Улучшенное гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину

Улучшенное гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к улучшенному гуманизированному антителу к человеческому α9-интегрину. Более точно, оно относится к улучшенному гуманизированному антителу Y9A2, обладающему активностью связывания с белком человека α9-интегрином, ингибируя α9-интегринзависимую клеточную адгезию, и улучшенной активностью и/или свойствами по сравнению с мышиным антителом Y9A2 к человеческому α9-интегрину. Предполагается, что такое гуманизированное антитело может использоваться в качестве лекарственного средства для диагностики, профилактики или лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, заболеваний иммунной системы, таких как аллергия и отторжение трансплантатов, и различных других заболеваний, в патогенез которых вовлечен α9-интегрин.

Уровень техники

[0002] Интегрин, гликопротеин клеточной поверхности, представляет собой молекулу адгезии, которая функционирует главным образом как рецептор клеточной адгезии с внеклеточным матриксом (коллаген, ламинин и т.п.) и членами семейства иммуноглобулинов (ICAM-1, VCAM-1 и т.п.), и опосредует передачу сигналов из внеклеточного матрикса. Таким образом, клетки получают сигналы из внеклеточного матрикса, в результате чего происходит индукция их дифференцировки, пролиферации, гибели и т.п. Интегрин представляет собой гетеродимер, состоящий из двух субъединиц, α цепи и β цепи; имеет различные α цепи и β цепи, встречающиеся в широком многообразии комбинаций, и имеет 24 члена суперсемейства интегринов. Мыши с нокаутированным интегрином рождаются либо мертвыми, либо больными, независимо от того, какая из субъединиц отсутствует, что предполагает необходимость каждого отдельного интегрина для поддержания жизненных функций. Следовательно, предполагается, что интегрин, который передает клеткам информацию об окружающих условиях для стимуляции их ответов, функционирует во всех ситуациях биологических явлений и опосредует широкий диапазон патологических условий.

[0003] Интегрин также необходим для выживания организмов, и, как предполагается, играет роль даже в болезненных состояниях; имеются сообщения о некоторых случаях, когда подавление активности интегринов помогало при лечении патологических состояний. Например, ингибитор интегрина тромбоцитов αIIbβ3, известный как абциксимаб (торговая марка: ReoPro; Eli Lilly), одобрен в качестве терапевтического лекарственного средства для лечения рестеноза после ЧТКА (чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики, percutaneous transluminal coronary angioplasty (PCTA)). Натализумаб (торговая марка: Antegren; ELAN Company), ингибитор α4β1 (VLA4), одобрен в качестве терапевтического лекарственного средства для лечения рассеянного склероза. Витаксин (MEDIMMUNE Company), ингибитор αvβ3, находится в разработке на стадии клинических исследований ингибирующего воздействия на неоваскуляризацию, на активацию остеокластов и т.п.

[0004] Интегрин α9β1 экспрессируется в макрофагах, NKT-клетках, дендритных клетках и нейтрофилах и, согласно сообщениям, играет важную роль в инфильтрации и адгезии этих воспалительных клеток, резорбции костей и т.п. Недавно было опубликовано сообщение о том, что интегрин α9β1 вовлечен в формирование остеокластов, и было выдвинуто предположение о его причастности к деструкции костей (Непатентный документ 1). Его известные лиганды включают укороченный остеопонтин (N-терминальный OPN), VCAM-1, тенасцин C и т.п. В клинических условиях наблюдали значимо увеличенный уровень интегрина α9β1 в синовиальных тканях пациентов с ревматоидным артритом (Непатентный документ 2).

[0005] Следовательно, для диагностики, профилактики или лечения различных заболеваний, в патогенез которых вовлечен α9-интегрин, было бы полезно разработать моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком α9-интегрином, подавляя α9-интегрин-зависимую клеточную адгезию.

[0006] Антитела, которые, как сообщалось, обладают функцией ингибирующего воздействия на человеческий α9-интегрин, представляют собой мышиное моноклональное антитело Y9A2 (Непатентный документ 3) и 1K11, 24I11, 21C5 и 25B6 (Патентный документ 1) и 28S1 (Патентный документ 2). Полученные в экспериментах in vitro результаты показали, что эти антитела способны подавлять зависимую от человеческого α9-интегрина клеточную адгезию. Помимо этого, поскольку Y9A2 ингибирует клеточную адгезию как к остеопонтину, так и к тенасцину С, предполагается, что оно является самым многообещающим в качестве кандидата на лекарственное средство на основе антитела к α9-интегрину.

[0007] Однако необходимо отметить, что Y9A2 представляет собой мышиное антитело, полученное путем иммунизации мыши антигеном, и, следовательно, с точки зрения безопасности (индукции антигенности) и эффективности (укороченного времени полужизни), фактически не представляется возможным прямое введение этого антитела человеку. Поэтому необходима модификация с целью трансформации антитела в молекулу, имеющую аминокислотную последовательность человеческого антитела при сохранении активности Y9A2, т.е. гуманизация.

[0008] В настоящее время, в качестве способа продуцирования гуманизированного антитела, наиболее общепринятым является способ, основанный на методе, включающем перенос аминокислоты гипервариабельного участка (далее в настоящем документе называемом CDR) согласно разработке Winter и др. (Непатентный документ 4). Также хорошо известно, что одновременный перенос не только аминокислоты, содержащейся в CDR, но также и аминокислоты, не относящейся к CDR, но ответственной за сохранение структуры CDR или связывание с антигеном, т.е. находящейся в каркасном участке (далее в настоящем документе называемом FR), из чужеродного антитела, которое является донором аминокислоты CDR для человеческого антитела, которое является акцептором CDR, важен для воспроизведения врожденной активности антитела-донора (Непатентные документы 4 и 5).

[0009] Однако продуцирование гуманизированного антитела на основе переноса CDR связано с несколькими проблемами. Во-первых, наиболее общей проблемой является то, что даже подходящий выбор аминокислоты FR, необходимой для воспроизведения активности антитела-донора, не может устранить трудности, связанные с получением гуманизированного антитела, обладающего аффинностью к антигену и биологической активностью, превышающей активность антитела-донора.

[0010] В последние годы, на рынке появилось большое количество химерных антител, гуманизированных антител и человеческих антител в виде фармацевтических продуктов моноклональных антител. Эффективная доза любого из них является чрезвычайно высокой и составляет несколько мг на 1 кг массы тела. Поэтому, фармацевтические препараты с антителами являются очень дорогими, что, в свою очередь, с экономической точки зрения, ложится тяжелым бременем на пациентов и увеличивает медицинские затраты. Главные факторы, определяющие эффективную дозу лекарственного средства на основе антитела, включают аффинность антитела к антигену и количество антигенов в организме. В частности, с точки зрения этих аспектов, улучшение аффинности антитела к антигену приводит к уменьшению дозы и является очень полезным улучшением, приводящим также, с экономической точки зрения, к уменьшению бремени на пациентов и сокращению медицинских затрат.

[0011] Для достижения увеличенной аффинности антитела к антигену часто используется способ, включающий замену аминокислоты в вариабельной области антитела. Однако если антитело и антиген являются различными, также изменяются последовательность и пространственная структура аминокислот в CDR, а также меняется положение аминокислоты, участвующей в антиген-антитело взаимодействии. Поэтому практически невозможно определить положение аминокислоты в FR, которая должна быть перенесена вместе с CDR, применимое к любому антителу.

[0012] Другая проблема заключается в том, что хотя в темплатное человеческое антитело обычно переносятся все аминокислоты CDR мышиного антитела-донора в процессе получения гуманизированного антитела, основанном на CDR-переносе, аминокислотная последовательность CDR, полученная из мышиного антитела, которая является важной для связывания с антигеном, иногда проявляет антигенность по отношению к человеку, часто вызывая генерацию анти-идиотипных антител.

[0013] Таким образом, для производства гуманизированного антитела необходим выбор соответствующего антитела-акцептора и выбор заменяемых аминокислот CDR и аминокислот FR для получения активности, превышающей активность антитела-донора, при этом не вызывая антигенности по отношению к человеку и не уменьшая стабильности антитела. Это требует значительного мастерства и использования метода проб и ошибок.

Патентный документ 1: WO 2006/075784

Патентный документ 2: WO 2008/007804

Непатентный документ 1: Journal of Bone and Mineral Research, 2006, 21: 1657-1665

Непатентный документ 2: The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115: 1060-1067

Непатентный документ 3: Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1996, 15: 664-672

Непатентный документ 4: Science, 239, 1534-1536 (1988)

Непатентный документ 5: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989)

Раскрытие изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

[0014] Целью настоящего изобретения является решение вышеупомянутых различных проблем, связанных с гуманизированными антителами, и обеспечение гуманизированных антител к человеческому α9-интегрину, обладающих улучшенной активностью и/или свойствами по сравнению с мышиным антителом-донором к человеческому α9-интегрину (Y9A2).

Средства для решения указанных проблем

[0015] Следовательно, настоящее изобретение содержит приведенные ниже изобретения (1)-(15), в виде веществ, полезных с точки зрения медицины или промышленности, и способов.

(1) Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, выбранные из следующего:

(a) вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:11, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:17;

(b) вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:13, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:17; и

(c) вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:15, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:9.

(2) Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, описанное выше в (1), в котором константная область тяжелой цепи антитела представляет собой Igγ1 человека.

(3) Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, описанное выше в (1), в котором константная область легкой цепи антитела представляет собой Igκ человека.

(4) Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, описанное выше в (1), в котором константная область тяжелой цепи антитела представляет собой Igγ1 человека, а гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, описанное выше в (1), в котором константная область тяжелой цепи антитела представляет собой Igκ человека.

(5) Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, описанное выше в (1), в котором тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:19, а легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25.

(6) Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, описанное выше в (1), в котором тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:21, а легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25.

(7) Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, описанное выше в (1), в котором тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:23, а легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:27.

(8) Полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела к человеческому α9-интегрину, описанному выше в (1).

(9) Полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела к человеческому α9-интегрину, описанному выше в (1).

(10) Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, описанный выше в (8) и/или полинуклеотид, описанный выше в (9).

(11) Клетка-хозяин, включающая вектор экспрессии, описанный выше в (10).

(12) Способ продуцирования гуманизированного антитела к человеческому α9-интегрину, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, описанную выше в (11), для получения возможности экспрессировать гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину.

(13) Терапевтическое лекарственное средство от ревматоидного артрита, содержащее гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, описанное выше в любом из (1)-(7).

(14) Способ профилактики или лечения ревматоидного артрита, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества гуманизированного антитела к человеческому α9-интегрину, описанному выше в любом из (1)-(7).

(15) Применение гуманизированного антитела к человеческому α9-интегрину, описанного выше в любом из (1)-(7), в процессе производства фармацевтического препарата для профилактики или лечения ревматоидного артрита.

Эффект, обеспечиваемый изобретением

[0016] Согласно настоящему изобретению, предоставляется гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, имеющее улучшенную активность и/или свойства по сравнению с мышиным антителом-донором к человеческому α9-интегрину. Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину по настоящему изобретению обладает сильным противовоспалительным действием и сильным действием подавления костной деструкции путем блокирования взаимодействия между человеческим α9-интегрином и его многочисленными лигандами и является применимым для профилактики или лечения различных заболеваний, в патогенезе которых участвует человеческий α9-интегрин. Кроме того, гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину по настоящему изобретению обеспечивает превосходные преимущества при использовании в клинике, такие как уменьшение дозы, увеличение интервала между введениями, усовершенствование способа введения (например, путем подкожной инъекции) и т.п., и обладает высокой терапевтической эффективностью и хорошей переносимостью пациентами.

Краткое описание чертежей

[0017] На Фиг.1 показана аминокислотная последовательность VH мышиного антитела Y9A2.

На Фиг.2 показана аминокислотная последовательность VL мышиного антитела Y9A2.

На Фиг.3 показана структура олиго-ДНК для продуцирования гена, кодирующего RY9A2VHv5, который является одним из примеров VH гуманизированного антитела Y9A2.

На Фиг.4 показана структура олиго-ДНК для продуцирования гена, кодирующего RY9A2VLv01, который является одним из примеров VL гуманизированного антитела Y9A2.

На Фиг.5 показаны результаты клеточного ELISA для химерного антитела Y9A2 и антитела RY9A2v501.

На Фиг.6 показаны результаты клеточного ELISA для химерного антитела Y9A2 и антитела RY9A2v801.

Лучшие варианты осуществления изобретения

[0018] Ниже подробно описано настоящее изобретение.

Авторы настоящего изобретения продемонстрировали хорошую изобретательность и рассмотрели вопросы, связанные с продуцированием гуманизированного антитела для мышиного антитела Y9A2 к человеческому α9-интегрину, и успешно получили три вида гуманизированного антитела к человеческому α9-интегрину (далее в настоящем документе называемом гуманизированным антителом Y9A2 или RY9A2), обладающих значительно улучшенной активностью и/или свойствами по сравнению с Y9A2.

[0019] Более точно, авторы настоящего изобретения сначала перенесли аминокислотную последовательность CDR и несколько аминокислот FR вариабельной области тяжелой цепи (далее в настоящем документе называемой VH) и вариабельной области легкой цепи (далее в настоящем документе называемой VL) мышиного антитела Y9A2 к человеческому α9-интегрину (далее в настоящем документе называемом мышиным антителом Y9A2) в темплатное человеческое антитело для получения двух видов гуманизированных антител RY9A2v501 и RY9A2v801 к человеческому α9-интегрину, каждое из которых обладает активностью, равной активности мышиного антитела Y9A2. CDR определяли согласно классификации Кабата (Kabat) и др. (Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th ed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987). Аминокислотные последовательности VH для RY9A2v501 и RY9A2v801 приведены в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:7, соответственно. В настоящем документе VH для RY9A2v801 представляет собой VH для RY9A2v501, где 4 аминокислотных остатка из аминокислотных остатков FR, полученных из мышиного антитела Y9A2, заменены на соответствующие аминокислоты темплатного человеческого антитела. Аминокислотная последовательность VL обоих гуманизированных антител приведена в SEQ ID NO:9 и является общей для обоих антител.

[0020] Затем, для получения гуманизированного антитела с более высокой аффинностью к человеческому α9-интегрину по сравнению с активностью исходного мышиного антитела Y9A2, без риска индуцирования антигенности гуманизированного антитела и пониженной стабильности при его хранении, авторы настоящего изобретения рассмотрели замену аминокислотных последовательностей в CDR из VH и VL вышеупомянутых двух видов гуманизированных антител. В результате было подтверждено, что следующие 3 вида гуманизированных антител к человеческому α9-интегрину обладают значительно улучшенной активностью и/или свойствами по сравнению с активностью и/или свойствами исходного мышиного антитела Y9A2:

1) гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:11, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:17.

2) гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:13, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:17.

3) гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:15, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:9.

[0021] Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину по настоящему изобретению может быть легко получено специалистами в данной области на основе информации о последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи этого антитела, раскрытого в настоящем документе, с использованием способа, хорошо известного в данной области. В частности, получают генный сегмент вариабельной области тяжелой цепи, имеющий базовую последовательность, которая кодирует аминокислоты вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела по настоящему изобретению, и генный сегмент вариабельной области легкой цепи, имеющий базовую последовательность, которая кодирует аминокислоты вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела по настоящему изобретению. Затем, гены вариабельных областей соединяют с геном константной области из соответствующего класса человеческого антитела для получения гена гуманизированного антитела. Затем, этот ген гуманизированного антитела соединяют с соответствующим вектором экспрессии и вводят в культивируемую клетку. Наконец, культивируют эту культивируемую клетку, таким образом получают возможность для выделения гуманизированного антитела из супернатанта культуры.

[0022] Каждый из вышеописанных генных сегментов вариабельных областей, который кодирует аминокислоты вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи гуманизированного антитела по настоящему изобретению, может быть синтезирован, например, на основе базовых последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, или базовых последовательностей, сконструированных на основе аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, и известным в данной области способом синтеза генов. В качестве такого способа синтеза генов могут использоваться различные способы, известные специалистам в данной области, такие как способ синтеза гена антитела, описанный в WO90/07861 и т.п. Кроме того, после получения генного сегмента вариабельной области антитела по настоящему изобретению также могут быть получены другие антитела по настоящему изобретению путем введения мутаций в заданный участок генного сегмента. В качестве такого способа введения мутаций могут быть использованы различные способы, очевидные для специалистов в данной области, такие как сайт-направленный мутагенез (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 8.1-8.5).

[0023] Затем, для получения гена гуманизированного антитела соединяют вышеописанные генные сегменты вариабельных областей и ген константной области человеческого антитела. Хотя в качестве константной области используемого человеческого антитела может быть выбран любой подкласс константной области (например, γ1, γ2, γ и γ4 в качестве тяжелых цепей, константные области λ и κ цепей в качестве легких цепей), предпочтительно могут использоваться Igγ1 человека в качестве константной области тяжелой цепи и Igκ человека в качестве константной области легкой цепи.

[0024] После получения такого гена гуманизированного антитела, могут быть выполнены следующие стадии: введение гена гуманизированного антитела в вектор экспрессии, введение вектора экспрессии в культивируемые клетки, культивирование культивируемых клеток, очистка антитела и т.п. с помощью различных, хорошо известных в данной области способов или с помощью способов получения гуманизированного антитела к человеческому остеопонтину, описанных в WO2007/139164 или WO2003/027151.

[0025] В качестве вектора экспрессии, предназначенного для соединения с полученным таким образом геном гуманизированного антитела, можно использовать векторы экспрессии, описанные в заявке на патент WO94/20632, приведенной в официальном бюллетене международных заявок на патент (International Patent Publication Official Gazette), такие как AG-γ1 и AG-γ, при этом на вектор экспрессии отсутствуют какие-либо ограничения при условии, что он может экспрессировать ген гуманизированного антитела. Предпочтительно использовать вектор экспрессии, уже имеющий ген константной области человеческого Ig, такой как AG-γ1 или AG-γ, поскольку он мог бы стать вектором экспрессии, имеющим ген гуманизированного антитела для случая простого введения в него гена вариабельной области гуманизированного антитела. В векторе экспрессии может использоваться лидерная последовательность для усиления внеклеточной секреции и экспрессии антитела. В качестве лидерной последовательности может использоваться лидерная последовательность, полученная из Y9A2, или лидерная последовательность, полученная из другого антитела (например, гуманизированного антитела к остеопонтину, описанного в WO2007/139164).

[0026] Вышеописанный вектор экспрессии вводят в культивируемые клетки, например, используя систему экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen), кальций-фосфатный способ и т.п.

[0027] В качестве примеров культивируемых клеток, в которые вводится вектор экспрессии, можно привести культивируемые клетки, такие как клетки 293, клетки CHO-DG44, которые можно культивировать обычным способом.

[0028] После вышеописанного культивирования накопленное в супернатанте культуры антитело может быть очищено с помощью различного вида колоночной хроматографии, например хроматографией с использованием колонок с протеином А.

[0029] В качестве способа, используемого для измерения активности связывания полученного гуманизированного антитела с человеческим α9-интегрином, можно указать ELISA, FACS и т.п. В случае использования ELISA, например, клетки (например, клетки SW480), экспрессирующие α9-интегрин, иммобилизуют на планшете ELISA, добавляют туда гуманизированное антитело с тем, чтобы вызвать реакцию, и к этому добавляют вторичное антитело, такое как человеческое антитело IgG, меченное ферментом, например, пероксидазой хрена (HRP), вызывая реакцию. Клетки промывают, добавляют к ним субстрат, вызывающий окрашивание (например, TMB, в случае HRP метки), и измеряют абсорбцию.

[0030] В качестве способа оценки наличия у полученного гуманизированного антитела функции ингибирующей активности в отношении человеческого α9-интегрина, можно использовать тест на ингибирование (описанный в J. Biol. Chem., 274:36328-36334, 1999) зависимой от человеческого α9-интегрина клеточной адгезии к молекуле человеческого остеопонтина. Таким образом, вариант RAA (последовательность RGD заменяют на RAA для подавления реакции с другим интегрином; далее в настоящем документе иногда называемый nOPN-RAA) N-терминального OPN (N терминальный фрагмент после расщепления остеопонтина тромбином; далее в настоящем документе иногда называемый nOPN), который является одним из α9 лигандов, иммобилизуют на планшете и блокируют. После добавления различных гуманизированных антител добавляют клетки экспрессии α9 и инкубируют при 37°C в течение 1 часа. Клетки фиксируют и окрашивают кристаллическим фиолетовым и метанолом, и промывают. Краску с прикрепленных клеток экстрагируют Тритоном X-100 и измеряют абсорбцию при длине волны, равной 595 нм.

[0031] Кроме того, в качестве способа, используемого для детальной оценки наличия у полученного гуманизированного антитела функции ингибирующей активности в отношении человеческого α9-интегрина, можно упомянуть способ, основанный на тесте ингибирования клеточной миграции, описанный в Molecular Biology of the cell, 12: 3214-3225, 2001. Таким образом, nOPN-RAA иммобилизуют в верхнем слое системы Transwell и устанавливают на планшете, а затем в нижний слой добавляют среду F15, содержащую 10% FCS. В верхний слой одновременно добавляют клетки экспрессии α9 и гуманизированное антитело и инкубируют при 37°C в течение 16 часов. После того, как клетки мигрируют в более низкий слой системы Transwell, выполняют количественное определение, например, с помощью набора для анализа клеточной миграции с использованием 24-луночного планшета (Cell Migration 24-well Assay) QCM Chemotaxis (Millipore).

[0032] Можно легко получить 3 вида гуманизированных антител к человеческому α9-интегрину по настоящему изобретению путем синтеза ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO:11, 13 или 15, и ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO:17 или 9, с помощью хорошо известного в данной области способа, путем соединения их с соответствующим классом гена константной области человеческого антитела, предпочтительно гена Igγ1 константной области тяжелой цепи человека и гена Igκ константной области легкой цепи человека, с целью создания гена гуманизированного антитела, путем введения гена гуманизированного антитела в вектор экспрессии с помощью различных хорошо известных в данной области способов или способа, описанного в WO02/081522 или WO03/027151 и т.п., путем введения вектора экспрессии в культивируемые клетки, культивирования культивируемых клеток и очистки антитела от полученной культуры. Предпочтительно, ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности VH, приведенные в SEQ ID NO:11, 13 и 15, содержат базовые последовательности, приведенные в SEQ ID NO:12, 14 и 16, соответственно. Предпочтительно, ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности VL, приведенные в SEQ ID NO:17 и 9, содержат базовые последовательности, приведенные в SEQ ID NO:18 и 10, соответственно.

[0033] Предпочтительная тяжелая цепь гуманизированного антитела по настоящему изобретению, которую получают путем присоединения к вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO:11, и константной области человеческого Igγ1, представляет собой тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:19. Предпочтительная легкая цепь гуманизированного антитела по настоящему изобретению, которую получают путем присоединения к вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO:17, и константной области человеческого Igκ, представляет собой легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25. Предпочтительно, ДНК, кодирующая тяжелую цепь гуманизированного антитела, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:19, содержит базовую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:20. Предпочтительно, ДНК, кодирующая легкую цепь гуманизированного антитела, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25, содержит базовую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:26. В качестве гуманизированного антитела к α9-интегрину по настоящему изобретению, содержащего тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:19, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25, может быть упомянуто описанное ниже в примерах антитело RY9A2v12(M34L)012.

[0034] Предпочтительная тяжелая цепь гуманизированного антитела по настоящему изобретению, которая получена путем присоединения к вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO:13, и константной области Igγ1 человека, представляет собой тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:21. Предпочтительная легкая цепь гуманизированного антитела по настоящему изобретению, которая получена путем присоединения к вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO:17, и константной области Igκ человека, представляет собой легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25. Предпочтительно, ДНК, кодирующая тяжелую цепь гуманизированного антитела, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:21, содержит базовую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:22. Предпочтительно, ДНК, кодирующая легкую цепь гуманизированного антитела, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25, содержит базовую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:26. В качестве гуманизированного антитела к α9-интегрину по настоящему изобретению, содержащего тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:21, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:25, может быть упомянуто описанное ниже в примерах антитело RY9A2v11(M34L)012.

[0035] Предпочтительная тяжелая цепь гуманизированного антитела по настоящему изобретению, которая получена путем присоединения к вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO:15, и константной области человеческого Igγ1, представляет собой тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:23. Предпочтительная легкая цепь гуманизированного антитела по настоящему изобретению, которая получена путем присоединения к вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO:9, и константной области человеческого Igγ, представляет собой легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:27. Предпочтительно, ДНК, кодирующая тяжелую цепь гуманизированного антитела, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:23, содержит базовую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:24. Предпочтительно, ДНК, кодирующая легкую цепь гуманизированного антитела, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:27, содержит базовую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:28. В качестве гуманизированного антитела к α9-интегрину по настоящему изобретению, содержащего тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:23, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:27 SEQ, может быть упомянуто описанное ниже в примерах антитело RY9A2v05(IAW)01.

[0036] Полученное таким образом гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину по настоящему изобретению после дальнейшей очистки, если это необходимо, может быть приготовлено в виде фармацевтического препарата согласно обычному способу и использоваться для профилактики аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит и т.п., заболеваний иммунной системы, таких как аллергия, отторжение трансплантантов и т.п., и заболеваний, в патогенезе которых принимает участие α9-интегрин, таких как остеопороз, хроническое обструктивное заболевание легких, рак и т.п.

[0037] Гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину по настоящему изобретению может использоваться предпочтительно в качестве терапевтического агента для лечения ревматоидного артрита. В качестве примеров дозированных форм для таких терапевтических агентов можно приготовить препарат для парентерального введения, например, в виде инъекций или капельной инфузии, предпочтительным же является внутривенное введение, подкожное введение и т.п. При приготовлении фармацевтического препарата могут использоваться, в пределах фармацевтически приемлемого диапазона, носители и добавки, которые соответствуют этим дозированным формам.

[0038] Количество гуманизированного антитела к человеческому α9-интегрину по настоящему изобретению, добавляемое при приготовлении вышеописанного препарата, изменяется в зависимости от тяжести симптомов пациента и его возраста, дозированной формы используемого препарата или титра связывания антитела и т.п.; например, можно использовать примерно от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг.

[0039] Настоящее изобретение также предоставляет полинуклеотид, кодирующий гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину по настоящему изобретению или тяжелую цепь и/или легкую цепь его вариабельных областей, и вектора экспрессии, содержащие то же самое. Вектор экспрессии по настоящему изобретению не имеет каких-либо ограничений при условии, что он может экспрессировать ген, который кодирует гуманизированное антитело по настоящему изобретению или тяжелую цепь или легкую цепь его вариабельных областей в различных клетках-хозяевах, прокариотических клетках и/или эукариотических клетках, и продуцировать эти полипептиды. Например, могут быть упомянуты плазмидные векторы, вирусные векторы (например, аденовирусные, ретровирусные) и т.п.

[0040] Вектор экспрессии по настоящему изобретению может включать ген, который кодирует гуманизированное антитело к человеческому α9-интегрину по настоящему изобретению или тяжелую цепь и/или легкую цепь его вариабельных областей, и функционально соединенный с геном промотором. В качестве промотора для экспрессии гена, который кодирует гуманизированное антитело по настоящему изобретению или тяжелую цепь и/или легкую цепь его вариабельных областей в бактерии, если хозяином является бактерия рода Escherichia, может быть упомянут, например, промотор Trp, промотор lac, промотор recA, промотор λPL, промотор lpp, промотор tac и т.п. В качестве промотора для экспрессии гена, который кодирует гуманизированное антитело или тяжелую цепь и/или легкую цепь его вариабельных областей в дрожжах, могут быть упомянуты, например, промотор PH05, промотор PGK, промотор GAP и промотор ADH; если хозяином является бактерия рода Bacillus, может быть упомянут промотор SL01, промотор SP02, промотор penP и т.п. Если хозяином является эукариотическая клетка, такая как относящаяся к клетке млекопитающего, может быть упомянут промотор β-актина, промотор CAG (Niwa H. et al., Gene, 108, 193-200, 1991), промотор, полученный из SV40, промотор ретровируса, промотор белков теплового шока и т.п.

[0041] Если в качестве клетки-хозяина используются бактерии, в частности, Escherichia coli, вектор экспрессии по настоящему изобретению может также включать кодон инициации, стоп-кодон, область терминации и реплицируемый участок. Если в качестве хозяина используются дрожжи, животная клетка или клетка насекомого, вектор экспрессии по настоящему изобретению может включать кодон инициации и стоп-кодон. В этом случае, энхансерная последовательность, некодирующая области на 5'-конце и 3'-конце гена, который кодирует гуманизированное антитело по настоящему изобретению или тяжелую цепь и/или легк