Апоптотические антитела против ige

Апоптотические антитела против ige

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Обратное действие

По данному изобретению испрашивается приоритет согласно 35 U.S.C. § 119 (e) по U.S.S.N. 60/896339, поданной 22 марта 2007 года.

Уровень техники, к которому относится изобретение

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к апоптотическим антителам против IgE, кодирующим их нуклеиновым кислотам, их терапевтическим композициям и к их применению для лечения опосредуемых IgE нарушений.

Описание связанной области

Аллергия относится к определенным заболеваниям, при которых иммунные ответы на антигены окружающей среды вызывают воспаление ткани и дисфункцию органа. Клинические проявления каждого аллергического заболевания отражают иммунологически индуцированный воспалительный ответ в вовлеченном органе или ткани. Эти проявления, как правило, не зависят от химических или физических свойств антигена. Разнообразие аллергических ответов возникает вследствие вовлечения различных иммунологических эффекторных каскадов, каждый из которых создает уникальную картину воспаления.

Аллергия распространена по всему миру. Однако склонность к конкретным заболеваниям варьирует среди различных возрастных групп, полов и рас. Преобладание восприимчивости к конкретным аллергенам определяется как генетической предрасположенностью, так и географическими и культурными факторами, которые ответственны за воздействие аллергена. Клиническое состояние аллергии поражает только некоторых индивидов, которые встречаются с каждым аллергеном. Возникновение аллергического заболевания при воздействии аллергена требует не только предшествующей "сенсибилизации", но также других факторов, которые определяют локализацию реакции в конкретном органе.

Биологический процесс, который предшествует аллергическому заболеванию при воздействии аллергена, состоит в том, что аллерген индуцирует иммунный ответ, известный как "сенсибилизация" или фаза сенсибилизации. После сенсибилизации у индивида отсутствуют симптомы до тех пор, пока не произойдет последующее воздействие аллергена. Эффект сенсибилизации также известен как иммунная память.

Одним из первичных каскадов, индуцирующих воспаление, является каскад через иммуноглобулин E (IgE). IgE играет центральную роль в аллергии вследствие его роли в качестве рецептора аллергенов на поверхности тучных клеток и базофилов. Антитела IgE Fc-участком молекулы фиксируются к высокоаффинному рецептору клеточной поверхности, называемому FcεRI, на поверхности тучных клеток и базофилов. Аллергическая реакция начинается, когда поливалентная молекула аллергена связывается с антителами, которые оккупируют эти рецепторы. Результатом является связывание FcεRI, который, в свою очередь, дает внутриклеточный сигнал, вызывая высвобождение и активацию медиаторов воспаления: гистамина, лейкотриенов, хемотактических факторов, активирующего тромбоциты фактора и протеаз. Эти активированные медиаторы действуют локально и вызывают повышенную проницаемость сосудов, расширение сосудов, сокращение гладких мышц и секрецию слизистых желез. Такие события клинически называют немедленной или ранней фазой, и они происходят в пределах первых 15-30 минут после воздействия аллергена. В течение последующих 12 часов происходит прогрессирующая инфильтрация в ткани воспалительных клеток, протекающая от нейтрофилов к эозинофилам и к мононуклеарным клеткам в ответ на другие химические медиаторы, до конца не изученные. Этот период времени, составляющий 6-12 часов после воздействия аллергена, называют поздней фазой, и он характеризуется клиническими проявлениями клеточного воспаления. С учетом того, что эти реакции поздней фазы, особенно в легком, возникают в отсутствии реакций ранней фазы, все еще не понятно полностью, является ли реакция поздней фазы обязательно опосредуемой IgE.

IgE существует в мембраносвязанной форме и в секретируемой форме. Эти различные формы, по-видимому, являются вариантами сплайсинга. Предшествующие подходы для достижения терапевтического эффекта посредством подавления IgE направлены, главным образом, на секретируемую форму (например, XOLAIR®, омализумаб), чтобы предотвратить или нейтрализовать дальнейшее "вооружение" иммунной системы. Секретируемая форма IgE представляет собой более короткую форму, главным образом концы Fc-участка на CH4-домене (фиг.1), в то время как более длинная форма включает дополнительные C-концевые остатки, включающие пептиды, кодируемые экзонами, известными как М1/М1' и M2. В то время как было описано две различные формы мембраносвязанных IgE, как с сегментом из 52 аминокислот, известным как М1', так и без него [Batista et al., J. Exp. Med. 184: 2197-2205 (1996)], авторы не смогли подтвердить, что в мембраносвязанной форме отсутствует этот сегмент М1'. Общепринятая терапия антителами против IgE, которые связываются с секретируемой формой IgE, приводит к снижению свободных сывороточных, но не тотальных сывороточных IgE. Casale et al., J. Allergy Clin. Immunol. 100 (1): 110-121 (1997).

Кроме того, было отмечено, что в отсутствие сигнала от антигена B-клетки, рецепторы (т.е. иммуноглобулины) которых являются перекрестно связанными, подвержены апоптозу. Неожиданно авторы выявили, что нацеливание на М1'-сегмент IgE посредством антител против IgE может привести к индукции апоптоза B-клеток. Поскольку потомки активированных B-клеток могут привести к плазматическим клеткам, которые образуют и секретируют секретируемую форму IgE, устранение продуцирующих IgE B-клеток через апоптоз обеспечивает новый терапевтический подход для лечения аллергии.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к апоптотическим антителам против IgE, или их функциональным фрагментам, и к их применению для лечения опосредуемых IgE нарушений. Кроме того, изобретение относится к композициям и способам ингибирования продукции IgE и их секреции из B-клеток. Кроме того, изобретение относится к композициям и способам специфичного устранения продуцирующих IgE B-клеток и снижения тотального сывороточного IgE.

В одном варианте осуществления изобретение относится к антителу против IgE/М1', которое специфично связывает М1'-сегмент IgE и которое индуцирует апоптоз в экспрессирующих IgE B-клетках. В конкретном аспекте антитело специфично устраняет продуцирующие IgE B-клетки. В другом конкретном аспекте антитело снижает тотальный сывороточный IgE. В другом конкретном аспекте, антитело снижает как тотальный, так и свободный сывороточный IgE. В следующем конкретном аспекте сывороточный IgE является аллергенспецифичным. В следующем конкретном аспекте антитело связывается с IgE, источником которого является человек, макак-резус и яванский макак. В следующем конкретном аспекте антитело является химерным. В следующем конкретном аспекте антитело является гуманизированным. В следующем аспекте антитело представляет собой антитело человека.

В другом варианте осуществления изобретение относится к антителу против IgE/М1', которое специфично связывается с любым из эпитопов М1', соответствующих пептидам, представленным на фиг.5. В конкретном аспекте антитело специфично связывается с тем же эпитопом, что и эпитоп, связываемый антителом, выбранным из группы, состоящей из 47H4, 7A6, 26A11, 47H4v5, 7A6v1 и 26A11v6. В другом конкретном аспекте антитело связывается с эпитопом, соответствующим пептиду, выбранному из группы, состоящей из пептида 4 (SEQ ID NO:8), пептида 5 (SEQ ID NO:9), пептида 7 (SEQ ID NO:11) или пептида 8 (SEQ ID NO:12). В другом конкретном аспекте антитело связывается с пептидом 4 (SEQ ID NO:8).

В другом варианте осуществления изобретение относится к эпитопу М1' IgE, выбранному из группы, состоящей из пептида 4 (SEQ ID NO:8), пептида 5 (SEQ ID NO:9), пептида 7 (SEQ ID NO:11) или пептида 8 (SEQ ID NO:12). В конкретном аспекте пептид М1' представляет собой пептид 4 (SEQ ID NO:8).

В следующем варианте осуществления изобретение относится к антителу против IgE, которое специфично связывается с М1'-сегментом IgE с аффинностью связывания Скэтчарда в отношении IgE человека, эквивалентной аффинности связывания Скэтчарда для антитела мыши 47H4 против IgE/М1' или его гуманизированного варианта. В конкретном аспекте аффинность эквивалентна аффинности связывания 47H5. В другом конкретном аспекте аффинность составляет от 0,30 до 0,83 нм. В другом конкретном аспекте аффинность эквивалентна аффинности связывания 47H4v5. В следующем конкретном аспекте аффинность составляет приблизительно 1,5 нм.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к антителу против IgE/М1', содержащему области HVR тяжелой цепи и легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.6A-F и фиг.20-25. В конкретном аспекте антитело дополнительно содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей последовательностей антител, представленных на любой из фиг.6A-F и фиг.20-25. В другом конкретном аспекте антитело содержит полноразмерные тяжелые и легкие цепи антител, представленных на любой из фиг.6A-F. В другом конкретном аспекте тяжелые и легкие цепи последовательностей антитела представлены на фиг.6A-F. В следующем конкретном аспекте антитело выбрано из группы, состоящей из 26A11, 26A11v1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6. В следующем конкретном аспекте антитело представляет собой 47H4v5. В следующем конкретном аспекте антитело является афукозилированным.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к композиции, содержащей антитело против IgE/М1', содержащее области HVR тяжелой и легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.6A-F, в сочетании с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем. В конкретном аспекте антитело выбрано из группы, состоящей из 26A11, 26A11v1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6. В другом конкретном аспекте антитело представляет собой 47H4v5. В другом конкретном аспекте антитело является афукозилированным.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к композиции, содержащей антитело против IgE/М1', содержащее области HVR тяжелой и легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.8-13, в сочетании с одним или несколькими лекарственными средствами, выбранными из группы, состоящей из антитела против IgE, антигистамина, бронходилятатора, глюкокортикоида, NSAID, антагониста TNF, антагониста интегрина, иммунодепрессивного средства, антагониста IL-4, антагониста IL-13, двойного антагониста IL-4/IL-13, DMARD, антитела, которое связывается с B-клеточным поверхностным маркером, и антагониста BAFF. В конкретном аспекте композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей области HVR тяжелой цепи антитела против IgE/М1', представленного на любой из фиг.6A-F. В конкретном аспекте выделенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую области HVR легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.6A-F. В другом конкретном аспекте антитело является химерным. В другом конкретном аспекте антитело является гуманизированным. В следующем аспекте антитело представляет собой антитело человека. В следующем конкретном аспекте антитело выбрано из группы, состоящей из 26A11, 26A11v1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6. В следующем конкретном аспекте антитело представляет собой 47H4v5. В следующем конкретном аспекте антитело является афукозилированным. В следующем аспекте нуклеиновая кислота дополнительно содержит вектор, пригодный для экспрессии нуклеиновой кислоты. В следующем конкретном аспекте вектор дополнительно содержит клетку-хозяина, пригодную для экспрессии нуклеиновой кислоты. В следующем конкретном аспекте клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку. В следующем конкретном аспекте эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающих, такую как клетка яичника китайского хомячка (CHO).

В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу получения антитела против IgE/М1', которое специфично связывается с М1'-сегментом IgE, или его функционального фрагмента, включающему культивирование клетки-хозяина, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую такое антитело или фрагмент в форме, пригодной для экспрессии, в условиях, пригодных для продукции такого антитела или фрагмента, и выделение антитела или фрагмента.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к изделию, содержащему контейнер, в котором находится композиция, описанная в настоящем документе, и вкладыш в упаковку с указанием на применение для лечения опосредуемого IgE нарушения. В конкретном аспекте изделие представляет собой флакон. В другом конкретном аспекте изделие представляет собой предварительно заполненный шприц. В другом конкретном аспекте предварительно заполненный шприц, кроме того, находится в инъекционном устройстве. В следующем конкретном аспекте инъекционное устройство представляет собой автоматический впрыскиватель.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу специфичного устранения продуцирующих IgE B-клеток, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела против IgE/М1', которое специфично связывается с М1'-сегментом IgE и индуцирует апоптоз в экспрессирующих IgE B-клетках. В конкретном аспекте антитело содержит области HVR тяжелой и легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.6A-F. В другом конкретном аспекте способ снижает тотальный сывороточный IgE. В другом конкретном аспекте способ снижает как свободный сывороточный, так и тотальный сывороточный IgE. В следующем конкретном аспекте сывороточный IgE является аллергенспецифичным. В следующем конкретном аспекте антитело выбирают из группы, состоящей из 26A11, 26A11v1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6. В следующем конкретном аспекте антитело представляет собой 47H4v5. В следующем конкретном аспекте антитело обладает активностью ADCC.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу лечения опосредуемого IgE нарушения, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела против IgE/М1', которое специфично связывается с М1'-сегментом IgE и индуцирует апоптоз в экспрессирующих IgE B-клетках. В конкретном аспекте антитело специфично устраняет продуцирующие IgE B-клетки. В другом конкретном аспекте антитело снижает тотальный сывороточный IgE. В другом конкретном аспекте антитело снижает как тотальный, так и сывороточный IgE. В следующем конкретном аспекте сывороточные IgE являются аллергенспецифичными. В следующем конкретном аспекте антитело содержит области HVR тяжелой и легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.6A-F. В следующем конкретном аспекте антитело выбрано из группы, состоящей из 26A11, 26A11v1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6. В следующем конкретном аспекте антитело представляет собой 47H4v5. В следующем конкретном аспекте антитело обладает активностью ADCC. В следующем конкретном аспекте опосредуемое IgE нарушение выбрано из группы, состоящей из аллергического ринита, астмы (например, аллергической астмы и неаллергической астмы), атопического дерматита, аллергической гастроэнтеропатии, гиперчувствительности (например, анафилаксии, крапивницы, пищевой аллергии и т.д.), аллергического бронхолегочного аспергиллеза, паразитарных заболеваний, интерстициального цистита, гипер-IgE-синдрома, атаксии-телеангиэктазии, синдрома Вискотта-Олдрича, бестимусной лимфоплазии, IgE-миеломы и реакции "трансплантат против хозяина". В следующем конкретном аспекте опосредуемое IgE нарушение представляет собой пищевую аллергию, анафилаксию, контактный дерматит и аллергическую пурпуру.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу лечения опосредуемого IgE нарушения, включающему введение композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антитела против IgE/М1', которое специфично связывается с М1'-сегментом IgE и индуцирует апоптоз в экспрессирующих IgE B-клетках, в сочетании с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного лекарственного средства, выбранного из группы, состоящей из антитела против IgE, антигистамина, бронходилятатора, глюкокортикоида, NSAID, противоотечного средства, средства от кашля, аналгетика, антагониста TNF, антагониста интегрина, иммунодепрессивного средства, антагониста IL-4, антагониста IL-13, двойного антагониста IL-4/IL-13, DMARD, антитела, которое связывается с B-клеточным поверхностным маркером, и антагониста BAFF. В конкретном аспекте антитело специфично устраняет продуцирующие IgE B-клетки. В другом конкретном аспекте антитело снижает тотальный сывороточный IgE. В другом конкретном аспекте антитело снижает как тотальный, так и свободный IgE. В следующем конкретном аспекте сывороточный IgE является аллергенспецифичным. В следующем конкретном аспекте антитело содержит области HVR тяжелой и легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.6A-F. В следующем конкретном аспекте антитело выбрано из группы, состоящей из 26A11, 26A11v1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6. В следующем конкретном аспекте антитело представляет собой 47H4v5. В следующем конкретном аспекте антитело обладает активностью ADCC.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу лечения опосредуемого IgE нарушения, включающему комбинированную схему лечения, состоящую из введения терапевтически эффективного количества антитела против IgE/М1', которое специфично связывается с М1'-сегментом IgE и индуцирует апоптоз в экспрессирующих IgE B-клетках, до, одновременно или после проведения известного способа лечения аллергических нарушений. В конкретном аспекте сочетание включает введение антитела против IgE, антигистамина, бронходилятатора, глюкокортикоида, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства, иммунодепрессанта, антагониста IL-4, антагониста IL-13, двойного антагониста IL-4/IL-13, противоотечного средства, средства от кашля или аналгетика. В другом конкретном аспекте антитело против IgE/М1' вводят в сочетании со схемой лечения, направленной на снижение чувствительности к аллергену. В конкретном аспекте антитело специфично устраняет продуцирующие IgE B-клетки. В другом конкретном аспекте антитело снижает тотальный сывороточный IgE. В другом конкретном аспекте антитело снижает как тотальный, так и свободный IgE. В следующем конкретном аспекте сывороточный IgE является аллергенспецифичным. В следующем конкретном аспекте антитело содержит области HVR тяжелой и легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.6A-F. В следующем конкретном аспекте антитело выбрано из группы, состоящей из 26A11, 26A11v1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6. В следующем конкретном аспекте антитело представляет собой 47H4v5. В следующем конкретном аспекте антитело обладает активностью ADCC.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу предупреждения индуцированной аллергеном продукции IgE, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела против IgE/М1', которое специфично связывается с М1'-сегментом IgE и индуцирует апоптоз в экспрессирующих IgE B-клетках. В конкретном аспекте антитело содержит области HVR тяжелой и легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.6A-F. В другом конкретном аспекте способ специфично устраняет продуцирующие IgE B-клетки. В другом конкретном аспекте способ снижает тотальный сывороточный IgE. В следующем конкретном аспекте способ снижает как свободный сывороточный, так и тотальный сывороточный IgE. В следующем конкретном аспекте сывороточный IgE является аллергенспецифичным. В следующем конкретном аспекте антитело выбрано из группы, состоящей из 26A11, 26A11v1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6. В следующем конкретном аспекте антитело представляет собой 47H4v5. В следующем конкретном аспекте антитело обладает активностью ADCC.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу снижения индуцируемой аллергеном продукции IgE, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела против IgE/М1', которое специфично связывается с М1'-сегментом IgE и индуцирует апоптоз в экспрессирующих IgE B-клетках. В конкретном аспекте антитело содержит области HVR тяжелой и легкой цепи антитела, представленного на любой из фиг.6A-F. В другом конкретном аспекте способ специфично устраняет продуцирующие IgE B-клетки. В другом конкретном аспекте способ снижает тотальный сывороточный IgE. В следующем конкретном аспекте способ снижает как свободный сывороточный, так и тотальный сывороточный IgE. В следующем конкретном аспекте сывороточный IgE является аллергенспецифичным. В следующем конкретном аспекте антитело выбрано из группы, состоящей из 26A11, 26A11v1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6. В следующем конкретном аспекте антитело представляет собой 47H4v5. В следующем конкретном аспекте антитело обладает активностью ADCC.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к композиции, пригодной для любого из ранее описанных способов.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к применению композиции для любого из описанных ранее способов.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к гибридоме мыши, депонированной в ATCC 21 марта 2007 года, с обозначением, выбранным из группы, состоящей из 7A6.18, 1C11.10.20, 47G4.6.2, 47H4.12.10, 42H4.6.9, 42A5.20.11, 26A11.6.5, 51D2.22.15, 45C1.6.14, 26B11.3.12, 28E9.12.9. В конкретном аспекте изобретение относится к антителу, секретируемому депонированной гибридомой.

В следующем варианте осуществления изобретение относится к трансгенному животному, у которого экспрессируется М1'-сегмент человека в IgE.

Краткое описание рисунков

На фиг.1A-B представлено выравнивание выбранных участков константной цепи IgE человека (SEQ ID NO:1), макака-резус (SEQ ID NO:2) и яванского макака (SEQ ID NO:3). Представлено приблизительное расположение трансмембранных и внутриклеточных доменов CH2, CH3, CH4, М1'.

На фиг.2A-C представлены графики Скэтчарда для FACS, на которых показана специфичность различных антител против M1'. На фиг.2A-1-2A-6 представлено связывание с короткой формой IgE (без М1'), а на фиг.2B-1-2B-6 представлено связывание с длинной формой (с М1'). На фиг.2C-1-2C-6 представлено связывание с IgE, экспрессируемым клеточной линией U266. Затемненными кривыми показана интенсивность флуоресценции относительно контрольного Ab, а незатемненными кривыми показана относительная флуоресценция тестируемого антитела. На фиг.2D-F представлена специфичность связывания антител мыши 47H4, 26A11 и 7A6 против IgE/М1'. На фиг.2D показано, что 47H4 связывается с IgE/М1' человека, макака-резус и яванского макака, но не с IgE, лишенным М1'. На фиг.2E показано, что 47H4 связывается с U266, а 26A11 и 7A6 не связываются с ним. На фиг.2F показано, что 47H4 и 7A6 связываются с М1' как макака-резус, так и яванского макака, в то время как 26A11 связывается только с М1' макака-резус. На фиг.2G-I показана специфичность связывания гуманизированных антител 47H5v.5, 26A11v6 и 7A6v1 против IgE/М1'. На фиг.2G показано, что все три гуманизированных варианта 47H4v5, 26A11v6 и 7A6v1 являются специфичными к IgE-М1', но не к IgE, лишенному М1'. На фиг.2H показано, что варианты 47H4v5 и 26A11v6 (но не 7A6v1) связывают U266. На фиг.2I показано, что 47H4v5 и 7A6v1 связывает М1' макака-резус и яванского макака, а 26A11v6 связывает только М1' макака-резус.

На фиг.3A-L представлены графики FACS, на которых показана относительная аффинность связывания различных антител против M1' с использованием серийных разведений, показанных на фиг.3M. На фиг.3N представлена относительная аффинность для каждого антитела. На фиг.3O обобщенно представлена аффинность антител мыши 47H4, 26A11 и 7A6, при определении анализом Скэтчарда, против М1' человека, макака-резус и яванского макака. Если нет иных указаний, представленные числа представляют собой средние значения. На фиг.3P обобщенно представлена аффинность указанных гуманизированных вариантов антител 47H4 и 26A11, при измерении посредством анализа Скэтчарда, против М1' человека, макака-резус и яванского макака.

На фиг.4A-D представлено исследование относительного связывания/блокирования антител против M1'. На фиг.4A-1-4A-20 представлены графики FACS, на которых показаны антитела, которые блокировали или частично блокировали связывание. На фиг.4B представлен двумерный график, на котором показана относительная способность блокировать связывание других антител (частично или полностью с использованием молярного отношения 1:1). На фиг.4C представлен двумерный график, который в большей степени сфокусирован на конкретно указанных антителах и в котором исследование блокирования повторяли с молярным отношением 10:1. На фиг.4D представлена схема, на которой представлено распределение по группам в результате исследований связывания/блокирования эпитопа.

На фиг.5A-C показаны исследования связывания эпитопов, проводимые с использованием 47H4, 7A6 и 26A11. На фиг.5A показан М1'-сегмент, включающий соседние N- и C-концевые остатки (SEQ ID NO:3) и пептиды 1-5 М1' (SEQ ID NO:5-19), соответственно, используемые для определения связывания эпитопа. На фиг.5B и 5D показано, что исходные антитела мыши 47H4 связывают пептид 4, 7A6 связывает пептиды 4 и 5, и 26A11 связывает пептиды 7 и 8. На фиг.5C и 5E показано, что гуманизированные варианты 47H4v5 связывают пептид 4, а 7A67v1 связывает пептиды 4 и 5, и 26A11v6 связывает пептиды 7 и 8, сохраняя, таким образом, специфичность к эпитопу исходных антител мыши.

На фиг.6A-F показаны последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей антител мыши 26A11, 7A6 и 47H4 и их различных гуманизированных вариантов. Положения пронумерованы согласно Kabat, и гипервариабельные области, которые пересажены в вариабельную консенсусную рамку (каппа I для легкой цепи, подгруппы III для тяжелой цепи), заключены в прямоугольник. На фиг.6A показаны, относительно легкой цепи каппа I человека (SEQ ID NO:20), вариабельная область легкой цепи 26A11 (SEQ ID NO:21) и гуманизированные варианты 1, 4 (SEQ ID NO:22), варианты 2, 5 (SEQ ID NO:23), варианты 3, 6 (SEQ ID NO:24), варианты 13, 15 (SEQ ID NO:25) и варианты 14, 16 (SEQ ID NO:26). На фиг.6B показаны, относительно легкой цепи каппа I человека (SEQ ID NO:20), вариабельная область легкой цепи 7A6 (SEQ ID NO:27) и гуманизированный вариант 1 (SEQ ID NO:28). На фиг.6C показаны, относительно легкой цепи каппа I человека (SEQ ID NO:20), вариабельная область легкой цепи 47H4 (SEQ ID NO:29) и гуманизированные варианты 1, 3 (SEQ ID NO:30) и варианты 2, 4-6 (SEQ ID NO:31). На фиг.6D показаны, относительно тяжелой цепи III человека (SEQ ID NO:32), вариабельная область тяжелой цепи 26A11 (SEQ ID NO:33) и гуманизированные варианты 1-3, 13, 14 (SEQ ID NO:34) и варианты 4-6, 15, 16 (SEQ ID NO:35). На фиг.6E показаны, относительно тяжелой цепи человека (SEQ ID NO:34), вариабельная область тяжелой цепи 7A6 (SEQ ID NO:36) и гуманизированный вариант 1 (SEQ ID NO:37). На фиг.6F показаны, относительно тяжелой цепи III человека (SEQ ID NO:32), вариабельная область тяжелой цепи 47H4 (SEQ ID NO:38) и гуманизированные варианты 1, 2 (SEQ ID NO:39), варианты 3-4 (SEQ ID NO:40), вариант 5 (SEQ ID NO:41) и вариант 6 (SEQ ID NO:42).

На фиг.7A-G показана апоптотическая активность исходных антител против M1' в трансфицированных IgE-М1' клетках Daudi. На фиг.7A представлен график FACS, на котором, по существу, показано, что IgM экспрессируется на более высоком уровне, чем IgE. На фиг.7B показан эффект перекрестного связывания антител [F(ab')₂] против IgM и применения камптотецина в отношении индукции апоптоза, соответственно. Клетки, положительно окрашенные аннексином, но отрицательно PI, являются погибающими, а клетки, положительно окрашенные как аннексином, так и PI, являются погибшими. На фиг.7C представлено графическое изображение общего наблюдаемого апоптоза, на котором светлым столбцом показаны клетки аннексин-(+) и PI-(-), а темным столбцом показаны аннексин-(+) и PI-(+). На фиг.7D-7G представлено графическое изображение индуцируемого антителами против M1' апоптоза при концентрациях 25, 10, 1, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг/мл. На фиг.7D представлены результаты применения антител М1' группы эпитопа A1, включающих 7A6, 47H4, 47G4, 42A5, 42H4 (вместе с контролями MAE-11 и GP120), без перекрестного связывания. На фиг.7E представлены результаты применения антител М1' группы эпитопа A2, включающих 1C11, 26A11, 51D2, 45Cl) и группы эпитопов B/C, включающих 26B11 и 28E9, без перекрестного связывания. На фиг.7F показана группа эпитопа A1 с перекрестным связыванием, а на фиг.7G показаны группы эпитопов A2 и B/C с перекрестным связыванием.

На фиг.8A-B показана апоптотическая активность гуманизированных вариантов против M1' в клетках Daudi, трансфицированных IgE-М1', обработанных различными гуманизированными вариантами антитела против M1' в концентрациях 25, 10, 1, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг/мл. На фиг.8A показано, что гуманизированные варианты 47H4v5, 26A11v6 и 7A6v1 индуцируют апоптоз в диапазоне 30-40% при концентрации на более высоких уровнях (т.е. 10-25 мкг/мл вариантов 47H4 и 26A11, 1, 10 и 25 мкг варианта 7A6). На фиг.8B показана апоптотическая активность того же антитела в отношении трансфицированных IgE-М1' клеток Daudi, которые обработаны в присутствии перекрестно связывающегося антитела козы против F(ab')₂ IgG человека. Все антитела индуцировали максимальные уровни апоптоза 70-90%, с некоторым снижением апоптотической активности при высоких концентрациях (например, 47H4-v1, -v2, 26A11-v1, -v14). На фиг.8C показано, что 47H4v5 дикого типа и афукозилированное 47H4v5 были способны индуцировать апоптоз на сходных уровнях.

На фиг.9A-B1-2 показана способность антител мыши против M1' индуцировать поток кальция в клетки Daudi-IgE/М1'. Фиг.9A является контролем, демонстрирующим эффект антитела против IgM и MAE11, а на фиг.9B1-B2 показан эффект применения указанных антител мыши против M1'.

На фиг.10 показана способность гуманизированного антитела47H4v5 против IgE/М1' дикого типа (wt) и афукозилированного варианта индуцировать ADCC. В то время как варианты wt и афукозилированные варианты индуцируют сходную максимальную цитотоксичность, афукозилированный вариант ("AF") был более эффективным, чем форма дикого типа (EC50 AF ~0,83 нМ, EC50 wt ~6,6 нМ).

На фиг.11A-F представлены полноразмерные последовательности тяжелых и легких цепей антител мыши против IgE/М1'. Вариабельные области показаны курсивом, а HVR (гипервариабельные области) подчеркнуты. На фиг.11A показаны тяжелая и легкая цепи антитела 7A6 мыши (SEQ ID NO:43 и 44) соответственно. На фиг.11B показаны тяжелая и легкая цепи антитела 47H4 мыши (SEQ ID NO:45 и 46) соответственно. На фиг.11C показаны тяжелая и легкая цепи антитела 26A11 мыши (SEQ ID NO:47 и 48), соответственно. На фиг.11D показаны тяжелая и легкая цепи антитела 45C1 мыши (SEQ ID NO:49 и 50) соответственно. На фиг.11E показаны тяжелая и легкая цепи антитела 28E9 мыши (SEQ ID NO:51 и 52) соответственно. На фиг.11F показаны тяжелая и легкая цепи антитела 1C11 мыши (SEQ ID NOS: 53 и 54) соответственно.

На фиг.12A-I показана способность антител мыши против IgE/М1' ингибировать продукцию сывороточного IgE и продуцирующих IgE плазматических клеток в модели атопии hu-SCID. На фиг.12A представлено графическое изображение схемы эксперимента. На фиг.12B-C показано, что введение антител мыши против IgE/М1' снижало уровни IgE на 65-84%. На фиг.12D-E показано, что снижение продуцирующих IgE клеток in vivo составило 19-69%. На фиг.12F-G показано, что уровни других иммуноглобулинов (например, IgG1-4, IgA, IgM) были относительно неизмененными. На фиг.12H-I показано, что не наблюдалось снижения общего количества плазматических клеток в селезенке.

На фиг.13A-H показан эффект гуманизированного варианта 47H4v5 на уровни иммуноглобулинов в модели атопии hu-SCID. На фиг.13A представлено графическое изображение схемы эксперимента. На фиг.13B-D показано, что сывороточный IgE был снижен на 79% и что продуцирующие IgE плазматические клетки были снижены на 75%. На фиг.13E-F показано отсутствие снижения уровней других сывороточных иммуноглобулинов. На фиг.13G-H показано отсутствие снижения уровней тотальных плазматических клеток, таким образом, демонстрируя, что 47H4 специфично снижает продуцирующие IgE плазматические клетки, которые являются очень небольшой долей тотальных плазматических клеток.

На фиг.14A-D проиллюстрировано получение мышей с включением гена huM1'. На фиг.14A представлено расположение экзона М1' на локусе IgE мыши. На фиг.14B представлена схема рекомбинации в локусе IgE мыши, приводящей к созданию заданного аллеля. На фиг.14C показано генотипирование посредством ПЦР с полосой размером 668 п.н. у мышей wt и с полосой 457 п.н. у мышей с включением М1'. На фиг.14D показан Саузерн-блот, в котором фрагмент HindIII размером 7,4 т.п.н. у мышей wt превращается во фрагмент размером 3 т.п.н. у мышей с включением hu-М1', а фрагмент BamHI размером 14,1 т.п.н. превращается во фрагмент размером 18,1 т.п.н. во включенном аллеле hu-М1'. Показаны мыши как дикого типа, так и гетерозиготные мыши.

На фиг.15A-I показана способность антител против IgE/М1' предотвращать образование IgE при первичном иммунном ответе. На фиг.15A представлена схема, на которой показан временной график схемы эксперимента, включая введение TNP/OVA и антител против IgE/М1'. На фиг.15B представлен график уровней антигенспецифичного IgE с течением времени и показано, что хотя уровни антигенспецифичного IgE у контрольных животных (т.е. gpl20) достигали максимальных уровней от 8 до 14 суток, антитело против IgE/М1' предотвращало какое-либо повышение, и определенные уровни антигенспецифичного IgE не отличались значимо от неиммунизированных мышей. На фиг.15C-D показано, что введение антитела против IgE/М1' предотвращало повышение уровней антигенспецифичного сывороточного IgE на 8 и 14 сутки, соответственно, и они статистически не отличались от уровней у неиммунизированных мышей (фиг.15E). На фиг.15F-I показано, что на уровни антигенспецифичного IgG1 не оказывало значимого воздействия антитело против IgE/М1' на протяжении 28 суток эксперимента (за исключением умеренного различия на 14 сутки).

На фиг.16A-K показана способность антител против IgE/М1' предотвращать образование антигенспецифичного IgE при иммунном ответе памяти или вторичном иммунном ответе. На фиг.16A представлена схема, на которой показан временной график вторичной инъекции TNP-OVA и введения антител против IgE/М1', которое впервые вводили на 28 сутки. На фиг.16B представлен график уровней антигенспецифичного IgE с течением времени и показано, что вторичный IgE-ответ на вспомогательную инъекцию TNP-OVA на 28 сутки является более быстрым, достигая пика через 4 суток, а не через 8-9 суток, как при первичном ответе. На фиг.16C-D показано, что уровни антигенспецифичных IgE у мышей, которым вводили антитело против IgE/М1', были значимо снижены по сравнению с изотипическим контролем на 59-65% к 32 суткам и на 90-93% к 35 суткам. На фиг.16E показано, что к 42 суткам (12 сутки начального введения антитела против IgE), уровни антигенспецифичного IgE снижались до уровня, статистически не отличающегося от контрольных наивных мышей. На фиг.16F-H показано, что от 28 до 49 суток введение антитела против IgE/М1' снижало уровни IgE в сыворотке на 74-84%, и средний суточный уровень антигенспецифичного IgE также снижался на 74-83%. На фиг.16I-K показано, что на уровни антигенспецифичного IgG1 не влияло значимо антитело против IgE/М1'.

На фиг.17A-D проиллюстрирована способность антител против IgE/М1' профилактически снижать продукцию IgE в ответ на инфекцию Nippostrongylus brasiliensis ("NB"). На фиг.17A представлена схема, на которой показана схема эксперимента. Животным проводили введение три раза в неделю, начиная с 0 суток по 21 сутки. На фиг.17B показаны уровни IgE с течением времени в ответ на инфекцию NB с антителом против IgE/М1' и контрольным антителом. На фиг.17C-D показано, что на 15 сутки животные, которым вводили антитело против IgE/М1', имели сниженные уровни IgE в сыворотке, не отличающиеся на статистически значимом уровне от неинфицированных мышей.

На фиг.18A-I проиллюстрирована способность антител против IgE/М1' к терапевтическому лечению максимального ответа IgE на инфекцию Nippostrongylus brasiliensis ("NB"). На фиг.18A представлена схема, на которой показана схема эксперимента. Животным проводили введение три раза в неделю с 11 до 21 сутки. На фиг.18B показаны уровни IgE с течением времени в ответ на инфекцию NB с антителом против IgE/М1' и контрольным антителом. На фиг.18C-D показано, что антитело против IgE/М1' снижало уровни IgE в сыворотке на 82-89% в течение четырех суток введения. На фиг.18E показано, что к 21 суткам уровни IgE у мышей, которым вводили антитело против IgE/М1', снижались у животных на 97-98%, и они достигали уровней, не отличающихся на статистически значимом уровне от неинфицированной контрольной группы. На фиг.18F-G показано, что продуцирующие IgE плазматические клетки (количественно определенные посредством Elispot) в лимфатических узлах и селезенке снижались на 88-94% и 57-66% соответственно. На фиг.18H-I показано, что уровень тотальных плазматических клеток (CD138+) как в лимфатических узлах, так и в селезенке повышался во всех обработанных группах по сравнению с неинфицированными мышами и что введение антитела против IgE/М1' не изменяет значимо общее количество плазматических клеток в каком-либо из органов. Эти результаты демонстрируют способность антител против IgE/М1' снижать уровни IgE в сыворотке посредством устранения проду