Органические соединения

Органические соединения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новой системе селекции для применения в процессе культивирования эукариотических клеток и для экспрессии целевого рекомбинантного продукта. Система селекции основана на введении гена экзогенного функционального связанного с мембраной фолатного рецептора вместе с полинуклеотидом или геном, кодирующим целевой продукт, в эукариотическую клетку и может широко использоваться в эукариотических клетках, клеточная жизнеспособность которых зависит от поглощения фолиевой кислоты.

Предпосылки создания изобретения

Селективные маркеры и системы селекции широко используются в генной инженерии, технологии рекомбинантных ДНК и при получении рекомбинантных продуктов, например антител, гормонов и нуклеиновых кислот, в культуре эукариотических клеток. Основная задача таких доминантных селективных маркеров и систем селекции заключается во введении селективного гена, который под воздействием селективных условий роста обеспечивает способность клеток к образованию высоких уровней целевых рекомбинантных продуктов.

В настоящее время известны 3 селективные маркерные системы:

(а) Глютаминсинтетазная система: фермент глютаминсинтетаза (ГС) ответственен за биосинтез глютамина из глютамата и аммония. Эта биосинтетическая реакция обеспечивает единственный путь образования глютамина в клетках млекопитающих. Соответственно, в отсутствие глютамина в питательной среде, фермент ГС необходим для выживания клеток млекопитающих в культуре. Важно, что определенные линии клеток млекопитающих, включая клетки миеломы мышей, не экспрессируют ГС и таким образом не могут выживать без экзогенно добавленного глютамина. Поэтому такая клеточная линия является соответствующим акцептором для трансфецированного гена ГС, который в этой системе может функционировать в качестве селективного маркера, который дает возможность клеткам расти в среде, не содержащей глютамина. Напротив, клеточные линии, например, широко используемые клетки яичников китайского хомячка (СНО), экспрессируют достаточное количество ГС, чтобы поддерживать рост в среде без глютамина. Поэтому, при использовании таких клеток СНО в качестве реципиентных клеток для тренсфекции гена ГС, можно использовать специфический и сильный ингибитор ГС метионинсульфоксимин (МСО), чтобы ингибировать эндогенную активность ГС для того, чтобы только трансфектанты, экспрессирующие высокие уровни трансфецированного гена ГС, могли выживать в среде без глютамина. Главным недостатком ГС системы является относительно длительное время (т.е. 2-6 месяцев) селективного роста для получения клеток, которые стабильно сверхэкспрессируют интересующий целевой ген. Другим недостатком является частое использование цитотоксического агента МСО для увеличения селективного давления. Присутствие такого цитотоксического агента вместе с целевым рекомбинантным продуктом (например, полипептидом, подобным антителу) может потребовать дополнительных стадий очистки, чтобы удалить этот цитотоксический агент.

(б) Система селекции на основе дигидрофолатредуктазы/метотрексата (МТ): дигидрофолатредуктаза (ДГФР) катализирует НАДФ-зависимое восстановление дигидрофолиевой кислоты до тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФ). Затем ТГФ преобразуется в 10-формил-ТГФ и 5,10-метилен-ТГФ, которые используются в биосинтезе de novo пуринов и тимидилата, соответственно. ДГФ является побочным продуктом каталитической активности тимидилатсинтазы (ТС), которая катализирует конверсию dUMP в dTMP в 5,10-метилен-ТГФ-зависимой реакции. Таким образом, ДГФР играет важную роль в кругообороте кофакторов ТГФ, которые необходимы для биосинтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, необходимых для репликации ДНК. Следовательно, клетки (например, клетки СНО), которые утрачивают ген ДГФР (т.е. путем направленной геномной делеции), могут использоваться в качестве реципиентов для трансфекции гена ДГФР в среде, которая не содержит нуклеотидов. После трансфекции, клетки можно подвергать воздействию постепенного повышения концентраций антифолата МТ, наиболее сильного ингибитора ДГФР (Kd - 1 пМ), таким образом, стимулируя клетки к выработке повышенных уровней ДГФР. При множественных циклах селекции, селективный маркер ДГФР часто подвергается значительной генной амплификации. Кроме того, мутантная мышиная ДГФР с существенной устойчивостью к МТ также может широко использоваться в качестве доминирующего селективного маркера, который заметно усиливает приобретение повышенного уровня МТ-устойчивости в трансфецированных клетках. Основной недостаток селективной системы ДГФР/ МТ заключается в том, что при этом способе используется мутагенный цитотоксический агент (МТ), который может легко изменять генотип реципиентных клеток. Кроме того, необходимо применять специфические меры безопасности, чтобы защитить людей, работающих с такими агентами. Это часто приводит к МТ-устойчивым клеточным популяциям, в которых отсутствует экспрессия целевого гена из-за утраты функциональных мутаций в переносчике восстановленных фолатов (RFC - reduced folate carrier) и/или потери экспрессии гена RFC, обе из которых нарушают поглощение МТ. Другой недостаток заключается в том, что мутагенный лекарственный препарат МТ может легко загрязнять выделяемый сверхэкспрессированный целевой продукт (например, полипептид, например, антитело), содержащийся в питательной среде, из-за чего требуется применение интенсивных, трудоемких и дорогостоящих хроматографических методов, чтобы избавиться от этого мутагенного соединения (МТ). Кроме того, отсутствие МТ в конечном продукте должно быть показано соответствующими анализами.

(в) Система селекции на основе переносчика восстановленных фолатов: переносчик восстановленных фолатов (RFC) представляет универсально экспрессируемый гликопротеин, который служит в качестве главного переносчика для поглощения восстановленных фолатов, например, 5-метил-ТГФ и 5-формил-ТГФ. Однако RFC проявляет очень слабое сродство к окисленному фолату, фолиевой кислоте. Поэтому клетки, у которых утрачена экспрессия RFC или у которых удален геномный локус RFC, могут служить в качестве реципиентов для трансфекции селективного маркерного гена RFC в условиях, при которых восстановленные фолаты, например 5-формил-ТГФ, постепенно изымаются из питательной среды, таким образом, стимулируя клетки к экспрессии повышенных уровней этого переносчика фолатов. Система селекции на основе RFC имеет несколько недостатков: а) Необходимо использовать реципиентные клетки без RFC, у которых эндогенный локус RFC «выбит» или инактивирован путем направленного нокаута или утраты функциональных мутаций, б) RFC обладает чрезвычайно слабым транспортным сродством для фолиевой кислоты и поэтому этот окисленный фолат нельзя использовать для селекции, в) В противоположность настоящей системе на основе фолатного рецептора, которая представляет однонаправленную систему поглощения фолата и которая будет подробно описана ниже, RFC является двунаправленным фолатным переносчиком, который показывает равносильные введение и выведение фолатов. Это означает, что при условиях недостатка фолата сверхэкспрессия RFC может оказаться вредной для реципиентных клеток, которые дополнительно экспортируют фолат посредством сверхэкспрессированного RFC.

Цель настоящего изобретения заключается в предоставлении новой метаболической системы селекции, которая имеет определенные преимущества над указанными выше системами селекции из предшествующего уровня техники. Новая система селекции основана на использовании фолатов в среде для культивирования клеток и на присутствии фолатных рецепторов, введенных посредством вектора экспрессии в рекомбинантную эукариотическую клетку, предназначенную для получения целевого продукта. Этот новый подход не требует делении гена эндогенного фолатного рецептора (FR). После введения вектора, несущего одновременно селективный ген FR и полинуклеотид, кодирующий целевой продукт (например, полипептид), клетки культивируют в селективной среде, содержащей крайне ограниченные концентрации фолатов. Поэтому только клетки, которые очевидно сверхэкспрессируют FR, могут потреблять фолаты, достаточные для устойчивого клеточного роста, репликации ДНК и клеточной пролиферации, таким образом, предоставляя возможность для сверхэкспрессии целевого продукта.

Окисленный фолат, т.е. фолиевая кислота, а также восстановленные производные фолиевой кислоты, известные в качестве восстановленных фолатов или тетрагидрофолатов (ТГФ), представляют группу витаминов В-9, которые являются необходимыми кофакторами и/или коферментами для биосинтеза пуринов, тимидилата и определенных аминокислот в эукариотических клетках, особенно клетках млекопитающих. Кофакторы ТГФ особенно необходимы для репликации ДНК и, следовательно, для клеточной пролиферации. В частности, кофакторы ТГФ функционируют в качестве доноров одноуглеродных единиц в ряде сцепленных метаболических путей, включая de novo биосинтез пуринов и тимидилата, аминокислот, а также метаболизме метиловой группы, включая метилирование CpG-островков ДНК. В частности, кофакторы ТГФ, включая 10-формил-ТГФ (10-СНО-ТГФ) поставляют одноуглеродные единицы в двух ключевых de novo реакциях формилтрансферазы, вовлеченных в de novo биосинтез пуринов. Первый фермент, глицинамидрибонуклеотидтрансформилаза (GARTF - glycinamide ribonucleotide transformylase), вовлечена в образование имидазольного кольца пуринов, а более нижняя по потоку реакция, опосредованная 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибонуклеотид-трансформилазой (AICARTF - 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase), приводит к образованию предшественника пурина инозин-5'-монофосфата (ИМФ). Последний служит в качестве ключевого предшественника АМФ и ГМФ. Более того, 5,10-метилен-ТГФ (5,10-СН₂-ТГФ), является другим важным коферментом ТГФ, который функционирует в качестве ключевого кофактора для фермента тимидилатсинтазы (ТС). ТС катализирует образование тимидинмонофосфата (dTMP) из dUMP. Следовательно, эти фолат-зависимые ферменты являются ключевыми посредниками de novo в биосинтезе пуриновых и тиминовых нуклеотидов, необходимых для репликации ДНК. По существу, эти фолат-зависимые ферменты идентифицированы в качестве мишеней для действия антагонистов фолиевой кислоты, известных в качестве антифолатов. Например, аналог 4-аминофолиевой кислоты аминоптерин и его гомолог 4-амино-10-метилфолиевая кислота, метотрексат (МТ) были первым классом антиметаболитов, которые внедрены в клинику для терапевтического лечения детского острого лимфобластического лейкоза (ОЛЛ). В настоящее время антифолаты являются ключевыми компонентами различных химиотерапевтических режимов, используемых в настоящее время для лечения других злокачественных заболеваний человека, включая остеосаркому, рак молочной железы, первичную лейкому центральной нервной системы, хориокарциному и гестационную трофобластическую неоплазию.

В отличие от большинства прокариот, растения, грибы и определенные простейшие, которые синтезируют свои собственные фолаты, млекопитающие и другие эукариотические виды лишены биосинтеза кофактора ТГФ и поэтому должны получать их из экзогенных источников. В настоящее время известны три независимые транспортные системы, опосредующие поглощение фолатов и антифолатов в клетках млекопитающих:

а) Преобладающая клеточная транспортная система кофакторов восстановленных фолатов является переносчиком восстановленных фолатов (RFC - reduced folate carrier). Переносчик RFC (также известен в качестве представителя 1 семейства переносчиков растворенных веществ 19, SLC19A1) является повсеместно экспрессированным мембранным гликопротеином с молекулярной массой -85 кДа, функционирующим в качестве двунаправленного облегчающего переносчика, который опосредует восходящий транспорт восстановленных фолатов путем обмена органических фосфатов, например, адениновых нуклеотидов, которые, как известно, накапливаются до очень высоких внутриклеточных уровней, а также тиаминмоно- и пирофосфата. RFC проявляет высокую аффинность к кофакторам ТГФ, включая лейковорин (5-формил-ТГФ; Kt = 1 мкМ), в то же время имея только очень слабую транспортную аффинность (Kt = 200-400 мкМ) для фолиевой кислоты, окисленного фолата.

б) Другой способ потребления фолатов представляет протон-сопряженный фолатный переносчик (PCFT - proton-coupled folate transporter, также обозначаемый SLC46A), который недавно был клонирован. PCFT, который, по-видимому, экспрессируется независимо от RFC, оптимально функционирует при кислом значении рН (5,5) и опосредует приток обоих окисленных (например, фолиевой кислоты) и ТГФ кофакторов (т.е. восстановленных фолатов), а также различных гидрофильных антифолатов, включая МТ. PCFT, который показывает оптимальный транспорт фолатов и антифолатов при кислом значении рН (5,5), но не активен при физиологическом значении рН (7,4), играет ключевую роль в абсорбции обоих фолатов и антифолатов в верхнем отделе тонкой кишки.

в) В третьем способе транспорта, на котором основано настоящее изобретение, участвуют фолатные рецепторы (FR - folate receptor). FR являются высокоаффинными фолат-связывающими гликопротеинами, кодируемыми тремя различными генами FRα (FR альфа), FR(3 (FR бета) и FRγ (FR гамма). FRα (или FR-альфа) также известен в качестве фолат-связывающего белка взрослых (или FDP-Adult Folate Binding Protein), а также фолатного рецептора 1 или FOLR (у мышей folbpl), а также в качестве ассоциированного с раком яичника антигена (Ovarian cancer-Associated Antigen) или MOv 18. Рецептор FRJ3 (или FR бета) также известен в качестве рецептора FOLR2 (фетального) и в качестве рецептора FBP/PL-1 (плацентарного). FRγ (или FR гамма) также известен в качестве FOLR3 и в качестве FR-G (см. обзор M.D. Salazar и М. Ratnam, Cancer Metastasis Rev., 26(1), 2007, cc.141-152). Зрелые FR, которые хорошо охарактеризованы, являются гомологичными белками с -70-80% аминокислотной идентичностью и содержат от 229 до 236 аминокислот, а также от двух до трех N-гликозилированных участков. FRα (FR альфа) и FRp (FR бета) являются мембраносвязанными, в частности гликозилфосфатидилинозит (GPI-glycosylphosphаtidylinositol)-заякopeнными, гликопротеинами на поверхности клеток, причем FRγ лишен GPI-якоря и является секретируемым белком. FRα (FR альфа) и FRp (FR бета) проявляют высокую аффинность к фолиевой кислоте (Kd = 0,1-1 нМ), 5,10-дидеазатетрагидрофолиевой кислоте (5,10 dideazatetrahydrofolic acid - DDATHF; лометексол; Ki = 0,4-1,3 нМ, используя [³Н]фолиевую кислоту в качестве субстрата) и BGC945 (который является ингибитором тимидилатсинтазы на основе циклопента[g]хиназолина, специфически транспортируемым исключительно посредством FRα (FR альфа) и не транспортируемый посредством переносчика восстановленных фосфатов) (Kd=1 нМ), но гораздо меньшую аффинность к МТ (Kd>100 нМ). FR-зависимое поглощение фолатов и антифолатов происходит посредством классического механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза. Исследования с использованием нокаута генов показали, что рецептор FRα (FR альфа) (также называемый у мышей Folbp 1) очень важен на стадии раннего эмбрионального развития, и материнское дополнение фолатов спасает от in utero эмбриональной летальности и дает возможность нормального развития плода.

В настоящее время существует потребность в надежной высоко эффективной и рентабельной системе отбора, которая преодолевает один или несколько недостатков известных в настоящее время селективных систем.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к эукариотическому вектору экспрессии, включающему первый полинуклеотид, кодирующий функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор, и второй полинуклеотид, кодирующий целевой продукт.

Настоящее изобретение также относится к эукариотическим клеткам, у которых жизнеспособность клеток зависит от потребления фолиевой кислоты, и в которые устойчиво введен указанный вектор экспрессии таким образом, чтобы клетки экспрессировали функциональный фолатный рецептор, кодируемый этим вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу отбора для получения рекомбинантной эукариотической клетки, способной стабильно экспрессировать с высоким выходом целевой продукт.

Настоящее изобретение может успешно применяться для получения с высоким выходом целевого продукта.

Подробное описание изобретения

В ходе настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что система отбора для получения рекомбинантных эукариотических клеток, способных вырабатывать целевой продукт, может основываться на ограниченной доступности фолата в среде для культивирования клеток. Эта система может применяться широко, т.е. по отношению к эукариотическим клеткам, у которых жизнеспособность зависит от потребления фолата.

Новая система может использоваться для ускоренного отбора, скрининга и создания клонов эукариотических клеток, например, клеток млекопитающих, которые стабильно экспрессируют сверхвысокие уровни рекомбинантных продуктов при отсутствии цитотоксических лекарственных препаратов. Кроме того, и в противоположность другим известным системам отбора, нет существенной потребности (хотя иногда допустимой) в модифицированных клетках, получаемых, например, путем мутации или нокаута эндогенного гена (генов). Поскольку, например, FRα (FR альфа) проявляет более высокую аффинность к ФК (К_D=0,1 нМ), чем, например, RFC к лейковорину (Kt = 1 мкМ), и транспортирует фолиевую кислоту в клетки посредством однонаправленного пути, настоящее изобретение предусматривает применение FRα (FR альфа) и других фолатных рецепторов в качестве явно улучшенного основного метаболического селективного маркера, в частности, посредством постепенного . истощения фолатов (например, фолиевой кислоты) в питательной среде. Новая селекция на основе фолатов является успешной стратегией, которая пригодна для ускоренной и стабильной сверхэкспрессии на высоком уровне целевых белков в культивируемых клетках млекопитающих при отсутствии отбора на основе цитотоксических лекарственных препаратов, которая обычно применяется в различных системах сверхэкспрессии.

Новая система селекции проявляет несколько важных преимуществ по сравнению с известными в данной области доступными системами отбора.

1. Система отбора по настоящему изобретению представляет очень быстро действующую систему: в течение четырех недель истощения фолиевой кислоты можно легко получить производные от популяции клеток или клеточного клона, экспрессирующие целевой ген. Это отличается от указанной выше системы ГС, которая может потребовать 2-6 месячного отбора и стабилизации целевого гена.

2. Система отбора по настоящему изобретению не требует геномной делеции или ослабления эндогенных генов FRα (альфа), β (бета) или γ (гамма) перед трансфекцией и поэтому может применяться к любой реципиентной клетке, даже при некоторой экспрессии эндогенных генов FR. Это основное преимущество основано на том факте, что после трансфекции FRα (FR альфа) клетки могут подвергаться внезапному и сильному истощению фолатов (например, фолиевой кислоты) в питательной среде. В результате только трансфецированные клетки, которые экспрессируют значительные количества селективного маркера FRα (FR альфа), могут транспортировать достаточное количество фолата для устойчивой репликации ДНК и клеточной пролиферации. Это происходит при отсутствии какого-либо значительного повышения экспрессии эндогенного гена FRα (FR альфа). Это является отличием от указанной выше системы ДГФР/МТ, в которой у реципиентных клеток часто удален эндогенный ген ДГФР (например, клетки СНО DG44 и СНО Dux).

в) Система отбора по настоящему изобретению не нарушается из-за утраты строгости отбора из-за ослабления селективного давления через повышенную экспрессию других путей поглощения фолатов, включая повышенную экспрессию эндогенного RFC. Это важное преимущество обусловлено тем, что если FRα (FR альфа) имеет высокую аффинность к фолиевой кислоте (Kd = 0,1 нМ), RFC проявляет чрезвычайно слабое сродство к фолиевой кислоте (Km = 0,2-0,4 мМ). Напротив, другие различные системы отбора в предшествующем уровне техники, включая систему ДГФР/МТ, могут нарушаться из-за существенной утраты строгости отбора, поскольку в результате отбора по МТ могут часто возникать МТ-устойчивые клетки, которые не имеют или имеют слабую экспрессию селективного маркера. Взамен, утрата функции RFC часто приводит к частому механизму устойчивости к М первоначального транспортера МТ. Установлено, что это происходит из-за частого появления инактивирующих мутаций в гене RFC или серьезной потери экспрессии гена RFC.

г) В системе отбора по настоящему изобретению не используют цитотоксический лекарственный агент и/или мутагенное соединение, например, МТ в системе ДГФР или МСО в системе ГС, которые могут изменить генотип реципиентных клеток, а также исследуемого целевого гена. Скорее, FR отбор использует принцип недостаточности витамина в питательной среде.

Соответственно, одна из задач, решаемая в настоящем изобретении, относится к эукариотическому вектору экспрессии, включающему первый полинуклеотид, кодирующий функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор (т.е. селективный маркерный ген), и второй полинуклеотид, кодирующий целевой продукт.

Функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор по настоящему изобретению в частности характеризуется в качестве функционального связанного с мембраной рецептора, способного к однонаправленному импорту или поступлению фолата в эукариотическую клетку.

Фолат в соответствии с настоящим изобретением может быть либо окисленным фолатом (т.е. фолиевой кислотой), либо восстановленным фолатом. В общем, в настоящем изобретении может применяться такой фолат, который способен поступать в эукариотическую клетку посредством функционального связанного с мембраной фолатного рецептора. Предпочтительным примером окисленного фолата является фолиевая кислота. Предпочтительным примером восстановленного фолата являются 5-метилтетрагидрофолиевая кислота, 5-формилтетрагидрофолиевая кислота, 10-формилтетрагидрофолиевая кислота и 5,10-метилентетрагидрофолиевая кислота.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии по настоящему изобретению способен к экспрессии в эукариотической клетке и функционального связанного с мембраной фолатного рецептора, и целевого продукта.

Целевой продукт, кодируемый вторым полинуклеотидом, может быть каким-либо биологическим продуктом, который может вырабатываться благодаря транскрипции, трансляции или какого-либо другого события экспрессии генетической информации, кодируемой вторым полинуклеотидом. В этом отношении, продукт будет являться продуктом экспрессии. Например, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения такой продукт выбирают из группы, состоящей из полипептида, РНК и ДНК. «Полипептид» относится к молекуле, включающей полимер из аминокислот, связанных вместе полипептидными связями (связью). Понятие «полипептид» включает полипептиды какой-либо длины, которые могут называться «белком» в случае более крупной молекулы (включающей, например, примерно более 50 аминокислот) или «пептидом», в случае меньшей молекулы (включающей, например, 2-49 аминокислот). Продукт может являться фармацевтически или терапевтически действующим соединением или инструментом исследования, используемым в анализах, и другим подобным соединением. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения продукт является полипептидом, предпочтительно фармацевтически или терапевтически действующим полипептидом, или инструментом исследования, используемым в диагностических или других анализах, и другим подобным соединением. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, полипептид является молекулой иммуноглобулина или антителом, или их фрагментом (особенно функциональным фрагментом), например химерным, или частично или полностью гуманизированным антителом. Такое антитело может представлять диагностическое антитело, или фармацевтически или терапевтически действующее антитело. Обычно целевой продукт может быть гетерологичным в отношении эукариотической клетки-хозяина, используемой для экспрессии, что означает, что до трансфекции клетка-хозяин не производит целевой продукт естественным образом или эндогенно. Точнее, чтобы получить продукцию или экспрессию целевого продукта, необходимо ввести в эукариотическую клетку-хозяина полинуклеотид, кодирующий интересующий продукт, в частности путем трансфекции вектором экспрессии по настоящему изобретению.

Вектор по настоящему изобретению может быть представлен в линейной форме или, предпочтительно, в кольцевой форме, например, в форме плазмиды.

Векторы, используемые для экспрессии целевого полинуклеотида, обычно содержат элементы контроля транскрипции, пригодные для проведения транскрипции, например, промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, сигналы транскрипционной паузы или терминации. Если целевым продуктом является белок, в вектор обычно включают соответствующие элементы контроля трансляции, например, 5' нетранслируемые области, ведущие к 5' кэп-структурам, пригодным для рекрутинга рибосом, и стоп-кодоны для остановки процесса трансляции. В частности, оба полинуклеотида, полинуклеотид, служащий в качестве селективного маркерного гена, а также полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, могут транскрибироваться под контролем элементов транскрипции, присутствующих в соответствующих промоторах. Получаемые в результате транскрипты обоих генов, гена селективного маркера и гена, целевого продукта, содержат функциональные элементы трансляции, которые способствуют получению существенных уровней экспрессии белка (т.е. трансляции).

Таким образом, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к вектору экспрессии по настоящему изобретению, в котором первый полинуклеотид и второй полинуклеотид находятся под контролем отдельных промоторов транскрипции. В общем, пригоден промотор, способный стимулировать экспрессию, в особенности транскрипцию, первого и/или второго полинуклеотида в эукариотической клетке. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, отдельные транскрипционные промоторы являются идентичными. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения отдельные транскрипционные промоторы являются различными. Предпочтительно, транскрипционные промоторы выбирают из группы, состоящей из промотора SV40, мышиного промотора цитомегаловируса (ЦМВ), промотора EF1 альфа, промотора RSV, промотора BROAD3, промотора rosa 26, промотора pCEFL и промотора β-актина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения промотор, контролирующий транскрипцию первого полинуклеотида и/или второго полинуклеотида, является промотором ЦМВ или, наиболее предпочтительно, промотором SV40. В особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения промотор, контролирующий транскрипцию первого полинуклеотида, является промотором SV40.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в векторе экспрессии по настоящему изобретению первый полинуклеотид и второй полинуклеотид находятся под контролем общего промотора транскрипции. Предпочтительно такой промотор транскрипции выбран из группы, состоящей из промотора SV40, промотора ЦМВ, промотора RSV, промотора BROAD3, мышиного промотора rosa 26, промотора pCEFL и промотора β-актина. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в вектора экспрессии общий транскрипционный промотор является промотором SV40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии, имеющий такой общий промотор транскрипции, включает элемент IRES, функционально локализованный между первым полинуклеотидом и вторым полинуклеотидом.

Связанный с мембраной фолатный рецептор, который вводят в эукариотическую клетку-хозяина посредством вектора экспрессии, используемого в соответствии с настоящим изобретением, можно получить от какого-либо вида, если он будет функционировать в рамках настоящего изобретения, т.е. будет совместим с используемой эукариотической клеткой. Предпочтительно используют фолатный рецептор, полученный от вида млекопитающего, например полученный от грызуна, или, наиболее предпочтительно, фолатный рецептор человека. В общем, фолатный рецептор, вводимый в эукариотическую клетку-хозяина и используемый в качестве селективного Маркера, может быть гомологичным или гетерологичным эндогенному фолатному рецептору клетки-хозяина. Когда он гомологичен, его получают из того же вида, что и клетку-хозяина, и он может, например, быть идентичным эндогенному фолатному рецептору клетки-хозяина. Когда он является гетерологичным, его получают из другого вида, иного, чем вида, от которого получены клетки-хозяева, и таким образом он может отличаться от эндогенного фолатного рецептора клетки-хозяина. Обычно вводимый фолатный рецептор, используемый в качестве селективного маркера, может быть гетерологичным клетке-хозяину. Например, фолатный рецептор, полученный от человека, может использоваться в качестве селективного маркера для клеток-хозяев грызуна, например, клеток СНО.

Предпочтительно, функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор, кодируемый первым нуклеотидом вектора экспрессии по настоящему изобретению, выбран из группы, состоящей из фолатного рецептора FRα (FR альфа), FRP (FR бета) и их функциональных мутантов. Функциональный мутант включает производное фолатного рецептора, которое функционирует физиологическим способом, т.е. способен поглощаться эукариотической клеткой и поддерживать жизнеспособность клетки через фолатный метаболизм клетки. Например, мутантная форма фолатного рецептора может включать одну или несколько аминокислотных мутаций по типу замещения, делеции и/или добавления, а также химическое производное, причем химическая часть, подобная полимеру, например, структуры полиэтиленгликоля (ПЭГ), присоединена к фолатному рецептору. Предпочтительно, фолатный рецептор, кодируемый первым полинуклеотидом, является фолатным рецептором альфа (hFRα) человека, фолатным рецептором бета (hFRP) человека или их функциональным мутантом. Наиболее предпочтителен фолатный рецептор альфа (hFRα) человека, предпочтительно имеющий следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO 1, однобуквенный код, показанный в направлении от N-конца к С-концу):

MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фолатному рецептору бета (hFRP) человека, имеющему следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO 2, однобуквенный код, показанный в направлении от N-конца к С-концу):

MVWKWMPLLLLLVCVATMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQTWRKERFLDVPLCKEDCQRWWEDCHTSHTCKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTFESYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVARFYAAAMHVNAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLWLLG

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фолатному рецептору, который в своей естественной среде не связан с мембраной. Такой не связанный с мембраной рецептор можно видоизменить, чтобы связать с мембраной, например, предусматривая гибридный белок между не связанным с мембраной фолатным рецептором и трансмембранной областью другого полипептида. Также возможны другие мутантные формы, которые легко доступны квалифицированным специалистам в данной области. Предпочтительные примеры в этом отношении могут базироваться на растворимом фолатном рецепторе гамма (FRγ), предпочтительно растворимом фолатном рецепторе гамма (FRγ) человека. В наиболее предпочтительном варианте осуществления растворимый фолатный рецептор гамма (FRγ) человека может иметь следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO 3, однобуквенный код, показанный в направлении от N-конца к С-концу):

MDMAWQMMQL LLLALVTAAG SAQPRSARAR TDLLNVCMNA KHHKTQPSPE DELYGQCSPW KKNACCTAST SQELHKDTSR LYNFNWDHCG KMEPTCKRHF IQDSCLYECS PNLGPWIRQV NQSWRKERIL NVPLCKEDCE RWWEDCRTSY TCKSNWHKGW NWTSGINECP AGALCSTFES YFPTPAALCE GLWSHSFKVS NYSRGSGRCI QMWFDSAQGN PNEEVAKFYA AAMNAGAPSR GIIDS

которая затем может быть генетически изменена или может быть получено ее производное для создания функционального связанного с мембраной фолатного рецептора, способного потреблять фолат в контексте настоящего изобретения.

В другом объекте настоящего изобретения вектор экспрессии по настоящему изобретению может дополнительно включать один или несколько других полинуклеотидов, кодирующих один или несколько дополнительных селективных маркеров. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для его оптимального выполнения можно применять совместный отбор с применением фолатной системы по настоящему изобретению вместе с одной или несколькими различными системами селекции (например, неомицин/0418).

В другом объекте настоящее изобретение относится к эукариотической клетке, клеточная жизнеспособность которой зависит от поглощения фолата, и в которую стабильно введены первый полинуклеотид, локализованный на векторе экспрессии и кодирующий функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор, и второй полинуклеотид, локализованный на векторе экспрессии и кодирующий интересующий продукт, причем первый полинуклеотид и второй полинуклеотид локализованы на одном и том же векторе экспрессии или на разных векторах экспрессии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор и целевой продукт экспрессируются эукариотической клеткой.

Помимо функционального связанного с мембраной фолатного рецептора, введенного в клеточную линию посредством вектора экспрессии, эукариотическая клетка в соответствии с настоящим изобретением может включать по меньшей мере одну эндогенную однонаправленную функциональную фолатную транспортную систему, в частности один или несколько эндогенных функциональных связанных с мембраной фолатных рецепторов. Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что способ отбора, представленный в настоящем описании ниже, может использоваться даже в присутствии такой эндогенной однонаправленной функциональной фолатной транспортной системы, т.е. там, где сохраняется такая эндогенная система. Соответственно, другой предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к эукариотической клетке настоящего изобретения, включающей по меньшей мере одну эндогенную однонаправленную функциональную фолатную транспортную систему, в которой такая эндогенная однонаправленная функциональная фолатная транспортная система предпочтительно включает по меньшей мере один эндогенный функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эндогенный функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор выбран из группы, состоящей из фолатного рецептора альфа (FRα) и фолатного рецептора бета (FRP).

Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к эукариотической клетке по настоящему изобретению, в которой эндогенная однонаправленная функциональная фолатная транспортная система, например, включающая по меньшей мере один эндогенный функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор, не имеет полной активности, т.е. является ослабленной. Такое ослабление можно обеспечить, например, посредством какого-либо типа мутагенеза рассматриваемой эндогенной фолатной транспортной системы, например, эндогенного функционального связанного с мембраной фолатного рецептора, например, путем точечной мутации, генного разрушения и т.п. Ослабление может быть частичным или полным. В последнем случае эукариотическая клетка по настоящему изобретению не включает эндогенную однонаправленную функциональную фолатную транспортную систему, например, эндогенный функциональный связанный с мембраной фолатный рецептор. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к такой эукариотической клетке, в которую стабильно введен вектор