Способы выявления воспалительного заболевания кишечника

Способы выявления воспалительного заболевания кишечника

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к профилям экспрессии генов в патогенезе воспалительного заболевания кишечника. Это открытие применимо в выявлении и диагностике воспалительного заболевания кишечника.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Воспалительное заболевание кишечника (IBD), хроническое воспалительное расстройство желудочно-кишечного тракта, которым в США страдает приблизительно один миллион пациентов, состоит из двух основных групп заболеваний: язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD). При обеих формах IBD микроорганизмы кишечника могут инициировать заболевание у генетически предрасположенных индивидов. UC часто ограничивается толстым кишечником, в то время как CD, как правило, возникает в подвздошной кишке тонкого кишечника и в толстом кишечнике (Podolsky, D.K., N. Engl. J. Med. 347:417-429 (2002)). Определение профиля экспрессии генов в тканях пациентов с IBD обеспечило некоторое понимание возможных мишеней для лечения и/или диагностики (см., например, Dieckgraefe, B.K. et al., Physiol. Genomics 4:1-11 (2000); Lawrance I.C. et al., Hum Mol Genet. 10:445-456 (2001); Dooley T.P. et al., Inflamm. Bowel Dis. 10:1-14 (2004); и Uthoff S.M., Int J Oncol. 19:803-810 (2001)). Другие исследования нарушения регуляции генов у пациентов, страдающих воспалительным заболеванием кишечника, включают, например, исследование Lawrance, I.C. et al., которые описали характерные профили генной экспрессии для нескольких генов при UC и CD (Lawrance, I.C. et al., Human Mol. Genetics 10(5):445-456 (2001)). Uthoff, S.M.S. et al. описали идентификацию генов-кандидатов для UC и CD с использованием анализа на микрочипах (Uthoff, S.M.S. et al., Int'l. J. Oncology 19:803-810 (2001)). Dooley, T.P. et al. описали корреляцию экспрессии генов при IBD с медикаментозным лечением нарушения (Dooley, T.P. et al., Inflamm. Bowel Dis. 10(1):1-14 (2004)).

Существует необходимость в идентификации дополнительных биологических маркеров воспалительного заболевания кишечника для применения в диагностике этого хронического заболевания. Настоящее описание удовлетворяет эту необходимость.

Полное содержание всех цитированных в настоящем описании документов включено в настоящий документ в качестве ссылки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе описано уникальное открытие того, что члены суперсемейства генов LY6 активированы на поверхности эпителиальных клеток кишечника (IEC) в моделях колита на мышах и в ткани кишечника пациентов (людей), страдающих IBD, причем эти гены не экспрессируются на здоровых IEC. Большинство членов семейства LY6 представляют собой GPI-заякоренные гликопротеины клеточной поверхности, широко распространенные на клетках гематопоэтического происхождения и более ограниченно экспрессирующиеся на негематопоэтических клетках. Несмотря на широкое применение в качестве маркеров дифференцировки иммунных клеток (Sunderkotter, C. et al., J. Immunol. 172:4410-4417 (2004)), функции семейства LY6 трудно установить (Shevach, E.M. и P.E. Korty, Immunol. Today 10:195-200 (1989)). В отчетах показано, что молекулы LY6 вовлечены в ряд различных функций, включая активацию T-клеток (Zhang, Z.X. et al., Eur. J. Immunol. 32:1584-1592 (2002) и Henderson, S.C. et al., J. Immunol. 168:118-126 (2002)), обоняние (Chou, J.H. et al., Genetics 157:211-224 (2001)) и адгезию клеток (Jaakkola, I. et al., J. Immunol. 170:1283-1290 (2003)).

В наиболее широком смысле изобретение относится к способу выявления повышенной экспрессии генов семейства генов LY6 человека в ткани кишечника первого млекопитающего, страдающего расстройством кишечника, по сравнению с контрольным млекопитающим. Более конкретно, ожидается, что способ будет применим для диагностики расстройств, связанных с нарушениями кишечника, ассоциированными с экспрессией LY6H, LYPD1, LYPD3 и LYPD5 человека, эти расстройства включают, но не ограничиваются ими, воспалительное заболевание кишечника (IBD), такое как язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD). В одном варианте осуществления способ по изобретению пригоден для выявления лиц, отвечающих и не отвечающих на терапевтическое лечение IBD. В одном варианте осуществления IBD представляет собой язвенный колит (UC). В одном варианте осуществления IBD представляет собой болезнь Крона (CD). В одном варианте осуществления ткань кишечника представляет собой ткань толстого кишечника. В одном варианте осуществления ткань толстого кишечника представляет собой сигмовидную кишку. В одном варианте осуществления экспрессия генов LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 повышена в ткани кишечника (такой как ткань толстого кишечника) млекопитающего с IBD, UC или CD по сравнению с нормальным кишечником (таким как нормальная ткань толстого кишечника) млекопитающего, не страдающего IBD, CD или UC. В одном варианте осуществления ген LY6H включает нуклеиновую кислоту SEQ ID NO:1 и кодирует полипептид LY6H, включающий SEQ ID NO:2. В одном варианте осуществления ген LYPD1 включает нуклеиновую кислоту SEQ ID NO:3 или 4 и кодирует полипептид LYPD1, включающий SEQ ID NO:5. В одном варианте осуществления ген LYPD3 включает нуклеиновую кислоту SEQ ID NO:6 и кодирует полипептид LYPD3, включающий SEQ ID NO:7. В одном варианте осуществления ген LYPD5 включает нуклеиновую кислоту SEQ ID NO:8 или 9 и кодирует полипептид LYPD5, включающий SEQ ID NO:10.

В одном варианте осуществления способ по изобретению включает получение образца ткани у тестируемого млекопитающего, предположительно страдающего расстройством кишечника, контактирование ткани с детектируемым средством, которое взаимодействует с белком LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, или с нуклеиновой кислотой, кодирующей LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, и определение уровня экспрессии LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 по сравнению с контрольной тканью. В одном варианте осуществления повышенная экспрессия LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 по сравнению с контролем указывает на IBD у тестируемого млекопитающего. В одном варианте осуществления повышенная экспрессия LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в тестируемой ткани кишечника по сравнению с контрольной тканью кишечника указывает на UC у тестируемого млекопитающего. В одном варианте осуществления повышенная экспрессия LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в тестируемой ткани кишечника по сравнению с контрольной тканью кишечника указывает на CD у тестируемого млекопитающего. В одном варианте осуществления ткань или клетки тестируемого и контрольного млекопитающих представляют собой ткань или клетки из толстого кишечника.

В одном варианте осуществления экспрессию LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 определяют посредством выявления экспрессии генов, например посредством выявления мРНК, кодирующей LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в образце ткани или клеток. В одном варианте осуществления контрольный образец представляет собой образец ткани или клеток того же типа ткани или клеток, полученный у млекопитающего, о котором известно, что оно не страдает желудочно-кишечным расстройством, таким как IBD, UC или CD. В одном варианте осуществления контрольный образец представляет собой универсальный стандарт, содержащий РНК из нескольких нормальных тканей или из множества клеточных линий. В анализе на микрочипах такие универсальные стандарты пригодны для мониторинга и контроля внутриэкспериментальных и межэкспериментальных вариаций. В одном варианте осуществления универсальный стандарт (или универсальную стандартную РНК (URR)) получают, как описано в Novoradovskaya, N. et al. (2004) BMC Genomics 5:20, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. В одном варианте осуществления для применения в качестве контроля в анализе на микрочипах РНК мыши, URR представляет собой универсальную стандартную РНК мыши от Stratagene® (каталожный #740100, Stratagene®, La Jolla, CA). В одном варианте осуществления для применения в качестве контроля в анализе на микрочипах РНК человека, URR представляет собой универсальную стандартную РНК человека от Stratagene® (каталожный #740000). В одном варианте осуществления для применения в качестве контроля в анализе на микрочипах РНК крысы, URR представляет собой универсальную стандартную РНК крысы от Stratagene® (каталожный #740200). В одном варианте осуществления, где РНК представляет собой РНК мыши, клеточные линии, из которых экстрагирована тотальная РНК, включают клеточные линии, полученные из эмбриона, фибробластов эмбриона, почки, гепатоцитов печени, альвеолярных макрофагов легких, B-лимфоцитов, T-лимфоцитов (тимус), молочной железы, мышечных миобластов, кожи и семенника. В одном варианте осуществления, где РНК представляет собой РНК человека, клеточные линии, из которых экстрагирована тотальная РНК, включают клеточные линии, полученные из аденокарциномы молочной железы, гепатобластомы печени, аденокарциномы шейки матки, эмбриональной карциномы или карциномы яичка, глиобластомы головного мозга, меланомы, липосаркомы, гистиоцитарной лимфомы (макрофаги, гистоциты), T-лимфобластного лейкоза, B-лимфобластной плазмацитомы и меланомы. В одном варианте осуществления, где РНК представляет собой РНК крысы, клеточные линии, из которых экстрагирована тотальная РНК, включают клеточные линии, полученные из крови при базофильном лейкозе, из крови при T-лимфоцитарной лимфоме, из B-лимфобластной гибридомы крови, глиомы мозга, карциномы желточного мешка эмбриона, нормальных фибробластов эмбриона, нормальной почки, гепатомы печени, нормальных альвеолярных макрофагов легкого, нормальных альвеолярных клеток II типа легкого, аденокарциномы молочной железы, мышечных миобластов, нормальной кожи и опухоли клеток Лейдига семенника.

В одном аспекте изобретение относится к изделию, содержащему контейнер и композицию, содержащуюся в контейнере, где композиция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, или комплементарную ей нуклеиновую кислоту, и/или антитело или антитела против LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, или их связывающий LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 фрагмент, где нуклеиновые кислоты и/или антитела являются детектируемыми. В одном варианте осуществления композиция содержит детектирующие средства для детекции связывания нуклеиновых кислот, таких как, но не ограничиваясь ими, нуклеиновые кислоты, кодирующие LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, или комплементарные им нуклеиновые кислоты, с нуклеиновой кислотой LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в образце ткани тестируемого млекопитающего, предположительно страдающего расстройством кишечника. В одном варианте осуществления композиция содержит детектирующие средства для детекции антитела, связывающегося, например, с LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в образце ткани тестируемого млекопитающего, предположительно страдающего расстройством кишечника. В одном варианте осуществления антитело композиции является детектируемо меченным. В одном варианте осуществления антитело композиции детектируют с помощью второго антитела, это второе антитело является детектируемым или является детектируемо меченным. Кроме того, изделие необязательно может содержать ярлык, прикрепленный к контейнеру, или вкладыш в упаковку, включенный вместе с контейнером, которые относятся к применению нуклеиновой кислоты LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 или комплементарной ей нуклеиновой кислоты и/или антитела против LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 или его связывающего LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 фрагмента для выявления повышенной экспрессии LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в ткани кишечника, включая, но не ограничиваясь этим, ткань толстого кишечника. В одном варианте осуществления расстройство кишечника представляет собой IBD. В одном варианте осуществления расстройство кишечника представляет собой UC или CD. В одном варианте осуществления полипептид LYPD1 и антитело против LYPD1 представляют собой полипептид и антитело, как описано в US 7157558 и US 7144990 соответственно.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики наличия расстройства кишечника у млекопитающего, включающему детекцию уровня экспрессии гена, кодирующего полипептид LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 (a) в тестируемом образце ткани или клеток, полученном у указанного млекопитающего, и (b) в контрольном образце известных нормальных клеток у млекопитающего, не страдающего расстройством кишечника, из ткани того же происхождения или типа, где более высокий уровень экспрессии полипептида LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в тестируемом образце, по сравнению с контрольным образцом, указывает на наличие расстройства кишечника у млекопитающего, у которого был получен тестируемый образец. В одном варианте осуществления расстройство кишечника представляет собой IBD. В одном варианте осуществления IBD представляет собой UC. В одном варианте осуществления IBD представляет собой CD. В одном варианте осуществления детекцию проводят посредством контактирования антитела с полипептидом LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, или связывающего фрагмента антитела, с тестируемым и контрольным образцами и определения относительного количества образования комплекса антитело-полипептид. Более высокий уровень образования комплекса антитело-полипептид в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом указывает на расстройство кишечника, такое как IBD, UC или CD, у тестируемого млекопитающего. Антитело по изобретению является детектируемо меченным, или, альтернативно, антитело выявляют посредством последующего связывания второго антитела, которое является детектируемым.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу диагностики наличия расстройства кишечника у млекопитающего, включающему (a) контактирование тестируемого образца, содержащего ткань или клетки, полученные у тестируемого млекопитающего, с олигонуклеотидом, который гибридизуется в условиях высокой строгости с нуклеиновой кислотой LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 (или комплементарной ей нуклеиновой кислотой) или антителом, которое специфично связывается с полипептидом LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, и (b) детекцию образования комплекса между олигонуклеотидом или антителом и нуклеиновой кислотой LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 (или комплементарной ей нуклеиновой кислотой) или полипептидом LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 соответственно, в тестируемом образце, где повышенное образование такого комплекса в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом указывает на наличие расстройства кишечника (такого как IBD, UC или CD) у тестируемого млекопитающего. В одном варианте осуществления расстройство кишечника представляет собой IBD. В одном варианте осуществления расстройство представляет собой UC. В одном варианте осуществления расстройство представляет собой CD. В одном варианте осуществления ткань тестируемого и контрольного млекопитающих представляет собой ткань толстого кишечника. Необязательно, связывающее полипептид LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 антитело или гибридизующийся с геном LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 олигонуклеотид, используемые в способе по изобретению, являются детектируемыми, детектируемо меченными, связанными с твердой подложкой, или сходные с ними, и/или тестируемый образец ткани или клеток получают у индивида, предположительно страдающего расстройством кишечника, где расстройство представляет собой IBD, такое как, но не ограничиваясь ими, UC или CD.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению (a) полипептида LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, (b) нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, или вектора или клетки-хозяина, содержащих нуклеиновую кислоту (a), (c) антитела против полипептида LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 или (d) связывающего LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 олигопептида, для получения лекарственного средства, пригодного для диагностического выявления расстройства кишечника, включая, но не ограничиваясь ими, IBD CD или UC, в ткани кишечника млекопитающего, включая, но не ограничиваясь этим, ткань толстого кишечника.

В одном аспекте изобретение относится к способу выявления ответа на терапевтическое лекарственное средство у млекопитающего, подвергаемого лечению лекарственным средством против IBD, где способ включает определение экспрессии LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в желудочно-кишечной ткани тестируемого млекопитающего по сравнению с контрольной желудочно-кишечной тканью контрольного млекопитающего, где более высокий уровень экспрессии LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в тестируемой ткани по сравнению с контрольной тканью указывает на болезненное состояние или продолжение болезненного состояния. Отличие экспрессии LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в тестируемой ткани, которое не является значимо превышающим нормальные контрольные уровни экспрессии или уровни, которые находятся в диапазоне нормальных уровней экспрессии для LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в популяции млекопитающих, указывает на улучшение или смягчение расстройства кишечника, и это улучшение или смягчение может быть связано с лекарственным средством. В одном варианте осуществления ответ на лечение определяют, когда уровни экспрессии LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 в желудочно-кишечных тканях или клетках или тканях или клетках толстого кишечника млекопитающего, подвергаемого лечению лекарственным средством, отличаются (экспрессия является более сходной с нормальными контрольными уровнями, т.е. уровни LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5 являются более низкими, чем уровни экспрессии LY6H, LYPD1, LYPD3 и/или LYPD5, у млекопитающего до лечения).

Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области при прочтении настоящего описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фигурах 1A и 1B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:1), кодирующая полипептид LY6H человека, и аминокислотная последовательность полипептида LY6H человека (SEQ ID NO:2).

На фигурах 2A и 2B представлены последовательности нуклеиновых кислот (SEQ ID NO:3 и 4), кодирующие полипептид LYPD1 человека, и на фигуре 2C представлена аминокислотная последовательность полипептида LYPD1 человека (SEQ ID NO:5).

На фигурах 3A и 3B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:6), кодирующая полипептид LYPD3 человека, и аминокислотная последовательность полипептида LYPD3 человека (SEQ ID NO:7).

На фигурах 4A и 4B представлены последовательности нуклеиновых кислот (SEQ ID NO:8 и 9), кодирующие полипептид LYPD5 человека, и на фигуре 4C представлена аминокислотная последовательность полипептида LYPD5 человека (SEQ ID NO:10).

На фигурах 5A и 5B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:11), кодирующая полипептид LY6D человека, и аминокислотная последовательность полипептида LY6D человека (SEQ ID NO:12).

На фигурах 6A и 6B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:13), кодирующая полипептид LY6E человека, и аминокислотная последовательность полипептида LY6E человека (SEQ ID NO:14).

На фигурах 7A и 7B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:15), кодирующая полипептид LYPD2 человека, и аминокислотная последовательность полипептида LYPD2 человека (SEQ ID NO:16).

На фигурах 8A-8H представлены последовательности молекул GLG-1 (ESL-1): (A-B) регистрационный номер No. U64791, последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:17), кодирующая полипептид GLG-1 (ESL-1) человека (SEQ ID NO:18); (C-D) регистрационный номер No. NM_012201, последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:19), кодирующая полипептид GLG-1 (ESL-1) человека (SEQ ID NO:20); (E-F) регистрационный номер No. AK172806, последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:21), кодирующая полипептид GLG-1 (ESL-1) человека (SEQ ID NO:22); и регистрационный No. AK131501, последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:23), кодирующая полипептид GLG-1 (ESL-1) человека (SEQ ID NO:24).

На фигурах 9A и 9B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:25), кодирующая полипептид LY6A человека, и аминокислотная последовательность полипептида LY6A человека (SEQ ID NO:26).

На фигурах 10A и 10B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:27), кодирующая полипептид LY6C мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LY6C мыши (SEQ ID NO:28).

На фигурах 11A и 11B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:29), кодирующая полипептид LY6D мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LY6D мыши (SEQ ID NO:30).

На фигурах 12A и 12B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:31), кодирующая полипептид LY6E мыши и аминокислотная последовательность полипептида LY6E мыши (SEQ ID NO:32).

На фигурах 13A и 13B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:33), кодирующая полипептид LY6F мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LY6F мыши (SEQ ID NO:34).

На фигурах 14A и 14B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:35), кодирующая полипептид LY6I мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LY6I мыши (SEQ ID NO:36).

На фигурах 15A и 15B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:37), кодирующая полипептид LY6K мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LY6K мыши (SEQ ID NO:38).

На фигурах 16A и 16B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:45), кодирующая полипептид LYPD3 мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LYPD3 мыши (SEQ ID NO:46).

На фигурах 17A и 17B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:47), кодирующая полипептид LY6H мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LY6H мыши (SEQ ID NO:48).

На фигурах 18A и 18B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:49), кодирующая полипептид LYPD1 мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LYPD1 мыши (SEQ ID NO:50).

На фигурах 19A и 19B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:51), кодирующая полипептид LYPD2 мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LYPD2 мыши (SEQ ID NO:52).

На фигурах 20A и 20B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:53), кодирующая полипептид LY6g5c мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LY6g5c мыши (SEQ ID NO:54).

На фигурах 21A и 22B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:55), кодирующая полипептид LY6g6c мыши, и аминокислотная последовательность полипептида LY6g6c мыши (SEQ ID NO:56).

На фигурах 22A и 22B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:57), кодирующая полипептид SLURP2/LYNX1 мыши, и аминокислотная последовательность полипептида SLURP2/LYNX1 мыши (SEQ ID NO:58).

На фигуре 23 показано, что члены семейства LY6 активируются в IEC в моделях колита на мышах. IEC, как в модели IL10^-/- (фигура 23A), так и в модели перенесенного колита CD45RB^Hi (фигура 23B), выделяли посредством LCM и РНК очищали. Проводили анализ на микрочипах и анализировали, как описано в разделе "Примеры". Числовые значения соответствуют среднему значению изменения в кратности по сравнению с универсальным стандартом РНК для мышей с колитом по сравнению со здоровыми мышами. Числовые значения ниже тепловой карты указывают на показатель воспаления у отдельной мыши.

На фигурах 24A-24D показано, что поверхностная экспрессия молекул LY6 активируется на IEC в модели колита IL10-/-. В моделях перенесенного колита мышей дикого типа (фигура 24A) или IL10 -/- (фигура 24B) проводили окрашивание на поверхностную экспрессию LY6A (зеленый, с контрастирующим окрашиванием DAPI). Аналогично, для мышей дикого типа (фигура 24C) или IL10 -/- (фигура 24D) проводили окрашивание на поверхностную экспрессию LY6C.

На фигурах 25A-25I показано, что поверхностная экспрессия LY6A и LY6C повышается в ответ на воспалительные цитокины, в частности IFNγ. Клетки YAMC обрабатывали указанным цитокином в течение 15 часов и окрашивали на поверхностную экспрессию LY6C (фигура 25A) и LY6A (фигура 25B). Клетки YAMC культивировали в течение 15 часов в присутствии возрастающих доз IFNγ и анализировали проточной цитометрией в отношении экспрессии LY6C (фигура 25C) и LY6A (фигура 25D). Стимулированные посредством IFNγ клетки YAMC собирали в различные моменты времени, как указано, и анализировали проточной цитометрией в отношении экспрессии LY6C (фигура 25E) и LY6A (фигура 25F). IL-22 повышал экспрессию как LY6C (фигура 25G), так и LY6A (фигура 25H). Уровни как LY6A, так и LY6C были повышены в линии IEC мышей, CMT93, в ответ на обработку посредством IFNγ (фигура 25I).

Фигуры 26A-26E. Истощение липидных рафтов приводит к ингибированию опосредуемой LY6C продукции хемокинов. Клетки YAMC с истощением холестерина (темные столбики) или без истощения (незакрашенные столбики) инкубировали со связанным с планшетом антителом против KLH или против LY6C, как указано, в течение 15 часов. РНК собирали и определяли уровни экспрессии CXCL2, CXCL5 и CCL7 (фигуры 26A-26C). Поверхностные уровни LY6A (фигура 26D) и LY6C (фигура 26E) снижались в ответ на истощение холестерина.

На фигурах 27A-27D показано, что поперечное связывание LY6C, но не LY6A, индуцирует повышение поверхностной экспрессии LY6A и LY6C. Клетки YAMC инкубировали в течение 24 часов на планшетах, покрытых контрольным антителом против KLH, антителом против LY6A или антителом против LY6C, и анализировали проточной цитометрией в отношении экспрессии LY6C (фигура 27A) или LY6A (фигура 27B). Клетки предварительно обрабатывали в течение 12 часов 100 ед./мл IFNγ и аналогично помещали в покрытые антителом планшеты и анализировали в отношении экспрессии LY6C (фигура 27C) или LY6A (фигура 27D).

На фигурах 28A-28C показано, что поперечное связывание LY6C, но не LY6A, индуцирует секрецию хемокинов. Фигура 28A: клетки YAMC предварительно инкубировали, как указано, с 100 ед./мл IFNγ в течение 15 часов, или предварительно не инкубировали, и культивировали на планшетах, покрытых 10 мкг/мл антитела LY6A (черные столбики) или антитела против LY6C (заштрихованный столбики) или контрольным антителом против KLH (незакрашенные столбики). РНК выделяли через 24 (слева), 48 (центр) и 72 (справа) часов и анализировали в отношении экспрессии CXCL5 или CCL7 (A). Данные указывают на среднее значение ± SD изменение в кратности (как определяют способом 2^-∆∆Ct) по сравнению с необработанными клетками, поперечно-связанными изотипическим антителом. Фигура 28B: Супернатанты собирали через 48 часов в клетках, поперечно-связанных, как указано выше, посредством 1, 5 или 10 мкг/мл (как указано) антитела, и в супернатанте определяли секрецию CXCL5 посредством ELISA. *<0,05. Фигура 28C: Уровни как CXCL5, так и CXCL2 в ответ на поперечное связывание LY6C снижались, когда уровни LY6C снижали посредством siРНК.

На фигурах 29A-29B показано, что IEC при колите обладают сходным паттерном экспрессии генов хемокинов. IEC как в модели IL10^-/- (фигура 29A), так и в модели перенесенного колита CD45RB^Hi (фигура 29B) выделяли посредством LCM и РНК очищали. Проводили анализ на микрочипах и анализировали, как описано в разделе "Примеры". Числовые значения соответствуют среднему значению изменений в кратности по сравнению с универсальным стандартом РНК для мышей с колитом относительно здоровых мышей. Числовые значения ниже тепловой карты указывают на показатель воспаления у отдельной мыши.

На фигурах 30A-30C показано, что экспрессия генов семейства LY6 человека повышается в клетках толстого кишечника, обработанных цитокинами. Клетки Colo-205 человека обрабатывали указанными цитокинами или сочетаниями цитокинов в течение 18 или 24 часов. Возрастание в кратности экспрессии LY6H человека (фигура 30A), LYPD3 человека (фигура 30B) и LYPD5 человека (фигура 30C) показано по сравнению с контролем, представляющим собой β-актин человека.

На фигурах 31A-31B показано, что пациенты с болезнью Крона обладают повышенными уровнями LYPD1 (фигура 31A) и LYPD5 (фигура 31B) в толстом кишечнике. Получали образцы тканей у людей-пациентов с IBD и определяли экспрессию генов LYPD1 и LYPD5. Наблюдали статистически значимое повышение экспрессии LYPD1 и LYPD5 в воспаленной ткани пациентов с CD. Также наблюдали статистически значимое повышение экспрессии LYPD5 в воспаленной ткани пациентов с UC. Значения на оси Y отражают экспрессию генов относительно универсального стандарта РНК.

На фигурах 32A и 32B показаны (A) нетрансфицированные клетки COS и (B) клетки COS, трансфицированные полипептидом GLG-1 (ESL-1), окрашенные белком LYPD5-Fc.

На фигуре 33A представлена структура GLG-1 или ESL-1 и различные фрагменты, пригодные для охарактеризации связывания LYPD5, а на фигуре 33B показаны результаты исследования коиммунопреципитации, характеризующие связывание LYPD5 и лиганда LYPD5.

На фигуре 34A представлена структура GLG-1 или ESL-1 и различных фрагментов, пригодных для охарактеризации связывания LYPD5, а на фигуре 34B показаны результаты исследования коиммунопреципитации, характеризующие связывание LYPD5 и лиганда LYPD5.

На фигуре 35A представлена структура GLG-1 или ESL-1 и различных фрагментов, пригодных для охарактеризации связывания LYPD5, а на фигуре 35B показаны результаты исследования коиммунопреципитации, характеризующие связывание LYPD5 и лиганда LYPD5.

На фигурах 36A и 36B представлена последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO:68), кодирующая интегрин бета 7 человека, и аминокислотная последовательность полипептида интегрина бета 7 человека (SEQ ID NO: 69).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

“Воспалительное заболевание кишечника” или “IBD” используют в настоящем документе взаимозаменяемо для определения заболеваний кишечника, которые вызывают воспаление и/или изъязвление, и они включают, но не ограничивается ими, болезнь Крона и язвенный колит.

“Болезнь Крона (CD)” или “язвенный колит (UC)” представляют собой хронические воспалительные заболевания кишечника неизвестной этиологии. Болезнь Крона, в отличие от язвенного колита, может поражать любую часть кишечника. Наиболее выделяющимся признаком болезни Крона является гранулярное красновато-фиолетовое отечное утолщение стенки кишечника. При развитии воспаления эти гранулемы часто теряют их ограниченные границы и интегрируются с окружающей тканью. Преобладающими клиническими признаками являются диарея и обструкция кишечника. Как и в случае язвенного колита, течение болезни Крона может быть постоянным или рецидивирующим, мягким или тяжелым, но, в отличие от язвенного колита, болезнь Крона не поддается излечению резекцией вовлеченного сегмента кишечника. Большинству пациентов с болезнью Крона в некоторый момент времени требуется хирургическая операция, однако часто происходит последующее обострение и обычным является постоянное медикаментозное лечение.

Болезнь Крона может поражать любую часть пищеварительного тракта от ротовой полости до анального отверстия, хотя, как правило, она возникает в подвздошно-ободочной области, области тонкого кишечника или области толстой кишки и заднего прохода. Гистопатологически заболевание проявляется дискретными гранулемами, абсцессами крипт, трещинами и афтозными язвами. Воспалительный инфильтрат является смешанным, состоящим из лимфоцитов (как T-, так и B-клеток), плазматических клеток, макрофагов, и нейтрофилов. Происходит непропорциональное повышение IgM- и IgG-секретирующих плазматических клеток, макрофагов и нейтрофилов.

Противовоспалительные лекарственные средства сульфасалазин и 5-аминосалициловая кислота (5-ASA) пригодны для лечения болезни Крона в толстом кишечнике с мягкой активностью, и их обычно назначают для поддержания ремиссии заболевания. Метронидазол и ципрофлоксацин обладают эффективностью, сходной с сульфасалазином, и оказываются особенно пригодными для лечения перианального заболевания. В более тяжелых случаях для лечения активных обострений эффективны кортикостероиды, и они могут даже поддерживать ремиссию. Азатиоприн и 6-меркаптопурин также продемонстрировали успех у пациентов, которым требуется длительное введение кортикостероидов. Также возможно, что эти лекарственные средства могут участвовать в длительной профилактике. К сожалению, у некоторых пациентов перед возникновением эффекта может быть очень длительная задержка (вплоть до шести месяцев).

Лекарственные средства против диареи также могут обеспечить смягчение симптомов у некоторых пациентов. Лечебное питание или элементная диета могут улучшить состояние питания пациентов и индуцировать улучшение симптомов острого заболевания, однако они не индуцируют длительных клинических ремиссий. Для лечения вторичного избыточного роста бактерий и лечения гнойных осложнений применяют антибиотики.

“Язвенный колит (UC)” поражает толстый кишечник. Течение заболевания может быть постоянным или рецидивирующим, мягким или тяжелым. Наиболее ранним повреждением является воспалительная инфильтрация с образованием абсцесса в основании либеркюновых крипт. Сращение этих растянутых и разорвавшихся крипт обеспечивает тенденцию к разделению вышележащей слизистой оболочки и кровоснабжения, что ведет к изъязвлению. Симптомы заболевания включают спазм, боль в нижней части живота, кровотечение из прямой кишки и частые опорожнения с жидким стулом, состоящим, главным образом, из крови, гноя и слизи со скудными частицами кала. При остром, тяжелом или хроническом неремитирующем язвенном колите может требоваться колэктомия.

Клинические признаки UC в значительной степени варьируют, и начало может быть постепенным или внезапным, и оно может включать диарею, тенезмы и рецидивирующее кровотечение из прямой кишки. При быстром вовлечении всего толстого кишечника может произойти токсический мегаколон, угрожающая жизни ситуация. Внекишечные проявления включают артрит, гангренозную пиодермию, увеит и узловатую эритему.

Лечение UC включает сульфасалазин и сходные салицилат-содержащие лекарственные средства при мягких случаях и кортикостероидные лекарственные средства в тяжелых случаях. Иногда является эффективным местное введение либо салицилатов, либо кортикостероидов, в частности когда заболевание ограничено дистальным отделом кишечника, и оно ассоциировано со сниженными побочными эффектами по сравнению с системным применением. Иногда показаны поддерживающие меры, такие как введение железа и средств против диареи. Также иногда назначают азатиоприн, 6-меркаптопурин и метотрексат для применения в рефрактерных кортикостероид-зависимых случаях.

Как используют в настоящем документе, “член семейства генов LY6” или “член суперсемейства генов LY6” используют в настоящем документе взаимозаменяемо для определения гена, имеющего гомологию с членами семейства генов LY6, большинство из которых представляют собой GPI-заякоренные гликопротеины клеточной поверхности, широко распространенные на клетках гематопоэтического происхождения и более ограниченно экспрессирующиеся на негематопоэтических клетках. Члены этого семейства генов используют в качестве маркеров дифференцировки иммунных клеток (Sunderkotter, C. et al., J. Immunol. 172:4410-4417 (2004)). Гены семейства LY6 были изучены (Shevach, E.M. и P.E. Korty, Immunol. Today 10:195-200 (1989)), и их функции включают активацию T-клеток (Zhang, Z.X. et al., Eur. J. Immunol. 32:1584-1592 (2002) и Henderson, S.C. et al., J. Immunol. 168:118-126 (2002)), обоняние (Chou, J.H. et al., Genetics 157:211-224 (2001)) и клеточную адгезию (Jaakkola, I. et al., J. Immunol. 170:1283-1290 (2003)). Члены семейства генов LY6 включают, но не ограничиваются ими, члены семейства генов LY6 млекопитающих, такие как гены семейства LY6 мыши или человека. Как используют в настоящем документе, “ген LY6” относится к члену семейства генов LY6, а “полипептид LY6” относится к полипептиду, кодируемому геном LY6. Члены семейства генов LY6 мыши включают, но не ограничиваются ими, LY6A (NM_010738, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:25, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:26), LY6C (NM_010741, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:27, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:28), LY6D (NM_003695, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:29, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:30), LY6E (NM_002346, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:31, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:32), LY6F (NM_008530, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:33, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:34), LY6I (NM_020498, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:35, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:36) и LY6K (NM_017527, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:37, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:38). Члены семейства генов LY6 человека включают, но не ограничиваются ими, LY6H (NM_002347, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:1, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:2), LYPD1 (NM_144586, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:3 или 4, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:5), LYPD3 (NM_014400, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:6, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:7), LYPD5 (NM_182573, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:8 или 9, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:10), LY6D (NM_003695, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:11, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:12), LY6E (NMNM_002346, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:13, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:14), LYPD2 (NM_205545, нуклеиновая кислота SEQ ID NO:15, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:16). В вариантах осуществления полинуклеотид каждого члена семейства генов LY6, описанного в настоящем документе, включает по меньшей мере 15, по меньшей мере 25, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 250, по меньшей мере 500, по меньшей мере 750, по меньшей мере 1000, по меньшей мере 1250, по меньшей мере 1500, по меньшей мере 1750, по меньшей мере 2000 или по меньшей мере 2040 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 45, 47, 49, 51, 53, 55, или 57, или полинуклеотид члена семейства генов LY6 содержит SEQ ID NO:1, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13, 15, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 45, 47, 49, 51, 53, 55 или 57. В одном варианте осуществления полинуклеотид, который с