Изготовление активных высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатаз человека и их применение

Изготовление активных высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатаз человека и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США No. 61/022179, поданной 18 января 2008 года, по предварительной патентной заявке США No. 61/099373, поданной 23 сентября 2008 года, и по предварительной патентной заявке США No. 61/110246, поданной 31 октября 2008 года, описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылок.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к технической области клеточной и молекулярной биологии и медицины, в частности к изготовлению активных высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатаз человека и к их применению для управления течением лизосомальных болезней накопления, связанных с дефицитом лизосомальных ферментов сульфатаз. В частности, настоящее изобретение относится к изготовлению активной высокофосфорилированной рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS) человека и к ее применению для управления течением мукополисахаридоза IVa (MPS Iva, или синдрома Моркио A) и других лизосомальных болезней накопления, ассоциированных с дефицитом GALNS.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Лизосомальные болезни накопления (LSD) являются следствием дефицита определенных лизосомальных ферментов в клетке, которые необходимы для деградации клеточных отходов в лизосоме. Дефицит таких лизосомальных ферментов ведет к накоплению в лизосоме недеградированного "материала накопления", который вызывает набухание и нарушение функции лизосом, и, в конечном итоге, к повреждению клеток и тканей. Большое количество лизосомальных ферментов идентифицировано и соотнесено со связанными с ними заболеваниями. После идентификации недостающего фермента лечение может быть сведено к единственной проблеме эффективной доставки заместительного фермента в пораженные ткани пациентов.

Одним из способов лечения лизосомальных болезней накопления является внутривенная фермент-заместительная терапия (ERT) (Kakkis, Expert Opin. Investig. Drugs 11 (5): 675-685, 2002). В ERT используются сосуды для доставки фермента из одной области введения в большинство тканей. После того как фермент широко распределяется, он должен быть захвачен клетками. Основа для захвата в клетки состоит в уникальном признаке лизосомальных ферментов. Лизосомальные ферменты представляют собой отдельный класс гликопротеинов, определяемый по фосфату в 6 положении концевых остатков маннозы. Манноза-6-фосфат связывается с высокой аффинностью и специфичностью рецептором, находящимся на поверхности большинства клеток (Munier-Lehmann et al., Biochem. Soc. Trans. 24(1): 133-136, 1996; Marnell et al., J. Cell. Biol. 99(6): 1907-1916, 1984). Рецептор манноза-6-фосфата (MPR), который имеет по два связывающих маннозу-6-фосфат участка на полипептидную цепь (Tong et al., J. Biol Chem. 264:7962-7969, 1989), обеспечивает захват фермента из крови в ткани, а затем опосредует внутриклеточную доставку к лизосоме.

Крупномасштабная продукция лизосомальных ферментов вовлекает экспрессию в клеточных линиях млекопитающих. Ее целью является преобладающая секреция рекомбинантного фермента в окружающую среду для роста в целях последующего сбора и переработки. В идеальной системе для крупномасштабной продукции лизосомальных ферментов, фермент эффективно фосфорилируется, а затем направляется, главным образом, к клеточной поверхности (т.е. для секреции), вместо направления, в первую очередь, в лизосому. Как описано выше, это разделение фосфорилированных лизосомальных ферментов полностью противоположно тому, что происходит в нормальных клетках. Изготовление клеточных линий, используемых для продукций лизосомальных ферментов, сфокусировано на максимальном увеличении уровня манноза-6-фосфата на моль фермента, но оно характеризуется низкой удельной продуктивностью. Попытки продукции in vitro лизосомальных ферментов, содержащих высокие уровни групп манноза-6-фосфата, имели переменный успех (Canfield et al., патент США No. 6537785). Фермент in vitro обладает высокими уровнями манноза-6-фосфата, а также высокими уровнями немодифицированной концевой маннозы. Конкуренция между маннозой-6-фосфатом и рецепторами маннозы за лизосомальный фермент приводит к необходимости высоких доз фермента для эффективности и может привести к большей иммуногенности, вредной для субъекта, подвергаемого лечению.

Сульфатазы представляют собой уникальный подкласс лизосомальных ферментов. Сульфатазы отщепляют сульфатные сложные эфиры от различных субстратов, включая, например, стероиды, углеводы, протеогликаны и гликолипиды. Все известные эукариотические сульфатазы содержат остаток цистеина в их каталитическом центре. Активность сульфатазы требует посттрансляционной модификации этого остатка цистеина в C_α-формилглицин (FGly). Посттрансляционная активация фермента путем модификации цистеина в FGly происходит в эндоплазматической сети на несвернутых сульфатазах сразу после трансляции, перед направлением сульфатаз в лизосому (Dierks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11963-11968, 1997). Образующим формилглицин ферментом, который катализирует эту реакцию, является модифицирующий сульфатазу фактор 1 (SUMF1). На важность этой уникальной посттрансляционной модификации указывает то, что мутации в SUMF1, которые приводят к нарушению образования FGly в лизосомальных ферментах сульфатазах, приводят к множественной сульфатазной недостаточности (MSD) у людей (Diez-Ruiz et al., Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355-379, 2005).

Таким образом, терапевтическая эффективность препарата лизосомального фермента сульфатазы зависит от уровня манноза-6-фосфата и от присутствия активного фермента в этом препарате.

Таким образом, в данной области существует необходимость в эффективной и продуктивной системе для крупномасштабного изготовления терапевтически эффективных активных высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатаз для управления течением лизосомальных болезней накопления, вызываемых дефицитом таких лизосомальных ферментов сульфатаз или ассоциированных с ним.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение связано с открытием, что когда производное клеточной линии CHO-K1 (обозначаемое G71), которое является дефектным по эндосомальному закислению, конструируют таким образом, чтобы оно экспрессировало рекомбинантный модифицирующий сульфатазу фактор 1 (SUMF1) человека, модифицированные клетки G71 продуцируют с высоким выходом активные высокофосфорилированные рекомбинантные лизосомальные ферменты сульфатазы отчасти путем препятствования утрате материала в лизосомальном отделе продуцирующей клеточной линии. В одном варианте осуществления, изобретение относится к клеточной линии группы комплементации END3, которая коэкспрессирует рекомбинантный SUMF1 человека и рекомбинантную N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу (GALNS) человека, обеспечивая высокие выходы активного высокофосфорилированного фермента. Иллюстративными клеточными линиями являются G71, G71S и их производные, которые сохраняют требуемое свойство G71, т.е. способность продуцировать с высоким выходом активные высокофосфорилированные рекомбинантные лизосомальные ферменты сульфатазы. Это применение модифицированной клеточной линии CHO-K1 группы комплементации END3, коэкспрессирующей рекомбинантный SUMF1 человека и рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу, может быть особенно пригодным для изготовления активных высокофосфорилированных лизосомальных ферментов сульфатаз для применения в целях управления течением лизосомальными болезнями накопления путем фермент-заместительной терапии (ERT).

В первом аспекте, настоящее изобретение относится к новому способу продукции активных высокофосфорилированных рекомбинантных лизосомальных ферментов сульфатаз человека или их биологически активных фрагментов, мутантов, вариантов или производных в клетке CHO группы комплементации END3 или ее производном в количествах, которые обеспечивают их терапевтическое применение. В широком варианте осуществления, способ включает стадии: (a) культивирования происходящей из CHO клетки группы комплементации END3 или ее производного; (b) получения первого экспрессирующего вектора млекопитающих, способного экспрессировать активный высокофосфорилированный рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека или его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное в происходящей из CHO клетке группы комплементации END3 или ее производном; (c) получения второго экспрессирующего вектора млекопитающих, способного экспрессировать рекомбинантный модифицирующий сульфатазу фактор 1 (SUMF1) человека или его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное в происходящей из CHO клетке группы комплементации END3 или ее производном; (d) трансфекции происходящей из CHO клетки группы комплементации END3 или ее производного первым и вторым экспрессирующими векторами; (e) селекции и клонирования трансфектанта происходящей из CHO клетки группы комплементации END3 или ее производного, которая экспрессирует активный высокофосфорилированный рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека или его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное; и (f) оптимизации способа культивирования клеток для изготовления высокофосфорилированного рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы человека или его биологически активного фрагмента, мутанта, варианта или производного. Рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатаза человека выбран из группы, состоящей из арилсульфатазы A (ARSA), арилсульфатазы B (ARSB), идуронат-2-сульфатазы (IDS), сульфамидазы/гепарин-N-сульфатазы (SGSH), N-ацетилглюкозамин-сульфатазы (G6S) и N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS).

Способ вовлекает стадии трансфекции кДНК, кодирующей весь лизосомальный фермент сульфатазу или его часть, и кДНК, кодирующей весь SUMF1 человека или его часть, в происходящую из CHO клетку группы комплементации END3 или ее производное. В некоторых вариантах осуществления, первый и второй экспрессирующие векторы, которые способны экспрессировать кДНК, кодирующую активный высокофосфорилированный рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека и SUMF1 человека, соответственно, трансфицируют одновременно в происходящую из CHO клетку группы комплементации END3 или ее производное. В некоторых вариантах осуществления, первый и второй экспрессирующие векторы трансфицируют в происходящую из CHO клетку группы комплементации END3 или ее производное последовательно. В некоторых вариантах осуществления, используют кДНК, кодирующую полноразмерный лизосомальный фермент сульфатазу человека, в то время как в других вариантах осуществления используют кДНК, кодирующую его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное. В некоторых вариантах осуществления, используют кДНК, кодирующую полноразмерный SUMF1 человека, в то время как в других вариантах осуществления используют кДНК, кодирующую его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное. В некоторых вариантах осуществления, для одновременного переноса кДНК лизосомального фермента сульфатазы человека и SUMF1 или последовательно в происходящую из CHO клетку группы комплементации END3 или ее производное используют несколько экспрессирующих векторов. В некоторых вариантах осуществления, для одновременного переноса кДНК лизосомального фермента сульфатазы и SUMF1 человека в происходящую из CHO клетку группы комплементации END3 или ее производное используют один экспрессирующий вектор. В предпочтительном варианте осуществления, происходящая из CHO клетка группы комплементации END3 или ее производное представляет собой клеточную линию G71, клеточную линию G71S или производное G71 или G71S.

В предпочтительном варианте осуществления, способ включает продукцию активного высокофосфорилированного рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы человека, например арилсульфатазы A (ARSA), арилсульфатазы B (ARSB), идуронат-2-сульфатазы (IDS), сульфамидазы/гепарин-N-сульфатазы (SGSH), N-ацетилглюкозамин-сульфатазы (G6S) или N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS), клеточной линией CHO группы комплементации END3 или ее производным. В особенно предпочтительном варианте осуществления, способ включает продукцию активной высокофосфорилированной рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы человека (GALNS) клеточной линией CHO группы комплементации END3 или ее производным. Клеточная линия группы комплементации END3 представляет собой любую модифицированную клеточную линию CHO, которая сохраняет свойства клеточной линии группы комплементации END3, такие как дефектное эндосомальное закисление. В предпочтительном варианте осуществления, происходящая из CHO клетка группы комплементации END3 или ее производное представляет собой клеточную линию G71, клеточную линию G71S или производное G71 или G71S.

Во втором аспекте, настоящее изобретение относится к дефицитной по эндосомальному закислению клеточной линии, характеризующейся ее способностью продуцировать активные высокофосфорилированные рекомбинантные лизосомальные ферменты сульфатазы человека в количествах, которые дают возможность терапевтического применения лизосомального фермента сульфатазы. В предпочтительных вариантах осуществления, изобретение относится к происходящим из CHO-K1 клеточным линиям группы комплементации END3, обозначаемым G71, G71S, или к их производным, которые способны продуцировать с высоким выходом активные высокофосфорилированные рекомбинантные лизосомальные ферменты сульфатазы человека, тем самым позволяя крупномасштабную продукцию таких терапевтических лизосомальных ферментов сульфатаз. В более предпочтительных вариантах осуществления, клеточная линия экспрессирует и секретирует рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека в количестве по меньшей мере приблизительно 0,5, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,75, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1,0 и еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 1,25 пикограмм/клетка/сутки.

Клеточная линия группы комплементации END3 представляет собой любую модифицированную клеточную линию CHO, которая сохраняет свойства клеточной линии группы комплементации END3, такие как дефектное эндосомальное закисление. В одном варианте осуществления, клеточная линия CHO группы комплементации END3 образована из G71 или ее производного и содержит (a) экспрессирующий вектор для рекомбинантного модифицирующего сульфатазу фактора 1 (SUMF1) человека и (b) экспрессирующий вектор для рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы человека, где рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатаза человека выбран из группы, состоящей из арилсульфатазы A (ARSA), арилсульфатазы B (ARSB), идуронат-2-сульфатазы (IDS), сульфамидазы/гепарин-N-сульфатазы (SGSH), N-ацетилглюкозамин-сульфатазы (G6S) и N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS). В предпочтительном варианте осуществления, клеточная линия CHO группы комплементации END3 содержит экспрессирующий вектор для рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS) человека. В более предпочтительном варианте осуществления, клеточная линия CHO группы комплементации END3 экспрессирует и секретирует рекомбинантную GALNS человека. В другом предпочтительном варианте осуществления, клеточная линия CHO группы комплементации END3 выбрана из группы, состоящей из клона 4, клона 5, клона C6, клона C2, клона C5, клона C7, клона C10, клона C11 и клона C30. В более предпочтительном варианте осуществления, клеточная линия CHO группы комплементации END3 представляет собой клон C2. В другом предпочтительном варианте осуществления, клеточная линия CHO группы комплементации END3 адаптирована для роста в суспензии.

В третьем аспекте, изобретение относится к рекомбинантным лизосомальным ферментам сульфатазам человека, продуцированным способами по настоящему изобретению и, таким образом, присутствующим в количествах, которые делают возможным терапевтическое применение лизосомальных ферментов сульфатаз. Лизосомальные ферменты сульфатазы могут представлять собой полноразмерные белки или их фрагменты, мутанты, варианты или производные. В некоторых вариантах осуществления, лизосомальный фермент сульфатаза или его фрагмент, мутант, вариант или производное по этому изобретению можно, при желании, модифицировать для повышения их стабильности или фармакокинетических свойств (например, пегилирование, мутагенез, слияние, конъюгация). В предпочтительных вариантах осуществления, фермент представляет собой лизосомальный фермент сульфатазу человека, фрагмент лизосомального фермента сульфатазы человека, имеющий биологическую активность нативного фермента сульфатазы, или полипептид, который обладает существенной гомологией аминокислотной последовательности с лизосомальным ферментом сульфатазой человека. В некоторых вариантах осуществления, лизосомальный фермент сульфатаза представляет собой белок, источником или происхождением последовательности которого является человек или млекопитающее. В других вариантах осуществления, лизосомальный фермент сульфатаза является таким, что его дефицит приводит к заболеванию у человека, такому как метахромная лейкодистрофия, или MLD (т.е. арилсульфатаза A (ARSA)), синдром Марото-Лами, или MPS VI (т.е. арилсульфатаза B (ARSB)), синдром Хантера, или MPS II (т.е. идуронат-2-сульфатаза (IDS)), синдром Санфилиппо A, или MPS IIIa (т.е. сульфамидаза/гепарин-N-сульфатаза (SGSH)), синдром Санфилиппо D, или MPS IIId (т.е. N-ацетилглюкозамин-сульфатаза (G6S)), и синдром Моркио A, или MPS IVa (т.е. N-ацетилгалактозамин-6-сульфатаза (GALNS)). В особенно предпочтительном варианте осуществления, лизосомальный фермент сульфатаза является таким, что его дефицит вызывает синдром Моркио A или MPS IVa (т.е. N-ацетилгалактозамин-6-сульфатаза (GALNS)). В другом особенно предпочтительном варианте осуществления, лизосомальный фермент сульфатаза является таким, что его дефицит ассоциирован с заболеванием у человека, таким как множественная сульфатазная недостаточность или MSD (т.е. N-ацетилгалактозамин-6-сульфатаза (GALNS)).

Источником или происхождением последовательности лизосомального фермента сульфатазы также может быть человек или млекопитающее. В других вариантах осуществления изобретения, в каждом из его аспектов, лизосомальный фермент сульфатаза является идентичным по аминокислотной последовательности соответствующей части аминокислотной последовательности лизосомального фермента сульфатазы человека или млекопитающего. В других вариантах осуществления, полипептидная часть представляет собой нативный лизосомальный фермент сульфатазу из человека или млекопитающего. В других вариантах осуществления, полипептид лизосомального фермента сульфатазы является по существу гомологичным (т.е. по меньшей мере приблизительно на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным по аминокислотной последовательности) на протяжении по меньшей мере приблизительно 25, 50, 100, 150 или 200 аминокислот или полной длины полипептида аминокислотной последовательности нативного лизосомального фермента сульфатазы человека или млекопитающего. В других вариантах осуществления, субъектом, которому вводят лизосомальный фермент сульфатазу, является человек.

В предпочтительных вариантах осуществления, лизосомальный фермент сульфатаза представляет собой высокофосфорилированный рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека, продуцированный дефицитной по эндосомальному закислению клеточной линией, например, происходящей из CHO клеточной линии группы комплементации END3. Клеточная линия группы комплементации END3 представляет собой любую модифицированную клеточную линию CHO, которая сохраняет свойства клеточной линии группы комплементации END3, такие как дефектное эндосомальное закисление. В предпочтительном варианте осуществления, происходящая из CHO клетка группы комплементации END3 или ее производное представляют собой клеточную линию G71, клеточную линию G71S или производное G71 или G71S.

В более предпочтительных вариантах осуществления, рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатаза человека обладает высоким уровнем фосфорилированных олигосахаридов (т.е. более чем приблизительно 0,25, предпочтительно более чем 0,5 и более предпочтительно более чем приблизительно 0,75 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на белковую цепь). В более предпочтительных вариантах осуществления, фермент представляет собой высокофосфорилированную рекомбинантную N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу (GALNS) человека.

В более предпочтительных вариантах осуществления, рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатаза человека имеет высокий процент (т.е. по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%) остатка цистеина активного центра, преобразованного в C_α-формилглицин (FGly). В еще более предпочтительных вариантах осуществления, фермент представляет собой активную рекомбинантную N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу (GALNS) человека.

В более предпочтительных вариантах осуществления, рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатаза человека имеет высокий уровень фосфорилированных олигосахаридов (т.е. более чем приблизительно 0,25, предпочтительно более чем 0,5 и более предпочтительно более чем приблизительно 0,75 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на белковую цепь) и высокий процент (т.е. по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%) остатка цистеина активного центра, преобразованного в C_α-формилглицин (FGly). В наиболее предпочтительных вариантах осуществления, фермент представляет собой активную высокофосфорилированную рекомбинантную N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу человека (GALNS).

В четвертом аспекте, изобретение относится к способу очистки рекомбинантных лизосомальных ферментов сульфатаз человека, продуцированных способами по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления, лизосомальные ферменты сульфатазы очищают с использованием способа с двумя колонками (хроматография краситель-лиганд, например Blue-Sepharose, и анионообменная хроматография, например SE Hi-Cap), включающего по меньшей мере пять стадий очистки: (1) фильтрация собранного материала, т.е. культуральной среды, из клеточной линии CHO группы комплементации END3 или ее производного, которое экспрессирует модифицирующий сульфатазу фактор 1 (SUMF1) человека и рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека; (2) доведение pH отфильтрованного собранного материала до pH 4,5 (для индукции осаждения загрязняющих белков); (3) нанесение отфильтрованного собранного материала с доведенным pH на колонку краситель-лиганд, например колонку Blue-Sepharose, промывание колонки и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из колонки; (4) нанесение элюата из колонки краситель-лиганд в анионообенную колонку, например колонку SE Hi-Cap, промывание колонки и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из колонки; (5) ультрафильтрация и диафильтрация элюата из анионообменной колонки. Необязательно, отфильтрованный собранный материал стадии (1) концентрируют в 10-20 раз путем ультрафильтрации перед доведением pH. Необязательно, ультрафильтрованный и диафильтрованный лизосомальный фермент сульфатазу стадии (5) приготавливают в буфере для изготовления. В особенно предпочтительном варианте осуществления, лизосомальный фермент представляет собой рекомбинантную N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу (GALNS) человека.

В другом предпочтительном варианте осуществления, лизосомальные ферменты сульфатазы очищают с использованием способа с тремя колонками (хроматография с улавливанием, например анионообменная SE Hi-Cap; промежуточная хроматография, например краситель-лиганд Capto BlueZinc, Chelating Sepharose FF или Capto Adhere; и хроматография доочистки, например ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub или Phenyl Sepharose Low-Sub), включающего по меньшей мере пять стадий очистки: (1) ультрафильтрация собранного материала, т.е. культуральной среды клеточной линии CHO группы комплементации END3 или ее производного, которые экспрессируют модифицирующий сульфатазу фактор 1 (SUMF1) человека и рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека, например, с помощью Sartoon Cassettes (10 кДа, Hydrosart); (2) доведение pH отфильтрованного собранного материала до pH 4,5 (для индукции осаждения загрязняющих белков); (3) нанесения отфильтрованного собранного материала с доведенным pH на улавливающую колонку, например анионообменную колонку Fractogel EMD SE Hi-CAP (M), промывание колонки и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из колонки; (4) нанесения элюата из улавливающей колонки на промежуточную колонку, например колонку краситель-лиганд Capto BlueZinc, Chelating Sepharose FF или Capto Adhere, промывание колонки и элюирование лизосомального фермента сульфатазы из колонки; (5) нанесение элюата на колонку доочистки, например, ToyoPearl Butyl 650M, Phenyl Sepharose Hi-Sub или Phenyl Sepharose Low-Sub, промывание колонки и элюирование лизосомального фермента из колонки. Элюированный лизосомальный фермент стадии (5) приготавливают в буфере для изготовления. Необязательно, элюированный лизосомальный фермент сульфатазу стадии (5) подвергают ультрафильтрации, а затем приготавливают в буфере для изготовления. Необязательно, лизосомальный фермент сульфатазу из колонки стадии (4) подвергают воздействию pH 3,5 для инактивации вирусов низким pH перед нанесением в колонку доочистки стадии (5). В особенно предпочтительном варианте осуществления, лизосомальный фермент представляет собой рекомбинантную N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу (GALNS) человека.

В пятом аспекте, изобретение относится к очищенной активной высокофосфорилированной рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазе (GALNS) человека или ее биологически активному мутанту, варианту или производному, пригодным для лечения субъекта, страдающего лизосомальной болезнью накопления, которая вызвана (например, мукополисахаридоз типа IVa (MPS IVa), или синдром Моркио A) или ассоциирована с (например, множественная сульфатазная недостаточность (MSD)) дефицитом фермента GALNS. В предпочтительном варианте осуществления, очищенная активная высокофосфорилированная рекомбинантная GALNS человека: (a) имеет чистоту по меньшей мере приблизительно 90% при определении окрашиванием кумасси синим при SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях; (b) имеет по меньшей мере приблизительно 90% остатка цистеина в положении 53, преобразованного в С_α-формилглицин (FGly); и (c) является гликозилированной N-связанным гликозилированием по остаткам аспарагина в положениях 178 и 397, где по меньшей мере приблизительно 50% олигоманнозных цепей, связанных с остатком аспарагина в положении 178, являются бис-фосфорилированными. Очищенная активная высокофосфорилированная рекомбинантная GALNS человека имеет основную полосу на уровне приблизительно 55-60 кДа (т.е. предшественник GALNS человека, составляющий по меньшей мере приблизительно 75%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 85%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% видимых белков) и второстепенные полосы на уровне ~39 кДа и ~19 кДа (т.е. зрелая или процессированная GALNS человека, составляющая менее чем приблизительно 25%, предпочтительно менее чем приблизительно 15%, более предпочтительно менее чем приблизительно 10% и еще более предпочтительно менее чем приблизительно 5% видимых белков) при SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. В особенно предпочтительном варианте осуществления, очищенная активная высокофосфорилированная рекомбинантная GALNS человека имеет по существу одну полосу на уровне приблизительно 55-60 кДа (т.е. предшественник GALNS человека) при SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. В одном варианте осуществления, очищенная активная высокофосфорилированная рекомбинантная GALNS человека пригодна для лечения MPS IVa, или синдрома Моркио A. В одном варианте осуществления, очищенная активная высокофосфорилированная рекомбинантная GALNS человека пригодна для лечения MSD.

В шестом аспекте, изобретение относится к способу лечения заболеваний, вызываемых полностью или частично дефицитом лизосомального фермента сульфатазы или ассоциированных с его дефицитом. Способ включает введение терапевтического рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы человека, продуцированного способами по настоящему изобретению, где лизосомальный фермент сульфатаза связывается с рецептором MPR и транспортируется через клеточную мембрану, проникает в клетку и доставляется к лизосомам в клетке.

В одном варианте осуществления, способ включает лечение субъекта, страдающего дефицитом лизосомального фермента сульфатазы, включающее введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества указанного лизосомального фермента сульфатазы, где указанный лизосомальный фермент сульфатаза представляет собой рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека или его биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное, продуцированные происходящей из CHO клеткой группы комплементации END3 или ее производным. В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение терапевтического рекомбинантного лизосомального фермента сульфатазы человека или его биологически активного фрагмента, мутанта, варианта или производного отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемый носителем, разбавителем или эксципиентом. Предпочтительные варианты осуществления включают оптимизацию дозировки в соответствии с потребностями субъектов, подвергаемых лечению, предпочтительно млекопитающих и наиболее предпочтительно людей, для наиболее эффективного смягчения дефицита лизосомального фермента сульфатазы.

Такие терапевтические лизосомальные ферменты сульфатазы особенно пригодны, например, для лечения пациентов, страдающих лизосомальными болезнями накопления, вызываемыми дефицитом лизосомального фермента сульфатазы, таких как пациенты, страдающие метахроматической лейкодистрофией, или MLD, мукополисахаридозом типа VI (MPS VI), или синдромом Марото-Лами, мукополисахаридозом типа II (MPS II), или синдромом Хантера, мукополисахаридозом типа IIIa (MPS IIIa), или синдромом Санфилиппо A, мукополисахаридозом типа IIId (MPS IIId), или синдромом Санфилиппо D, и мукополисахаридозом типа IVa (MPS IVa), или синдромом Моркио A. В особенно предпочтительном варианте осуществления, лизосомальная болезнь накопления представляет собой MPS Iva, или синдром Моркио A, и лизосомальный фермент сульфатаза представляет собой рекомбинантную N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу (GALNS) человека. В других вариантах осуществления, изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим дефектный лизосомальный фермент сульфатазу, вызывающий лизосомальную болезнь накопления, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

В другом варианте осуществления, способ включает лечение субъекта, страдающего лизосомальной болезнью накопления, которая ассоциирована с дефицитом одного или нескольких лизосомальных ферментов сульфатаз, включающее введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества лизосомального фермента сульфатазы, где указанный лизосомальный фермент сульфатаза представляет собой рекомбинантную N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу (GALNS) человека или ее биологически активный фрагмент, мутант, вариант или производное, продуцированные происходящей из CHO клеткой группы комплементации END3 или ее производным. В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение терапевтического рекомбинантного фермента GALNS человека или его биологически активного фрагмента, мутанта, варианта или производного отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом. В особенно предпочтительном варианте осуществления, лизосомальная болезнь накопления представляет собой множественную сульфатазную недостаточность (MSD).

В особенно предпочтительных вариантах осуществления, происходящая из CHO клетка группы комплементации END3 или ее производное представляет собой клеточную линию G71, клеточную линию G71S или производное G71 или G71S.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу фермент-заместительной терапии путем введения терапевтически эффективного количества лизосомального фермента сульфатазы субъекту, нуждающемуся в фермент-заместительной терапии, где клетки пациента имеют лизосомы, которые содержат недостаточные количества лизосомального фермента сульфатазы, для предотвращения или уменьшения повреждения клеток, где в лизосомы проникают достаточные количества лизосомального фермента сульфатазы для предотвращения или уменьшения повреждения клеток. Клетки могут находиться в ЦНС или за ее пределами или не должны выходить из крови через стенки капилляров, эндотелиальные клетки которых плотно закрыты для диффузии активного вещества через плотные контакты.

В конкретном варианте осуществления, изобретение относится к композициям и фармацевтическим композициям, содержащим активный рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека, который имеет биологическую активность, которая является сниженной, дефектной или отсутствует в лизосоме-мишени, и который вводят субъекту. Предпочтительные активные лизосомальные ферменты сульфатазы человека включают, но не ограничиваются ими, арилсульфатазу A, арилсульфатазу B, идуронат-2-сульфатазу, сульфамидазу/гепаран-N-сульфатазу, N-ацетилглюкозамин-6-сульфатазу и N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазу. В предпочтительном варианте осуществления, N-ацетилгалактозамин-6-сульфатаза представляет собой активный рекомбинантный лизосомальный фермент сульфатазу человека.

В предпочтительном варианте осуществления, изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего MPS Iva, или синдромом Моркио A, или MSD, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS) человека, где рекомбинантная GALNS человека имеет высокий уровень преобразования остатка цистеина в активном центре в C_α-формилглицин (FGly) (т.е. по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% преобразования) и высокие уровни фосфорилирования (т.е. более чем приблизительно 0,25, предпочтительно более чем приблизительно 0,5 и более предпочтительно более чем приблизительно 0,75 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на белковую цепь).

В более предпочтительном варианте осуществления, изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего MPS Iva, или синдромом Моркио A, или MSD, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества рекомбинантной N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы (GALNS) человека, продуцированной клетками группы комплементации END3, где рекомбинантная GALNS человека имеет высокий уровень преобразования остатков цистеина в активном центре в C_α-формилглицин (FGly) (т.е. по меньшей мере приблизительно 50%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% преобразования) и высокие уровни фосфорилирования (т.е. более чем приблизительно 0,25, предпочтительно более чем 0,5 и более предпочтительно более чем приблизительно 0,75 бис-фосфорилированных олигоманнозных цепей на белковую цепь).

В особенно предпочтительном варианте осуществления, изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего MPS Iva, или синдромом Моркио A, или MSD, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества очищенной активной высокофосфорилированной рекомбинантной GALNS человека, которая: (a) имеет чистоту по меньшей мере приблизительно 90% при определении окрашиванием кумасси синим при SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях; (b) имеет по меньшей мере приблизительно 90% остатков цистеина в положении 53, преобразованных в С_α-формилглицин (FGly); и (c) является гликозилированной N-связанным гликозилированием по остаткам аспарагина в положениях 178 и 397, где по меньшей мере приблизительно 50% олигоманнозных цепей, свя