ацетилированы, как описано выше (например, с той же структурой O-ацетилирования, какая наблюдается в нативных капсульных сахаридах), или они могут быть частично или полностью де-O-ацетилированы по одному или нескольким положениям сахаридных колец, или они могут быть сверх-O-ацетилированы по отношению к нативным капсульным сахаридам.

Сахаридные части в конъюгатах могут содержать полноразмерные сахариды, как полученные из менингококка, и/или могут содержать фрагменты полноразмерных сахаридов, то есть сахариды могут быть короче, чем нативные капсульные сахариды, наблюдаемые у бактерий. Таким образом, сахариды могут быть деполимеризованы, с деполимеризацией, возникающей во время или после очищения сахарида, но перед конъюгацией. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Один способ деполимеризации предусматривает использование перекиси водорода [48]. Перекись водорода добавляют к сахариду (например, до получения конечной концентрации H₂O₂ в 1%) и смесь затем инкубируют (например, при 55°C) до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое уменьшение длины цепи. Другой способ деполимеризации предусматривает кислотный гидролиз [49]. В данной области известны другие способы деполимеризации. Сахариды, используемые при изготовлении конъюгатов для применения по изобретению, можно получать при помощи любого из этих способов деполимеризации. Деполимеризацию можно использовать для того, чтобы обеспечить оптимальную длину цепи для иммуногенности и/или для уменьшения длины цепи для физической контролируемости сахаридов. В некоторых вариантах осуществления сахариды обладают следующим диапазоном средних степеней полимеризации (Dp): A=10-20; C=12-22; W135=15-25; Y=15-25. В значениях молекулярной массы, вместо Dp, подходящие диапазоны для всех серологических групп составляют: <100 кДа; 5 кДа-75 кДа; 7 кДа-50 кДа; 8 кДа-35 кДа; 12 кДа-25 кДа; 15 кДа-22 кДа.

В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса сахаридов каждой из менингококковых серологических групп A, C, W135 и Y может быть более чем 50 кДа, например ≥75 кДа, ≥100 кДа, ≥110 кДа, ≥120 кДа, ≥130 кДа и т.д. [59], и даже до 1500 кДа, в частности, как определяется путем MALLS. Так, например: сахарид Men-A может находиться в диапазоне 50-500 кДа, например 60-80 кДа; сахарид Men-C может находиться в диапазоне 100-210 кДа; сахарид Men-W135 может находиться в диапазоне 60-190 кДа, например 120-140 кДа; и/или сахарид Men-Y может находиться в диапазоне 60-190 кДа, например 150-160 кДа.

Масса менингококкового сахарида в серологической группе в восстановленной вакцине обычно должна составлять от 1 мкг до 20 мкг, например от 2 до 10 мкг на серологическую группу, или около 4 мкг, или около 5 мкг, или около 10 мкг. Если включаются конъюгаты из более чем одной серологической группы, то они фактически могут присутствовать в равных массах, например масса сахарида каждой из серологических групп находится в пределах +10% от массы друг друга. В качестве альтернативы равному соотношению можно использовать удвоенную массу сахарида серологической группы A. Таким образом, вакцина может включать сахарид Men-A в количестве 10 мкг и сахариды Men-C, -W135 и -Y в количестве 5 мкг каждого.

Предпочтительные белки-носители представляют собой бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсины, или токсоиды или их мутанты. Они часто используются в конъюгатных вакцинах. Мутант дифтерийного токсина CRM₁₉₇ является особенно предпочтительным [60]. Другие подходящие белки-носители включают белковый комплекс внешней мембраны N.meningitidis [61], синтетические пептиды [62, 63], белки теплового шока [64, 65], коклюшные белки [66, 67], цитокины [68], лимфокины [68], гормоны [68], факторы роста [68], искусственные белки, содержащие множественные эпитопы CD4⁺ T-клеток человека из различных антигенов, полученных из патогенов [69] , таких как N19 [70], белок D из H.influenzae [71-73], пневмолизин [74] или его нетоксичные производные [75], пневмококковый поверхностный белок PspA [76], белки, необходимые для усвоения железа [77], токсин A или B из C. difficile [78], рекомбинантный экзопротеин А Pseudomonas aeruginosa (rEPA) [79] и т.д. Единственный белок-носитель может нести сахариды из множества различных серологических групп [80], однако эта конфигурация не является предпочтительной. Если лиофилизированный компонент включает конъюгаты из более чем одной менингококковой серологической группы, то различные конъюгаты могут использовать различные белки-носители (например, одна серологическая группа на CRM197, другая - на столбнячном токсоиде) или они могут использовать один и тот же белок-носитель (например, сахариды из двух серологических групп по отдельности конъюгированы с CRM197 и затем скомбинированы).

Можно использовать конъюгаты с соотношением сахарид:белок (масса/масса) от 1:5 (т.е. избыток белка) до 5:1 (т.е. избыток сахарида), например соотношения от 1:2 до 5:1 и соотношения от 1:1,25 до 1:2,5. Как описано в ссылке 81, конъюгаты различных менингококковых серологических групп в смеси могут обладать различными соотношениями сахарид:белок, например один может иметь соотношение от 1:2 до 1:5, тогда как другой обладает соотношением между 5:1 и 1:1,99.

Пригодны сахариды и конъюгаты, обладающие характерными особенностями, раскрытыми в ссылке 82.

Молекулу носителя можно ковалентно конъюгировать с менингококковым сахаридом непосредственно или с помощью линкера. Известны различные линкеры, например линкер на основе адипиновой кислоты, который можно образовать путем соединения свободной -NH₂ группы (например, введенной в сахарид при помощи аминирования) с адипиновой кислотой (с использованием, например, диимидовой активации) и затем соединения белка с образовавшимся промежуточным продуктом сахарид-адипиновой кислоты [83, 84]. Другой предпочтительный тип соединения представляет собой карбониловый линкер, который может быть образован путем реакции свободной гидроксильной группы сахарида с CDI [85, 86] с последующей реакцией с белком с образованием карбаматного соединения. Другие линкеры включают β-пропионамидо [87], нитрофенилэтиламин [88], галоацилгалогениды [89], гликозидные соединения [90], 6-аминокапроновую кислоту [91], N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP) [92], дигидразид адипиновой кислоты ADH [93], функциональные группы с C₄ по C₁₂ [94] и т.д. Также можно применять карбодиимидную конденсацию [95].

Как описано в ссылке 96, смесь может включать один конъюгат с непосредственным соединением сахарид/белок и другой конъюгат с соединением при помощи линкера. В частности, эту конфигурацию применяют при использовании сахаридных конъюгатов из различных менингококковых серологических групп, например сахариды Men-A и Men-C можно конъюгировать при помощи линкера, тогда как сахариды Men-W135 и Men-Y можно конъюгировать непосредственно с белком-носителем.

Если композиция включает конъюгаты одной или нескольких из Men-A, -C, -W и/или -Y, в некоторых вариантах осуществления можно также эффективно включать конъюгат Hib (см. ниже). Если композиция включает сахарид из более чем одной менингококковой серологической группы, то определяют среднюю массу сахарида на серологическую группу. При использовании по существу равных масс каждой серологической группы средняя масса должна быть такой же, что и каждая отдельная масса; при использовании неравных масс средняя должна отличаться, например для смеси Men-ACWY с количеством 10:5:5:5 мкг средняя масса составляет 6,25 мкг на серологическую группу. Если к тому же включен сахарид Hib, то в некоторых вариантах осуществления его масса должна быть в значительной степени той же, что и средняя масса менингококкового сахарида на серологическую группу. В некоторых вариантах осуществления масса сахарида Hib должна быть больше (например, по меньшей мере, в 1,5 раза) средней массы менингококкового сахарида на серологическую группу. В некоторых вариантах осуществления масса сахарида Hib должна быть меньше (например, по меньшей мере, в 1,5 раза) средней массы менингококкового сахарида на серологическую группу [97].

Эмульсионный адъювант типа масло-в-воде

Известны различные эмульсионные адъюванты типа масло-в-воде, и они обычно включают, по меньшей мере, одно масло и, по меньшей мере, один сурфактант с маслом(ами) и сурфактантом(ами), обладающими способностью к биоразложению (преобразующимися в ходе обмена веществ) и биологически совместимыми. Как правило, капельки масла в эмульсии составляют в диаметре менее 5 мкм и даже могут иметь сверхмалый диаметр, малый размер которых достигается при помощи микрофлюидизатора, для предоставления стабильных эмульсий. Капельки с размером меньше чем 220 нм являются предпочтительными, поскольку их можно подвергать стерилизации фильтрованием.

Изобретение можно использовать с маслами, такими как масла из животного источника (такого как рыба) или растительного источника. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Наиболее распространенные и доступные арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло служат примером ореховых масел. Можно использовать, например, масло жожоба, полученное из бобов хохоба. Масла из семян включают сафлоровое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло и т.д. В зерновой группе кукурузное масло является наиболее доступным, однако можно также использовать масло из зерен других хлебных злаков, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тэфф, тритикале и другие. Глицероловые и 1,2-пропандиоловые эфиры 6-10-углеродных жирных кислот, несмотря на то что не представлены естественным образом в маслах из семян растений, можно получить путем гидролиза, сепарации и этерификации соответствующих материалов, происходящих из масел орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих преобразуются в ходе обмена веществ и поэтому могут быть использованы в практике этого изобретения. Из уровня техники хорошо известны способы разделения, очистки, сапонификации и другие средства, необходимые для получения очищенного масла из животных источников. Большинство рыб содержат преобразующиеся в ходе обмена веществ масла, которые можно легко восстановить. Например, масло из печени трески, масла из печени акулы и китовое масло, такое как спермацет, служат примером некоторых рыбьих жиров, которые можно использовать здесь. Ряд масел с разветвленной цепью синтезируют биохимически в виде 5-углеродных изопреновых единиц, и они обычно носят название терпеноидов. Жир печени акулы содержит разветвленные, ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, который здесь особенно предпочтителен. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также представляет собой предпочтительный жир. Рыбьи жиры, включая сквален и сквалан, полностью доступны из коммерческих источников или могут быть получены способами, известными в данной области. Другие предпочтительные масла представляют собой токоферолы. Можно использовать смеси масел.

Если композиция включает токоферол, можно использовать любые из токоферолов α, β, γ, δ, ε или ζ, однако предпочтительными являются α-токоферолы. Токоферол может иметь несколько форм, например различные соли и/или изомеры. Соли включают органические соли, такие как сукцинаты, ацетаты, соли никотиновой кислоты и т.д. Можно использовать как D-α-токоферол, так и DL-α-токоферол. Предпочтительный α-токоферол представляет собой DL-α-токоферол, и предпочтительная соль этого токоферола представляет собой сукцинат.

Сурфактанты можно классифицировать по их «HLB» (гидрофильно-липофильн