Улучшенные молекулы, связывающиеся с nogo-а и их фармацевтическое применение

Улучшенные молекулы, связывающиеся с nogo-а и их фармацевтическое применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к улучшенным молекулам, связывающимися с Nogo-А, таким, например, как моноклональные антитела, их производные или Fab-фрагменты.

Предпосылки создания изобретения

Регенерация нейронов после травмы центральной нервной системы (ЦНС) взрослых носит ограниченный характер из-за присутствия ингибирующего миелинового слоя, который составляет оболочку аксонов, и образования рубцовой ткани. За последние пять лет достигнуты значительные успехи в исследовании молекулярных основ неспособности ЦНС к самопроизвольной регенерации после травмы. Главным препятствием на пути регенерации аксона, прежде всего непосредственно после травмы, является присутствие ингибиторов в миелине. В настоящее время установлено, что эффективными ингибиторами роста невритов являются Nogo-A, миелин-ассоциированный гликопротеин (МАГ) и миелин-олигодендтроцит-ассоциированный гликопротеин (ОМГП). Кроме того, в миелине присутствуют также другие ингибирующие компоненты, такие как хондроитинсульфатпротеогликаны. Nogo-A является членом семейства белков ретикулина и содержит по меньшей мере два биологически активных и фармакологически различных домена, обозначаемых амино-Nogo и Nogo-66. Хотя рецепторный участок первого домена пока неизвестен, установлено, что Nogo-66 подавляет рост нейронов in vitro и in vivo, воздействуя на нейронный рецептор NgR. Кроме Nogo-66 МАГ и ОМГП связываются также с NgR с высокой аффинностью и подавляют рост невритов.

Исследуются также новые подходы для усиления регенерации невритов, которые включают деградацию рубцовой ткани с использованием фермента хондроитиназы АВС, методики сшивания с использованием нейросенсорных (обонятельных) клеток и стволовых клеток, а также белковых ростовых факторов для стимулирования роста нейронов. Блокирующее действие на рост невритов создается благодаря модуляции внутриклеточных медиаторов передачи сигнала, таких как Rho, мембранная гуанозинтрифосфатаза (ГТФаза), которая является ключевым звеном в ингибировании роста аксонов. Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) может действовать в обход миелин-ассоциированного ингибирования in vitro и индуцировать регенерацию in vivo. Для индуцирования регенерации нейронов и функционального восстановления на модели крыс после повреждения спинного мозга можно использовать пептидный ингибитор рецептора NgR (NEP 1-40).

Наряду с использованием вышеописанных подходов много внимания уделяется также применению некоторых моноклональных антител для нейтрализации соединений, подавляющих рост невритов в центральной и периферической нервной системе, прежде всего нейтрализации ингибирующего действия Nogo-A на рост невритов. Таким образом, установлено, что моноклональные антитела IN-1 или Fab-фрагмент IN-1 индуцируют рост невритов in vitro и усиливают рост и регенерацию in vivo (Schwab M.E. и др., Physiol. Rev., 76, 319-370 (1996)). Альтернативные относительно IN-1 антитела описаны в WO 2004/052932 (11С7-Ab) и WO 2005/028508 (3А6-Ab). После анализа ингибирующего действия на рост невритов различных доменов Nogo-A было выявлено несколько ингибирующих доменов (Chen и др., Nature, 403, 434-439 (2000), GrandPre и др., Nature, 403, 439-444 (2000), Prinjha и др., Nature, 403, 383-384 (2000).

Природные иммуноглобулины или антитела обычно представляют собой Y-образная мультимерная молекула, содержащая антиген-связывающий участок в концевом фрагменте каждого верхнего ответвления. Остальная часть молекулы прежде всего стержень Y-образной структуры выполняет эффекторные функции иммуноглобулинов. Антитела содержат 2 тяжелых и 2 легких цепи. Тяжелая и легкая цепи включают вариабельный домен и консервативный участок. Антиген-связывающий участок состоит из вариабельного домена тяжелой цепи, ассоциированного с вариабельным доменом легкой цепи. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей характеризуются одинаковой общей структурой. Более конкретно, антиген-связывающие характеристики антител по существу определяются тремя конкретными областями в вариабельном домене тяжелой и легкой цепей, которые называются гипервариабельными участками комплементарности (CDR). Указанные три гипервариабельные области чередуются с четырьмя каркасными участками (FR), которые характеризуются относительно консервативной аминокислотной последовательностью и принимают косвенное участие в связывании с антигеном. CDR образуют петли и располагаются в непосредственной близости к каркасным участкам, которые в основном образуют конформацию β-складчатого листа. CDR тяжелой цепи вместе с CDR легкой цепи главным образом составляют антиген-связывающий участок молекул антител. Состав областей FR или CDR обычно определяют сравнением аминокислотных последовательностей ряда антител, продуцируемых в одном виде животного. Общее правило идентификации областей CDR и FR известно специалистам в данной области и описано в соответствующем вебучастке.

В общем случае, в настоящее время существует необходимость в новых и улучшенных способах индуцирования регенерации нервной ткани после повреждения центральной нервной системы (ЦНС) взрослых.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к новым моноклональным антителам человека, которые обладают более высокой эффективностью при модулировании активности Nogo-A в экспериментах in vitro и in vivo и оказывают положительное действие на регенерацию невритов при повреждении центральной нервной системы (ЦНС) взрослых. Следовательно, в изобретении предлагаются новые молекулы, связывающиеся с белком Nogo-A или его фрагментами.

В одном варианте изобретения предлагается молекула, содержащая по меньшей мере один антиген-связывающий участок, который специфично связывается с полипептидом Nogo-A человека (SEQ ID NO: 2) или NiG человека (SEQ ID NO: 3), причем указанный антиген-связывающий участок включает:

- гипервариабельные области CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), соответственно, и

- гипервариабельные области CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13), соответственно.

В другом варианте антиген-связывающий участок указанной молекулы по изобретению включает:

- гипервариабельные области CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), и

- гипервариабельные области CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13).

В еще одном варианте изобретения предлагаются связывающие молекулы, которые содержат

- по меньшей мере одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, который включает (1) вариабельный домен, включающий гипервариабельные области CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10) и (2) константный сегмент или фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и

- по меньшей мере одну легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, который включает (1) вариабельный домен, включающий гипервариабельные области CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13) и (2) константный сегмент или фрагмент легкой цепи иммуноглобулина человека.

В другом варианте связывающая молекула по изобретению характеризуется константой диссоциации K_D<1000 нМ.

В альтернативном варианте связывающей молекулы по изобретению константный сегмент или фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека представляет собой тип (γ4), а константный сегмент или фрагмент легкой цепи иммуноглобулина человека представляет собой тип (κ).

В другом варианте связывающая молекула по изобретению представляет собой моноклональные антитела человека или химерные или гуманизированные моноклональные антитела.

В еще одном варианте связывающая молекула по изобретению включает одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 4 (тяжелая цепь IgG1), SEQ ID NO: 5 (легкая цепь IgG1), SEQ ID NO: 24 (тяжелая цепь IgG4) и SEQ ID NO: 25 (легкая цепь IgG4).

Кроме того, в изобретении также предлагается изолированный полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую связывающую молекулу по изобретению.

В некоторых вариантах указанный изолированный полинуклеотид по изобретению включает:

- по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, или

- по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

В других предпочтительных вариантах указанный полинуклеотид по изобретению включает:

- полинуклеотидную последовательность, включающую SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, и

- полинуклеотидную последовательность, включающую SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

В еще одном предпочтительном варианте указанный полинуклеотид по изобретению включает:

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 и/или полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, или

- полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 26 и/или полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 28.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается вектор экспрессии, включающий полинуклеотид по изобретению, указанный выше.

Кроме того, в изобретении предлагается система экспрессии, включающая вектор экспрессии, указанный выше, причем указанная система экспрессии или часть ее способна продуцировать полипептид по изобретению, указанный выше, а указанная система экспрессии или часть ее присутствует в совместимой клетке хозяина.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается изолированная клетка хозяина, которая включает указанный выше вектор.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается изолированная композиция, содержащая связывающую молекулу по изобретению и носитель.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается изолированная композиция, содержащая полинуклеотид по изобретению и носитель.

Кроме того, в настоящем изобретении также предлагается изолированная композиция, содержащая вектор экспрессии по изобретению или клетку хозяина по изобретению.

В изобретение также предлагается способ введения связывающей молекулы по изобретению субъекту, который нуждается в лечении, для лечения заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы.

В изобретении также предлагается фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу по изобретению, полинуклеотид по изобретению, вектор экспрессии или систему экспрессии по изобретению, соответственно, или клетку хозяина по изобретению, в смеси по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. В одном из вариантов указанная фармацевтическая композиция является композицией с замедленным высвобождением.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ лечения заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы, заключающийся в том, что субъекту, который нуждается в таком лечении, вводят эффективное количество связывающей молекулы по изобретению, полинуклеотид по изобретению, вектор экспрессии или систему экспрессии по изобретению, соответственно, или клетку хозяина по изобретению. В предпочтительном варианте заболевание представляет собой нейродегенеративное заболевание, выбранное из группы, включающей болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (БАС), патологическую деменцию Леви или другие виды деменции, заболевания после черепной, церебральной или спинномозговой травмы, инсульт и демиелинизирующее заболевание. В другом предпочтительным варианте демиелинизирующее заболевание выбирают из группы, включающей рассеянный склероз, монофазную демиелинизацию, энцефаломиелит, многоочаговую лейкодистрофию, панэнцефалит, болезнь Маркиафавы-Бигнами, демиелинизацию варолиева моста, адренолейкодистрофию, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спонгиозную дегенерацию, болезнь Александера, болезнь Канавана, метахроматическую лейкодистрофию и болезнь Краббе.

В другом варианте заболевание представляет собой дегенеративное глазное нарушение, которое может непосредственно или опосредованно включать дегенерацию клеток сетчатки или роговицы. В предпочтительном варианте дегенеративное глазное нарушение представляет собой заболевание, выбранное из группы, включающей ишемические ретинопатии, раннюю ишемическую глазную невропатию, глазной неврит, возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, кистозный отек желтого пятна (КОП), пигментозную дистрофию сетчатки, болезнь Штаргардта, желточную макулярную дистрофию (болезнь Беста), врожденный амавроз Лебера и другие виды наследственной дегенерации сетчатки, патологическую близорукость, ретролетальную фиброплазию и наследственную глазную невропатию Лебера, побочные действия после пересадки роговицы или хирургии хрусталика и герпетический кератит. В другом варианте заболевание представляет собой психиатрическое состояние. Предпочтительно указанное психиатрическое состояние выбирают группы, включающей шизофрению и депрессию.

В указанных выше способах лечения введение предпочтительно проводят интракраниально или интратекально.

Кроме того, в изобретении также предлагается способ получения связывающей молекулы по изобретению, который заключается в том, что проводят экспрессию полинуклеотида по изобретению в составе вектора экспрессии или в системе по изобретению с использованием технологии рекомбинантной ДНК или химического синтеза.

Кроме того, в изобретении предлагается способ введения фармацевтической композиции по изобретению местно в очаг повреждения.

Наконец, в изобретении предлагается способ введения одного или более следующих продуктов, выбранных из группы, включающей связывающую молекулу по изобретению, полинуклеотид по изобретению, вектор экспрессии или систему по изобретению, клетку хозяина по изобретению, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы.

В изобретении также предлагается способ получения связывающей молекулы по изобретению и полинуклеотида, вектора экспрессии молекулы с помощью технологии рекомбинантной ДНК или химического синтеза, кодирующего такую связывающую молекулу.

В настоящем изобретении также предлагается фармацевтическая композиция, включающая связывающую молекулу, полинуклеотид, вектор экспрессии или систему или клетку хозяина по настоящему изобретению в смеси по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Кроме того, предлагаются продукты, содержащие указанные связывающие молекулы, полинуклеотид, вектор экспрессии или систему или указанную клетку хозяина, или его фармакологически приемлемое производное, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ лечения заболевания периферической (ПНС) и/или центральной (ЦНС) нервной системы, заключающийся в том, что субъекту, который нуждается в таком лечении, вводят эффективное количество связывающей молекулы, полинуклеотида, вектора экспрессии или системы экспрессии или клетку хозяина.

В настоящем изобретении также приводятся примеры того, что фармакологические композиции и продукты можно использовать для замедленного высвобождения связывающих молекул и/или для местного депонирования связывающей молекулы в очаге поражения.

Краткое описание фигур

Фиг.1

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO 7) и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO 5) вариабельных областей легкой цепи антител 6A3-IgG1. Неподчернутый сегмент соответствует лидерному пептиду (SED ID NO 22) и кодирующей его нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO 23).

Фиг.2

Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO 6) и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO 4) вариабельных областей тяжелой цепи антител 6A3-IgG1. Неподчернутый сегмент соответствует пептиду (SED ID NO 20) и кодирующей его нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO 21).

Фиг.3

Кодирующие области легкой (SEQ ID NO 28, выше) и тяжелой (SEQ ID NO 26, ниже) вариабельного сегмента 6A3-Ig4.

Фиг.4

Аминокислотные последовательности тяжелой (SEQ ID NO 24, ниже и легкой (SEQ ID NO 25, выше) цепи вариабельного и константного сегмента 6A3-Ig4. Лидерный пептид легкой (SEQ ID NO 31) и тяжелая (SEQ ID NO 30) цепи показан курсивом.

Фиг.5

Верхний ряд: аминокислотная последовательность легкой цепи антител 6A3-IgG1 (SEQ ID NO 5), включающая последовательности лидерного пептида (SEQ ID NO 22) и CDR-L1 (SEQ ID NO 11), CDR-L2 (SEQ ID NO 12) и CDR-L3 (SEQ ID NO 13).

Нижний ряд: аминокислотная последовательность тяжелой цепи антител 6A3-IgG1 (SEQ ID NO 4), включающая последовательности лидерного пептида (SEQ ID NO 20) и CDR-H1 (SEQ ID NO 8), CDR-H2 (SEQ ID NO 9) и CDR-H2 (SEQ ID NO 10).

Фиг.6

ОТ-ПЦР с использованием в качестве матрицы РНК клеток MO3.13 и специфичных праймеров Nogo-A, в результате которой получают определенный фрагмент ДНК, включающий приблизительно 200 по.

Фиг.7

Детектирование иммуноблота иммунопреицпитированного белка Nogo-A из липидной фракции клеток М03:13 с использованием антител 6А3.

После иммунопреципитации (ИП) лизатов клеток MO3.13 и иммунодетектирования антителами 6А3, специфичными в отношении Nogo-A, проявляется одна интенсивная полоса в ожидаемой области ММ (190 кДа) при проявлении антителами 6A3-IgG4 (трек 4) и антителами 11C7-IgG1 (трек 6).

Фиг.8

Fig 8a: Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток М03.13.

Fig 8б: Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток HOG.

Иммунофлуоресцентное окрашивание проницаемых клеток MO3.13 и HOG при обработке 6A3-IgG4 и меченых красителем Alexa-Fluor 488 вторичных антител, специфичных к антителам человека, приводит к интенсивному окрашиванию клеток (Фиг.8a и 8b, слева), в то время как при обработке только вторичными антителами окрашивание фактически отсутствует (справа).

Фиг.9

Концентрации в сыворотке антител 6А3, измеренная у 6 субъектов через 2 месяца.

Фиг.10

Концентрации в СМЖ антител 6А3, измеренная у 6 субъектов через 2 месяца.

Фиг.11

Лечение антителами 6А3 повреждения спинного мозга на модели обезьян улучшает скорость и степень функционального восстановления независимо от размеров повреждения.

Подробное описание изобретения

При разработке новых и улучшенных способов усиления регенерации нейронов после травмы в центральной нервной системе (ЦНС) взрослых в настоящее время неожиданно было установлено, что новые моноклональные антитела человека (6А3), которые продуцируются в HuMab-мышах™ (генетически созданные мыши, в которых гены мышиных иммуноглобулинов заменены на гены иммуноглобулинов человека, фирма Medarex Inc.), обладают высокой эффективностью при модулировании активности Nogo-A в экспериментах in vitro и in vivo. Антитела 6А3, которые вырабатываются против NiG человека, являются изотипом IgG и обладают более предпочтительными свойствами по сравнению с антителами, специфичными в отношении Nogo-A, описанными в области техники. Таким образом, появляется возможность конструирования альтернативных молекул, связывающихся с Nogo-A, содержащих гипервариабельные области, аналогичные указанным антителам 6А3, т.е. создания новых антител, обладающих предпочтительными свойствами антител 6А3. Производные антитела 6A3-Ab, 6A3-IgG4 и 6А3-Fab распознают NiG человека с высокой аффинностью 0,14 нМ и 1,1 нМ, соответственно. Кроме того, антитела по настоящему изобретению обладают высокой стабильностью и продолжительным периодом полураспада и удерживанием in vitro и in vivo. Наконец, связывающие молекулы и антитела по изобретению характеризуются замедленным высвобождением из участка введения, что обеспечивает местное отложение связывающей молекулы в очаге повреждения. При непрерывном вливании в спинномозговой жидкости (СМЖ) поврежденного спинного мозга животных и пациентов наблюдаются высокие концентрации антител 6А3. Указанное неожиданно высокое удерживание антител 6A3-Ab и время пребывания в спинномозговой жидкости (СМЖ) позволяет использовать струйные инъекции (например, 1-3 раза в неделю, даже целесообразно с более продолжительными интервалами один раз в 2, 3 или 4 недели) вместо непрерывного вливания антител в спинномозговую жидкость. Можно также использовать повторные интратекальные струйные инъекции. В предпочтительном варианте введение проводят интратекально, например, с использованием соответствующего катетера, связанного с портативным насосом. В другом предпочтительном варианте используют интратекальную струйную инъекцию. Преимущества связывающих молекул по изобретению также описаны в разделе Примеры.

Соответственно, в изобретении предлагаются связывающие молекулы, специфичные в отношении Nogo-A или NiG (далее по тексту "связывающие молекулы по изобретению" или просто "связывающие молекулы"). Предпочтительно связывающие молекулы по изобретению связываются с белком Nogo-A человека (SEQ ID NO: 2, кодируемая последовательностью SEQ ID NO: 1) или с белком NiG человека (который является фрагментом Nogo-A (аминокислоты 186-1004 Nogo-A человека, SEQ ID NO: 3), наиболее эффективно подавляющим разрастание невритов, при этом константа диссоциации K_D составляет <1000 нМ, или K_D составляет до и включительно 100 нМ, более предпочтительно <100 нМ, или K_D составляет до и включительно 100 нМ, наиболее предпочтительно <10 нМ, или K_D составляет до и включительно 10 нМ. Реакцию связывания детектируют стандартными методами (включающими качественные и количественные методы анализа), включающими, например, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и определение аффинности на биосенсоре (см. пример 4). Кроме того, связывание связывающих молекул по изобретению с Nogo-A человека и NiG человека и эффективность указанных связывающих молекул при функциональном анализе можно оценивать при анализе разрастания невритов, например, как описано ниже.

Таким образом, в другом предпочтительном варианте связывающая молекула по настоящему изобретению (в концентрации 100 мкг/мл, предпочтительно 10 мкг/мл, более предпочтительно 1,0 мкг/мл и наиболее предпочтительно 0,1 мкг/мл) повышают число невритов мозжечковых тучных клеток крысы на субстрате в виде белкового экстракта мозга обезьяны по меньшей мере на 20%, предпочтительно на 50%, наиболее предпочтительно на 80%, по сравнению с числом невритов мозжечковых тучных клеток крысы, обработанных контрольными антителами, которые не связываются с полипептидом Nogo-A человека или с полипептидом NiG человека (т.е. которые характеризуются константой диссоциации >1000 нМ).

В другом варианте изобретение относится к изолированной молекуле, включающей по меньшей мере один антиген-связывающий участок, который специфично связывается с полипептидом Nogo-A человека (SEQ ID NO: 2) или с полипептидом NiG человека (SEQ ID NO: 3), причем указанный антиген-связывающий участок включает:

- по меньшей мере одну из гипервариабельных областей CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), соответственно, и

- по меньшей мере одну из гипервариабельных областей CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-L1-6А3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) and CDR-L3-6А3 (SEQ ID NO: 13), соответственно.

Специфичное распознавание Nogo-А или NiG человека обеспечивается благодаря присутствию в составе связывающей молекулы по настоящему изобретению CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. Тем не менее для специалиста представляется очевидным, что присутствие в составе связывающей молекулы только одного CDR-домена может оказаться достаточным для специфичного связывания с распознаваемой молекулой. Положение "по меньшей мере одна из гипервариабельных областей" обозначает 1 или 2 или 3 гипервариабельные области. Положение "идентичность по меньшей мере на 90%" обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%. Идентичность (в %) двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием компьютерной программы, которая анализирует относительную идентичность двух или более аминокислотных последовательностей, например, программы Basic Local Aliggnment Search Tool (BLAST, см. web site Национального института здоровья, Altschul и др., Nature Genetics, 6, 119-129 (1994), Altschul и др., J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990), Altschul и др., Nucleic Acids Research, 25, 1389-1402 (1997), Karlin и Altschul, PNAS, 87, 2264-2268 (1990), Karlin и Altschul, PNAS, 90, 5873-5868 (1993)).

Настоящее изобретение относится к изолированной молекуле, включающей по меньшей мере один антиген-связывающий участок, который специфично связывается с полипептидом Nogo-A человека (SEQ ID NO: 2) или с полипептидом NiG человека (SEQ ID NO: 3) с константой диссоциации <1000 нМ, причем указанный антиген-связывающий участок включает:

- по меньшей мере гипервариабельные области CDR-H1, CDR-H2, и CDR-H3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) and CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), соответственно, и

- по меньшей мере гипервариабельные области CDR-L1, CDR-L2, и CDR-L3, где каждая из гипервариабельных областей по меньшей мере на 90% идентична гипервариабельным областям CDR-L1-6А3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6А3 (SEQ ID NO: 13), соответственно.

Положение "антиген-связывающий участок, включающий гипервариабельные области" относится к антиген-связывающему участку, в котором гипервариабельные области не являются смежными (не располагаются близко друг к другу). Предпочтительно указанные области в составе антител чередуются с каркасными участками антител, или с последовательностями, которые не являются каркасными участками антител, предпочтительно с каркасными участками антител.

Согласно настоящему изобретению связывающая молекула может также включать по меньшей мере один антиген-связывающий участок, причем указанный антиген-связывающий участок включает:

- гипервариабельные области CDR-H1-6А3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6А3 (SEQ ID NO: 10), или

- гипервариабельные области CDR-L1-6А3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6А3 (SEQ ID NO: 13), или

- их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Положение "идентичность по меньшей мере на 90%" обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

Согласно настоящему изобретению связывающая молекула также включает:

- первый антиген-связывающий участок, содержащий гипервариабельные области CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10), и

- второй антиген-связывающий участок, содержащий гипервариабельные области CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6А3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13), или

- их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Идентичность по меньшей мере на 90% обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

Согласно настоящему изобретению связывающая молекула также включает:

- по меньшей мере одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, которая включает (1) вариабельный домен, включающий гипервариабельные области CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6А3 (SEQ ID NO: 9) и CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: 10) и (2) константный сегмент или его фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и

- по меньшей мере одну легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, который включает (1) вариабельный домен, включающий гипервариабельные области CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) и CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13) и (2) константный сегмент или его фрагмент легкой цепи иммуноглобулина человека, или

- их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Идентичность по меньшей мере на 90% обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

В связывающей молекуле по настоящему изобретению константный сегмент (или его фрагмент) тяжелой цепи иммуноглобулина человека может соответствовать типу (γ), предпочтительно типу (γ4), а константный сегмент (или его фрагмент) легкой цепи иммуноглобулина человека может соответствовать типу (λ) или предпочтительно типу (κ). Кроме того, связывающая молекула согласно настоящему изобретению может представлять собой моноклональные антитела человека, частично моноклональные антитела человека или химерные или гуманизированные моноклональные антитела.

Согласно настоящему изобретению связывающая молекула может включать одну или более полипептидных последовательностей, таких как SEQ ID NO: 4 (тяжелая цепь IgG1), SEQ ID NO: 5 (легкая цепь IgG1), SEQ ID NO: 24 (тяжелая цепь IgG4) и SEQ ID NO: 25 (легкая цепь IgG4).

В другом предпочтительном варианте связывающая молекула по настоящему изобретению включает по меньшей мере один антиген-связывающий участок, причем указанный антиген-связывающий участок включает гипервариабельные области CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 и CDR-H3-6А3, где CDR-H1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, CDR-H2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, a CDR-H3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, и их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Идентичность по меньшей мере на 90% обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

В другом варианте изобретения связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере:

а) первый домен, включающий гипервариабельные области CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 и CDR-H3-6A3, где CDR-H1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, CDR-H2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, а CDR-H3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, и

б) второй домен, включающий гипервариабельные области CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 и CDR-L3-6A3, где CDR-L1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, CDR-L2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, а CDR-L3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, или

в) их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей. Идентичность по меньшей мере на 90% обозначает идентичность на более 90%, предпочтительно на более 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

Кроме того в изобретении также предлагается следующее связывающая молекула по изобретению, которая включает по меньшей мере один антиген-связывающий участок, содержащий:

а) вариабельную область тяжелой цепи антител 6А3 (SEQ ID NO: 4), или

б) вариабельную область легкой цепи антител 6А3 (SEQ ID NO: 5), или их прямые эквиваленты, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности указанных гипервариабельных областей.

Если антиген-связывающий участок включает первый и второй домены, то такие домены могут содержаться в составе одного полипептида или предпочтительно каждый домен может содержаться в отдельной цепи, т.е. первый домен является частью тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента, а второй домен является частью легкой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента.

Примеры связывающих молекул по изобретению включают антитела, такие как антитела, продуцируемые В-клетками или гибридомами, и антитела человека или химерные или гуманизированные антитела или их любые фрагменты, например, F(ab')2, и Fab фрагменты, а также одноцепные или монодоменные антитела, описанные в US 20070065440 A1.

"Монодоменные антитела" представляют собой вариабельный домен, который специфично связывается с эпитопом или антигеном или лигандом независимо от другого вариабельного домена, который связывается с указанным эпитопом, антигеном или лигандом. Монодоменные антитела могут присутствовать в виде гомо- или гетеромультимера вместе с другими VH или VL доменами, причем другие домены не являются необходимыми для связывания антигена с монодоменными антителами, т.е., монодоменные антитела связываются с антигеном независимо от дополнительных VH или VL доменов. В предпочтительном варианте монодоменные антитела включают отдельный VH домен или отдельный VL домен. Способы получения монодоменных антител, обладающих по меньшей мере некоторой специфичностью связывания, характерной для исходных интактных антител, известны в данной области техники. Например, в статье Ward и др. ("Binding Activities of a Repertoire of Single immunoglobulin Variable Domens Secreted from Escherichia coli", Nature, 341, 644-646) описан способ тестирования с целью получения вариабельной области тяжелой цепи антител (VH домена), обладающей достаточно высокой аффинностью в отношении эпитопа-мишени при связывании с эпитопом в изолированной форме.

Одноцепочечные антитела состоят из вариабельных доменов/областей тяжелой и легкой цепей антител, ковалентно связанных пептидным линкером, обычно содержащим от 10 до 30 аминокислот, предпочтительно от 15 до 25 аминокислот. Предпочтительные способы включают применение полипептидных линкеров, описанных, например, в связи с оцFv (Bird и др., Science, 242, 423-426 (1988)). Следовательно, такая структура не включает константный сегмент тяжелой и легкой цепей, и предполагается, что небольшой пептидный спейсер должен быть менее антигенным, чем полный константный сегмент. Термин "химерные антитела" обозначает антитела, в которых константные области тяжелой или легкой цепей антител или оба фрагмента получены из одного вида животного, а вариабельные области тяжелой и легкой цепей получены из другого вида животного. Предпочтительно "химерные антитела" представляют собой такие антитела, в которых константные области тяжелой и легкой цепей или оба фрагмента соответствуют иммуноглобулину человека, а вариабельные домены тяжелой и легкой цепей получены от другого вида (например, мыши, обезьяны, крысы, свиньи, цыпленка, птиц). Термин "гуманизированные антитела" обозначает антитела, в которых гипервариабельные области (CDR) получены от животных (например, мыши), а все или практически все остальные фрагменты молекулы иммуноглобулина, например, константные области и высококонсервативные участки вариабельных доменов, т.е. каркасные участки, соответствуют иммуноглобулину человека. Однако гуманизированные антитела могут содержать в сегментах каркасных участков, смежных гипервариабельными областями, несколько аминокислотных остатков из иммуноглобулина мыши.

Гипервариабельные области можно гибридизовать с каркасными участками иммуноглобулина любого вида, предпочтительно мыши или человека. Пригодные каркасные участки описаны в публикации "Sequences of Proteins of immunological interest", Kabat E.A. и др., US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health. Предпочтительно константный сегмент тяжелой цепи (иммуноглобулина человека) связывающей молекулы может представлять собой тип IgG, более предпочтительно тип IgG4, включая подтипы, предпочтительно константный сегмент легкой цепи (иммуноглобулина человека) обозначает тип (λ) или (κ), более предпочтительно тип (κ).

Моноклональные антитела, специфичные в отношении природного белка, присутствующего в организме человека, можно получать в системе любого животного, например, мыши. В результате ксеногенные антитела, полученные с использованием гибридом, при введении человеку вызывают нежелательный иммунный ответ, который преимущественно опосредуется константным сегментом ксеногенного иммуноглобулина. Это обстоятельство несомненно ограничивает применение таких антител, поскольку их нельзя вводить в течение продолжительного времени. Следовательно, прежде всего предпочтительно использовать одноцепочечные, монодоменные, химерные или гуманизированные антитела, которые вероятно не вызывают существенного аллогенного ответа при введении человеку.

В связи с вышеизложенным, связывающую молекулу по изобретению также выбирают из химерных антител, которые включают по меньшей мере:

а) одну тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, которая включает (1) вариабельный домен, содержащий гипервариабельные области CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 и CDR-H3-6A3 и (2) константный сегмент или его фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина человека, где CDR-H1-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 9), а CDR-H3-6A3 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 10), и

б) одну л