Профилактическое или лекарственное средство для воспалительного заболевания

Профилактическое или лекарственное средство для воспалительного заболевания

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым агентам для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, которые содержат антагонисты NR 10 в качестве действующих ингредиентов. Настоящее изобретение также относится к способам профилактики или лечения воспалительных заболеваний, в которых используются антагонисты NR 10.

Предшествующий уровень техники

Многие цитокины известны как гуморальные факторы, которые вовлечены в рост и дифференцировку различных типов клеток или в активацию функций дифференцированных зрелых клеток. Клетки, стимулированные цитокинами, продуцируют другие типы цитокинов, тем самым образуя в организме сети из множества цитокинов. Биологический гомеостаз поддерживается хрупким балансом взаимной регуляции между цитокинами в этих сетях. Полагают, что многие воспалительные заболевания являются результатом сбоя в таких цитокиновых сетях. Поэтому большое внимание привлекает антицитокиновая терапия на основе моноклональных антител. Например, была продемонстрирована высокая эффективность антител против TNF и рецептора IL-6 при клиническом применении. С другой стороны, есть много неудачных примеров, в которых не был получен терапевтический эффект при блокировании только одного цитокина, такого как IL-4, вследствие активации компенсаторных биохимических путей в реальных патологических состояниях.

Авторам настоящего изобретения удалось выделить новый цитокиновый рецептор NR 10, который имеет высокую степень гомологии с gp130, рецептором сигнального пути IL-6 (патентный документ 1). NR 10 образует гетеродимер с рецептором онкостатина М (OSMR) и функционирует в качестве рецептора IL-31 (непатентный документ 1). Сотрудниками компании Zymogenetics, Inc. было опубликовано, что у трансгенных мышей, со сверхэкспрессией IL-31, развивался зудящий дерматит (патентный документ 2).

Однако не было доказано, что увеличенная экспрессия цитокина у мышей или высокий уровень цитокина в крови в мышиной модели патологии в действительности вызывают болезнь. Не было информации о каких-либо терапевтических эффектах, получаемых при блокировании сигнала антителами. Например, зудящий дерматит развивается у трансгенных мышей, кератиноциты которых сверхэкспрессируют IL-18. Кроме того, концентрация IL-18 в крови повышается при развитии патологических состояний у мышей NC/Nga, которые являются моделью спонтанного атопического дерматита. На основе приведенных выше данных было высказано предположение, что причиной болезни является сверхэкспрессия IL-18. Однако в действительности введение нейтрализующих антител не имело никаких терапевтических эффектов (непатентный документ 2).

Как было описано выше, ингибирование функции цитокина не обязательно оказывает терапевтический эффект на заболевание, при котором повышен уровень экспрессии этого цитокина. На основе уровня экспрессии цитокина трудно предсказать, на какие заболевания в действительности будет оказываться терапевтический эффект. Поэтому важно найти заболевания, при которых ингибирование сигнального пути цитокина-мишени действительно оказывает терапевтический эффект.

Ниже описаны документы предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.

Патентный документ 1: WO 00/75314

Патентный документ 2: WO 03/060090

Непатентный документ 1: IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis, J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb; 117(2): 418-25

Непатентный документ 2: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga, British Journal of Dermatology 149: 39-45, 2003

Описание изобретения

[Проблемы, которые должно решить изобретение]

Настоящее изобретение было разработано в силу вышеописанных обстоятельств. Задачей настоящего изобретения является предоставление направленных против цитокинов методов лечения воспалительных заболеваний на основе антагонистов цитокиновых рецепторов. Более конкретно, задачей настоящего изобретения является обнаружение воспалительных заболеваний, при которых можно получить терапевтический эффект нейтрализующих антител против NR 10 и предоставление новых способов лечения таких заболеваний. Другой целью настоящего изобретения является предоставление нейтрализующих антител против NR 10 человека, которые применимы для лечения людей.

[Средство решения проблемы]

Авторы настоящего изобретения провели специальные исследования для решения вышеописанных задач. Авторы пытались оценить лекарственную эффективность нейтрализующих антител против мышиного NR 10 на мышиных моделях различных патологических состояний. Результаты продемонстрировали, что нейтрализующие антитела заметно подавляли симптомы в мышиной модели атопического дерматита с использованием мышей NC/Nga и в мышиной модели хронического дерматита, который получали многократным нанесением пикрилхлорида. Это подтвердило, что нейтрализующие антитела действительно пригодны в качестве терапевтического агента. В дополнение, было продемонстрировано, что антитела подавляют симптомы при коллагеновом артрите, в модели ревматизма и при коллагеназном артрите, модели остеоартрита. Эти результаты позволяют предположить, что NR 10-нейтрализующее антитело по настоящему изобретению можно использовать для профилактики или лечения хронического воспаления. Авторам настоящего изобретения также удалось получить антитела, нейтрализующие NR 10 человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к:

[1] агенту для профилактики или лечения воспалительного заболевания, в котором агент содержит антагонист NR 10 в качестве активного ингредиента;

[2] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [1], в котором антагонист представляет собой антитело, имеющую NR 10-нейтрализующую активность;

[3] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [2], в котором антитело представляет собой моноклональное антитело;

[4] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [2], в котором антитело представляет собой моноклональное антитело, имеющее активность, нейтрализующую NR 10 человека;

[5] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [2]-[4], в котором антитело представляет собой рекомбинантное антитело;

[6] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [5], в котором антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека;

[7] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [2]-[6], в котором агент содержит в качестве активного ингредиента фрагмент и/или модифицированный фрагмент антитела с NR 10-нейтрализующей активностью;

[8] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [1]-[7], в котором воспалительным заболеванием является атопический дерматит;

[9] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [1]-[7], в котором воспалительным заболеванием является хронический дерматит;

[10] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [1]-[7], в котором воспалительным заболеванием является ревматизм;

[11] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [1]-[7], в котором воспалительным заболеванием является остеоартрит;

[12] антителу, имеющему NR 10-нейтрализующую активность;

[13] антителу по п. [12], которое является моноклональным антителом;

[14] антителу по п. [12], в котором NR 10 является NR 10 человека;

[15] антителу по любому одному из пп. [12]-[14], которое является рекомбинантным антителом;

[16] антителу по п. [15], в котором рекомбинантное антитело является химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом человека;

[17] фрагменту и/или модифицированному фрагменту антитела по любому одному из пп. [12]-[16];

[18] способу профилактики или лечения воспалительного заболевания, который включает стадию введения антагониста NR 10 пациенту с воспалительным заболеванием и

[19] применению антагониста NR 10 для получения агента для профилактики или лечения воспалительного заболевания.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлен график, показывающий результаты наблюдений подавления роста клеток под воздействием BM095, добавленных в систему анализа клеточного роста с использованием IL-31-зависимых клеток Ba/F3. На оси абсцисс указаны расчетные концентрации mIL-31 (IL-31 мыши) в системе анализа, а на оси ординат указано количество клеток (OD450 (поглощение при 450 нм)). Добавленные количества BM095 (единица измерения: нг/мл) приведены в подписях к чертежу. Наблюдался эффект подавления роста клеток в зависимости от количества добавленных BM095.

На фиг.2 представлен график, показывающий терапевтический эффект, получаемый при введении анти-NR 10 антител мышам, являющимся моделью атопического дерматита. В группе, которой вводили анти-NR 10 антитела, наблюдалось значительное подавление воспалительного процесса по сравнению с группой отрицательного контроля (группой, которой вводили носитель).

На фиг.3 представлен график последовательного изменения веса тела после введения анти-NR 10 антител мышам, являющимся моделью атопического дерматита. В группе, получавшей существующий на сегодняшний момент противовоспалительный агент, наблюдали потерю веса. В отличие от этого, изменение веса не было замечено в группе, получавшей анти-NR 10 антитела. Таким образом, было подтверждено, что анти-NR 10 антитело является безопасным.

На фиг.4 представлен график, показывающий терапевтический эффект, получаемый при введении анти-NR 10 антител мышам-моделям хронического дерматита. В группе, которой вводили анти-NR 10 антитела, было обнаружено значительное подавление опухания ушной раковины.

На фиг.5 представлена фотография иммуногистохимического окрашивания ушной раковины мыши-модели хронического дерматита. Как и у людей, было найдено, что экспрессия мышиного NR 10 усилена в утолщенном эпидермисе.

На фиг.6 представлен график, показывающий эффект подавления артрита, получаемый при введении анти-NR 10 антител мышам-моделям вызванного коллагеном артрита.

На фиг.7 представлен график отношения между площадью под кривой (AUC) и концентрацией BM095, введенных мышам-моделям вызванного коллагеназой артрита (остеоартрита). AUC означает площадь под кривой изменения разницы между шириной левого и правого коленных суставов, которую определяют как величину, представляющую опухание правого коленного сустава.

На фиг.8 представлен график корреляции между концентрацией антител, нейтрализующих NR 10 человека (очищенных антител), и активности, подавляющей клеточный рост в присутствии IL-31. Антитела 1, 2 и 3 проявляли сильную NR 10-нейтрализующую активность.

На фиг.9 представлен график корреляции между концентрацией химерного антитела NA633 против NR 10 человека и активности, подавляющей клеточный рост в присутствии IL-31. NA633 проявляло сильную NR 10-нейтрализующую активность.

На фиг.10 представлена диаграмма сравнения аминокислотных последовательностей NR 10 человека и NR 10 яванского макака. Трансмембранная область подчеркнута двойной чертой.

На фиг.11 представлен график, показывающий активность, подавляющую клеточный рост, химерного антитела NA633 в стимулированной IL-31 человека клеточной линии BaF, экспрессирующей OSMR человека/NR 10 яванского макака. NA633 также показывало нейтрализующую активность по отношению к NR 10 яванского макака.

На фиг.12 представлен график изменения относительного веса тела у мышей-моделей DSS-колита (колита, вызываемого декстрансульфатом натрия).

На фиг.13 представлен график изменения толщины ушной раковины у мышей-моделей острого контактного дерматита, вызванного пикрилхлоридом.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к агентам для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, которые содержат антагонисты NR 10 в качестве активных ингредиентов. Основой настоящего изобретение является открытие авторами того, что антагонисты NR 10 (например, NR 10-нейтрализующие антитела) значительно подавляют симптомы у модельных мышей с атопическим дерматитом, хроническим дерматитом, ревматизмом, остеоартритом и т.п.

NR 10 является белком, который образует гетеродимер с рецептором онкостатина М (OSMR) и функционирует как рецептор IL-31. NR 10 также известен под другими названиями, такими как glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL (J Biol Chem 278, 49850-9, 2003) и IL-31RA (Nat Immunol 5, 752-60, 2004). NR 10 по настоящему изобретению включает белки, имеющие такие названия. NR 10 по настоящему изобретению также включает NR 10, полученный из человека, мыши и других млекопитающих. Предпочтительный NR 10 включает NR 10, полученный из человека и мыши, но не ограничен этим. У NR 10 человека существует множество известных сплайсинговых вариантов (WO 00/075314). Из вышеописанных сплайсинговых вариантов NR 10.1 состоит из 662 аминокислот и включает в себя трансмембранный домен. NR 10.2 является растворимым рецептор-подобным белком, состоящим из 252 аминокислот без трансмембранного домена. Кроме того, известные сплайсинговые варианты NR 10, которые функционируют как трансмембранные рецепторные белки, включают NR 10.3 и IL-31RAv3. NR 10 человека по настоящему изобретению конкретно не ограничен при условии, что он образует гетеродимер с рецептором онкостатина М (OSMR) и функционирует в качестве рецептора IL-31. Предпочтительный NR 10 включает NR 10.3 (также упоминаемый как ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) и IL-31RAv3. NR 10.3 (IL-31RAv4) состоит из 662 аминокислот (WO 00/075314; Nat Immunol 5, 752-60, 2004), а IL-31RAv3 состоит из 732 аминокислот (номер доступа в базе данных GenBank: NM_139017). Аминокислотная последовательность IL-31RAv4 показана в SEQ ID NO: 6, а аминокислотная последовательность IL-31RAv3 показана в SEQ ID NO: 7. Кроме того, NR 10, полученный из мыши, включает белки, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

Антагонисты NR 10 по настоящему изобретению относятся к веществам, которые связывают NR 10 и блокируют передачу сигнала внутри клетки, основанную на активации NR 10, таким образом вызывая потерю или подавление физиологической активности клеток. В данном описании физиологическая активность включает, например, индукцию или подавление продукции физиологически активных веществ (например, хемокинов и воспалительных цитокинов), усиление или ослабление секреции веществ, ростовой активности, вызывающей рост активности, выживания клеток, дифференцировки клеток, вызывающей дифференцировку активности, транскрипционной активности, мембранного транспорта, связывающей активности, протеолитической активности, фосфорилирования/дефосфорилирования, окислительной/восстановительной активности, переноса, нуклеолитической активности, дегидратации, вызывающей клеточную смерть активности и вызывающей апоптоз активности, но не ограничена этим.

Наличие антагонистической активности можно определить способами, которые известны специалистам в данной области. Например, тестируемые соединения вводят в контакт с экспрессированным на поверхности клеток NR 10 в присутствии лиганда и определяют передается ли сигнал внутри клетки, что является индикатором активации NR 10. Это можно определить, например, способом, описанным в документе «Dillon SR, et al., Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol. 2004 Jul; 5(7):752-60». Считается, что соединения, которые ингибируют передачу внутриклеточного сигнала в ответ на стимуляцию лигандом, действуют как антагонисты NR 10.

Антагонисты по настоящему изобретению могут быть природными или искусственными соединениями. В качестве антагонистов по настоящему изобретению можно использовать известные соединения. Также можно использовать новые соединения, у которых антагонистическая активность была определена способами, описанными выше.

В варианте осуществления настоящего изобретения антагонисты NR 10 включают антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность. «Антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность», по настоящему изобретению относятся к антителам, которые подавляют физиологическую активность на основе NR 10. «Антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность», по настоящему изобретению могут быть поликлональными или моноклональными антителами, и, в качестве предпочтительного варианта осуществления изобретения, включают моноклональные антитела.

Такие моноклональные антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность, можно получать, например, по следующей методике: анти-NR 10 моноклональные антитела получают с использованием антигена NR 10 или его фрагмента, полученных из млекопитающего, такого как человек или мышь, известными способами, а затем имеющие NR 10-нейтрализующую активность антитела отбирают из полученных таким образом анти-NR 10 моноклональных антител. Более конкретно, иммунизацию проводят стандартными методами иммунизации, используя в качестве сенсибилизирующего антигена желаемый антиген или клетки, экспрессирующие желаемый антиген. Анти-NR 10 моноклональные антитела можно получить слиянием полученных иммунных клеток с известными родительскими клетками, используя стандартные методы слияния клеток, и проводя их скрининг на клетки, продуцирующие моноклональные антитела (гибридомы), стандартными методами скрининга. Животные, которые должны быть иммунизированы, включают, например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, овцы, обезьяны, козы, ослы, коровы, лошади и свиньи. Антигены можно получить, используя известную последовательность гена NR 10, известными способами, например, способами с применением бакуловирусов (например, WO 98/46777). Как описано ниже в примерах данного описания, антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность, можно отобрать, например, тестированием эффекта подавления роста IL-31-зависимой клеточной линии после добавления тестируемого антитела к IL-31-зависимой клеточной линии. Считается, что антитела, которые подавляют рост IL-31-зависимой клеточной линии в описанном выше способе, имеют NR 10-нейтрализующую активность.

Гибридомы можно получить, например, по способу Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) или т.п. Если иммуногенность антигена низкая, иммунизацию можно проводить после присоединения антигена к макромолекуле с высокой иммуногенностью, такой как альбумин.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность, включают моноклональные антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека. Нет никаких особых ограничений на иммуноген для получения моноклональных антител, имеющих активность, нейтрализующую NR 10 человека, при условии, что он позволяет получать антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека. Например, известно, что существуют множество вариантов NR 10 человека. В качестве иммуногенов может использоваться любой из вариантов при условии, что он позволяет получить антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека. В качестве альтернативы, как иммуноген в тех же условиях можно использовать пептидный фрагмент NR 10 или последовательность природного NR 10 с искусственно внесенными мутациями. NR 10.3 человека является предпочтительным иммуногеном для получения антител по настоящему изобретению, которые имеют NR 10-нейтрализующую активность.

В данном описании вышеописанные антитела по настоящему изобретению особо не ограничены при условии, что они имеют NR 10-нейтрализующую активность. Эти антитела также включают рекомбинантные антитела, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека. Химерные антител включают в себя, например, константные области тяжелой и легкой цепей антитела человека и вариабельные области тяжелой и легкой цепей млекопитающего, не являющегося человеком, такого как мышь. Химерные антитела можно получить известными способами. Например, антитела можно получить клонированием гена антитела из гибридов, встраиванием его в соответствующий вектор и введением конструкции в хозяев (см., например, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Конкретнее, кДНК вариабельных областей (V-областей) синтезируют на мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После того, как будут получены кДНК, кодирующие V-области представляющего интерес антитела, их соединяют с кДНК, кодирующими константные области (С-области) желаемого антитела человека. Полученные конструкции встраивают в экспрессионные векторы. В качестве альтернативы, кДНК, кодирующие V-области антитела, можно встроить в экспрессионные векторы, содержащие С-области антитела человека. кДНК встраивают в экспрессионные векторы таким образом, что они экспрессируются под контролем экспрессии регуляторных областей, например, энхансеров и промоторов. На следующей стадии трансформируют клетки-хозяева экспрессионными векторами, чтобы осуществить экспрессию химерных антител.

Гуманизированное антитело, которое также называют видоизмененным антителом человека, получают, замещая определяющими комплементарность областями (CDR) антитела млекопитающего, не являющегося человеком, такого как мышь, CDR антитела человека. Также известны общепринятые методики генетической рекомбинации для получения таких антител. Конкретнее, последовательность кДНК, разработанную для лигирования CDR мышиного антитела с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, сконструированных таким образом, чтобы они содержали перекрывающиеся части на своих концах. Гуманизированное антитело можно получить (1) лигированием полученной ДНК с ДНК, которая кодирует константную область антитела человека; (2) включением этой конструкции в экспрессионный вектор; и (3) переносом вектора в хозяина для получения антител (см. европейскую патентную заявку № EP 239,400 и международную публикацию патентной заявки № WO 96/02576). FR антитела человека, которые лигируют через CDR, выбирают такие, где CDR образует подходящий антигенсвязывающий участок. При необходимости, аминокислоты в каркасном участке вариабельной области антитела можно заменить таким образом, чтобы CDR видоизмененного антитела человека образовывала соответствующий антигенсвязывающий участок (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Также известны способы получения антител человека. Например, желаемые антитела человека с антигенсвязывающей активностью можно получить (1) сенсибилизацией лимфоцитов человека антигенами, представляющими интерес, или клетками, экспрессирующими представляющий интерес антиген in vitro; и (2) слиянием сенсибилизированных лимфоцитов с клетками миеломы человека, такими как U266 (см. публикацию японской патентной заявки Kokoku № (JP-B) H01-59878 (проверенная экспертом, одобренная японская патентная заявка, опубликованная для подачи возражения)). В качестве альтернативы желаемое антитело человека также можно получить использованием желаемого антигена для иммунизации трансгенного животного, которое включает в себя полный репертуар генов антител человека (см. международные публикации патентных заявок №№ WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Кроме того, известны методики для получения антител человека пэннингом фаговой библиотеки антител человека. Например, на поверхности фагов экспрессируют вариабельные области антитела человека в виде одноцепочечного антитела (scFv) с использованием метода фагового дисплея, и отбирают фаги, которые связываются с антигеном. Анализируя гены отобранных фагов, можно определить последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области антител человека, которые связывают антиген. Если последовательности ДНК scFv, которые связывают антиген, определены, то для получения антител человека можно сконструировать соответствующие экспрессионные векторы, включающие в себя эти последовательности. Такие методы хорошо известны (см., WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388).

Аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи может быть аминокислотная последовательность с заменой, делецией, дополнением и/или вставкой одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела с подтвержденной NR 10-нейтрализующей активностью при условии, что сохраняется NR 10-нейтрализующая активность. Известные специалистам в данной области способы получения аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, которое содержит замену, делецию, дополнение и/или вставку одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, включают известные способы введения мутаций в белки. Например, мутантов, функционально равных вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, специалисты в данной области могут получить введением соответствующих мутаций в аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, используя сайт-направленный мутагенез (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492) или т.п. Таким образом, вариабельные области тяжелых цепей или вариабельные области легких цепей, которые содержат мутации одной или более аминокислот в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, также включены в вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи по настоящему изобретению.

При замене аминокислотного остатка предпочтительной мутацией аминокислоты является замена на другую аминокислоту (аминокислоты), которые сохраняют свойства боковой цепи аминокислоты. Примерами свойств боковых цепей аминокислот являются: гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y и V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S и T), аминокислоты, содержащие алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I и P), аминокислоты, включающие в себя боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (S, T и Y), аминокислоты, включающие в себя боковые цепи, содержащие серу (C и M), аминокислоты, включающие в себя боковые цепи, содержащие карбоновую кислоту и амид (D, N, E и Q), аминокислоты, содержащие основные боковые цепи (R, K и H), и аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи (H, F, Y и W), (аминокислоты в круглых скобках представлены однобуквенным кодом). Аминокислотные замены внутри каждой группы называются консервативными заменами. Уже известно, что полипептид, включающий в себя модифицированную аминокислотную последовательность, в которой один или более аминокислотных остатков в данной аминокислотной последовательности удалены, добавлены и/или заменены другими аминокислотами, может сохранять исходную биологическую активность (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1984) 81:5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-500; Wang, A. et al., Science (1984) 224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409-13). Такие мутанты включают в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи по настоящему изобретению, более предпочтительно, идентична, по меньшей мере, на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 95%. В данном описании идентичность последовательностей определяют как процент остатков, идентичных остаткам в исходной аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, определяемый после выравнивания последовательностей и введения при необходимости соответствующих разрывов, для того чтобы максимизировать совпадение последовательностей. Идентичность аминокислотных последовательностей можно определить способом, описанным выше.

В качестве альтернативы аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, которая содержит замену, делецию, дополнение и/или вставку одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи и сохраняет NR 10-нейтрализующую активность, можно получить из нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется при жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи. Жесткие условия гибридизации для выделения нуклеиновой кислоты, гибридизующейся при жестких условиях с нуклеиновой кислотой, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, включают, например, условия - 6М мочевину, 0,4% SDS, 0,5× SSC и 37°C, или условия гибридизации с жесткостью, равной этому. В более жестких условиях, например, условиях 6М мочевины, 0,4% SDS, 0,1× SSC и 42°C, ожидается выделение нуклеиновой кислоты с большей гомологией. Последовательности выделенных нуклеиновых кислот можно определить известными способами, описанными ниже. Общая гомология по нуклеотидной последовательности выделенной нуклеиновой кислоты составляет, по меньшей мере, 50% или выше идентичности по последовательности, предпочтительно, 70% или выше, более предпочтительно, 90% или выше (например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше).

Нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется при жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, также можно выделить, используя вместо вышеописанных способов с использованием гибридизационных методик методы амплификации генов с праймерами, синтезированными на основе информации о нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Более конкретно идентичность двух нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей можно определить, используя алгоритм BLAST, созданный Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5873-7). Программы, такие как BLASTN и BLASTX, были разработаны на основе этого алгоритма (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). Для анализа нуклеотидных последовательностей согласно BLASTN, основанной на BLAST, устанавливают параметры, например, счет = 100 и длина слова = 12. С другой стороны, параметры, используемые для анализа аминокислотных последовательностей BLASTX, основанной на BLAST, включают, например, счет = 50 и длину слова = 3. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST используются параметры по умолчанию каждой программы. Для таких анализов в данной области известны особые методики (см. веб-сайт Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

В качестве альтернативы антитела по настоящему изобретению могут быть мини-телами. Такие мини-тела по настоящему изобретению включают фрагменты антител, у которых отсутствуют некоторые участки полноразмерного антитела (например, полноразмерного IgG), и которые конкретно не ограничены при условии, что они сохраняют NR 10-нейтрализующую активность. Мини-тела по настоящему изобретению конкретно не ограничены при условии, что они представляют собой участки полноразмерных антител. Мини-тела, предпочтительно, включают в себя вариабельную область тяжелой цепи (VH) или вариабельную область легкой цепи (VL). Особенно предпочтительные мини-тела включают в себя и VH, и VL.

Мини-тела по настоящему изобретению, предпочтительно, имеют меньший молекулярный вес, чем полноразмерные антитела. Однако мини-тела могут образовывать мультимеры, например, димеры, тримеры или тетрамеры, и поэтому их молекулярный вес может быть выше, чем молекулярный вес полноразмерных антител.

Мини-тела по настоящему изобретению включают, например, scFv-антитела. ScFv-антитела представляют собой одноцепочечные полипептиды, которые получают объединением вариабельной области тяжелой цепи ([VH]) и вариабельной области легкой цепи ([VL]) через линкер или аналогичным образом (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Plickthun “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” Vol. 113, eds., Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp. 269-315, (1994)). Порядок расположения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, которые должны быть соединены вместе, конкретно не ограничен, и их можно расположить в любом порядке. Примеры расположений приведены ниже.

[VH] линкер [VL]

[VL] линкер [VH]

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи может включать в себя замену, делецию, дополнение и/или вставку. Кроме того, у вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи также могут отсутствовать некоторые участки или могут быть добавлены другие полипептиды при условии, что соединенные вместе они связывают антиген. В качестве альтернативы вариабельные области могут быть химеризованы или гуманизированы.

В настоящем изобретении линкеры, которые связывают вариабельные области антитела, включают в себя произвольные пептидные линкеры, которые можно ввести, используя методы генетической инженерии, или синтетические линкеры (например, линкеры, раскрытые в «Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996»).

Предпочтительными линкерами в настоящем изобретении являются пептидные линкеры. Длина пептидных линкеров конкретно не ограничена, и специалисты в данной области могут соответственно выбрать длину в зависимости от своей цели. Типичной является длина до 100 аминокислот, предпочтительно, от 3 до 50 аминокислот, более предпочтительно, от 5 до 30 аминокислот, и, особенно предпочтительно, от 12 до 18 аминокислот (например, 15 аминокислот).

Аминокислотные последовательности таких пептидных линкеров включают, например:

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 8)

Ser·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 9)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 10)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 11)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 12)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 13)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 14)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 15)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 10))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 11))n

где n является целым числом от 1 или больше.

Синтетические линкеры (химические сшивающие агенты) включают сшивающие агенты, которые обычно используют для перекрестного сшивания пептидов, например, N-гидроксисукцинимид (NHS), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS³), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP), дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), этиленгликоль-бис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинат) (sulfo-EGS), дисукцинимидилтартарат (DST), дисульфосукцинимидилтартарат (sulfo-DST), бис[2-(сукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES), и бис[2-(сульфосукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (sulfo-BSOCOES). Эти сшивающие агенты коммерчески доступны.

Антитела по настоящему изобретению включают антитела, у которых к аминокислотной последовательности антитела по настоящему изобретению добавлены два или более аминокислотных остатка. Кроме того, в настоящее изобретение включены слитые белки, которые являются результатом слияния одного из вышеописанных антител и второго пептида или белка. Слитые белки можно получить лигированием с сохранением рамки считывания полинуклеотида, кодирующего антитело по настоящему изобретению, и полинуклеотида, кодирующего второй пептид или полипептид, встраиванием этой конструкции в экспрессионный вектор и экспрессией слитой конструкции в хозяине. Для этой цели подходят некоторые методики, известные специалистам в данной области. Добавочный пептид или полипептид для слияния с антителом по настоящему изобретению может