Средство (варианты), композиция (варианты) и применение средства (варианты) для снижения неприятного запаха изо рта

Средство (варианты), композиция (варианты) и применение средства (варианты) для снижения неприятного запаха изо рта

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к микроорганизму, принадлежащему к группе молочнокислых бактерий, который способен существенно снижать концентрацию пептидов в слюне, тем самым исчерпывая субстрат, используемый анаэробными микроорганизмами микрофлоры ротовой полости, которые являются агентами, вызывающими неприятный запах изо рта. Более того, описанный микроорганизм принадлежит к группе молочнокислых бактерий, которая способна стимулировать рост Streptococcus salivarius, но не стимулирует рост Streptococcus mutans и/или Porphyromonas gingivalis.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим вышеупомянутые микроорганизмы, их применению для предотвращения и/или лечения неприятного запаха изо рта и/или халитоза, и способам предотвращения и/или лечения неприятного запаха изо рта и/или халитоза.

Обычной проблемой в области гигиены рта является хроническое плохое дыхание (дурной запах). Широко распространенный способ лечения халитоза заключается в маскировке или нейтрализации плохого запаха с помощью использования ополаскивателей для рта или жевательных резинок, которые содержат, например, ментол. Однако эти способы эффективны только на короткий период и не эффективны на длительный срок. Следовательно, существует необходимость в способах предотвращения или лечения халитоза, помогающих на длительный период. Эта проблема решалась в уровне техники различными способами, все из которых в большей или меньшей степени стремятся к уменьшению количества анаэробных бактерий, которые продуцируют «летучие соединения серы» (ЛСС), такие как сероводород и метил меркаптан, например.

Один описанный способ снижения указанных бактерий заключается в удалении налета с языка с помощью скребка, для того чтобы устранить с языка субстраты для размножения бактерий. Другой способ заключается в лечении языка солью металла, таким как хлорид цинка, или дезинфицирующим средством, таким как спирт или хлоргексидин. Однако недостаток этих способов в том, что соль металла и дезинфицирующее средство также ингибируют рост других безвредных или даже благотворных микроорганизмов полости рта.

Один подход к лечению и предотвращению халитоза, который был описан, заключается в поддержании рН слюны на физиологически нормальном уровне. Известно, что разновидности микробов, ассоциированные с кариесом и инфекциями слизистой оболочки, благоприятствуют развитию кислой среды; разновидности микробов, ассоциированные с развитием периодонтальной болезни, благоприятствуют развитию рН выше нормальной, в то время как разновидности микробов, ассоциированные с хорошим здоровьем полости рта, благоприятствуют развитию нейтральной рН. Композиции, содержащие пробиотические бактерии (например, Lactobacillus и Streptococcus), которые используют этот механизм, раскрыты в заявках на патент США US 200707137 и US 2006018843. Международная заявка на патент W0 2007/077210 раскрывает метод восстановления оральной микрофлоры, ассоциированной с хорошим здоровьем полости рта, который использует пробиотики, слабо продуцирующие или не продуцирующие кислоту, выбранные из группы быстро колонизирующих бактерий полости рта, которые в норме присутствуют в здоровой микрофлоре полости рта (например, Streptococcus (oralis), Eubacterium, Neisseria, Veilonea) в совокупности с веществами, имеющими рН-поднимающие или рН-буферные вещества (например, бикарбонаты, карбамиды, фосфаты, белки и/или соли). Заявка на патент США US 2006045870 раскрывает живые кисломолочные бактерии, принадлежащие к роду Weisella, которые ингибируют рост ЛСС-продуцирующих бактерий путем взаимодействия с ними и вырабатывания перекиси водорода в аэробных и анаэробных условиях. Заявка на патент США US 2006171901 раскрывает другой способ подавления роста аэробных бактерий, особенно бактерий, вызывающих халитоз, который включает БПИВ (бактериоцин-подобные ингибирующие вещества) - продуцирующие штаммы Streptococcus salivarius и их экстракты.

Недостаток способов, доступных для предотвращения и лечения халитоза, заключается в том, что большинство из этих способов ингибируют не только рост ЛСС-продуцирующих бактерий, которые считаются главной причиной неприятного запаха изо рта, но они также ингибируют рост других безвредных микроорганизмов полости рта.

Поэтому задача настоящего изобретения заключается в обеспечении альтернативных средств и способов профилактики и/или лечения неприятного запаха изо рта и/или халитоза.

Соответственно, первый объект настоящего изобретения относится к микроорганизму, принадлежащему к группе кисломолочных бактерий, характеризуемому тем, что проявляет следующее свойство (б), когда подвергается следующему анализу (а):

Анализ (а):

(а) микроорганизм культивируют в течение 24 часов при 37°С в анаэробных условиях в искусственной среде, содержащей 15 г/л пептидов с исходной плотностью клеток 1·10⁷ клеток/мл;

(б) клетки удаляют центрифугированием при 4000·g в течение 15 мин; и

(в) определяют концентрацию пептидов в получаемом супернатанте.

Свойство (б):

Микроорганизм приводит к снижению концентрации пептидов в культуральной среде настолько, что концентрация пептидов в супернатанте после инкубации в течение 24 часов снижается, по меньшей мере, на 20% по сравнению с исходной концентрацией 15 г/л, т.е. микроорганизм способен снижать концентрацию пептидов в среде в анализе (а), по меньшей мере, на 20%.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм согласно изобретению дополнительно проявляет следующее свойство (Б), когда подвергается следующему анализу (А):

(а) микроорганизм культивируют в 100 мл искусственной среды при 37°С в течение 24 часов в анаэробных условиях с исходной плотностью клеток 1·10⁷ клеток/мл;

(б) затем клетки центрифугируют при 4000·g в течение 15 мин и ресуспендируют в 20 мл Н₂O;

(в) 10 мг лиофилизированных бактерий ресуспендируют в Н₂O и центрифугируют при 4000·g в течение 10 мин;

(г) 1 мл искусственной среды, содержащей 7 г/л пептидов, добавляют к осадку, клетки ресуспендируют в среде и после 5 мин аэробной инкубации при 37°С клетки удаляют центрифугированием при 4000·g в течение 15 мин; и

(д) определяют концентрацию пептидов в получаемом супернатанте среды.

Свойство (Б): лиофилизированные бактерии приводят к снижению концентрации пептидов в получаемом супернатанте среды, по меньшей мере, на 20% по сравнению с концентрацией среды на момент начала инкубационного периода (7 г/л).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация пептидов в анализе (а) или (А) снижается с помощью микроорганизма согласно изобретению, по меньшей мере, на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 40% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 50%.

В особо предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм согласно изобретению способен снижать концентрацию пептидов в анализе (А), по меньшей мере, на 60% и еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 70%.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает микроорганизм, который может эффективно снижать концентрацию пептидов в окружающей его среде, в частности также в слюне, так как это описано в прилагаемых примерах. Как известно, неприятный запах изо рта вызван явлением, при котором отношение между здоровой флорой полости рта (сформированной, в основном, Streptococcus salivarius) и патогенной флорой полости рта (сформированной, в основном, анаэробными грамотрицательными бактериями) сдвинуто в сторону анаэробных грамотрицательных бактерий, которые разлагают белки, присутствующие в слюне, до летучих соединений. Это приводит к образованию летучих соединений серы, которые вызывают неприятный запах изо рта.

Микроорганизм настоящего изобретения способен уменьшать неприятный запах изо рта за счет снижения количества пептидов и, вследствие этого, истощения субстрата анаэробных грамотрицательных бактерий флоры ротовой полости.

Термин «искусственная среда» относится к химически заданной среде, то есть к среде, химический состав которой известен. Искусственная среда может быть любой искусственной средой, подходящей для культивирования данного микроорганизма. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения искусственная среда является такой искусственной средой, как раскрыта в патенте США US 6,340,585.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения искусственная среда является средой со следующим составом:

Гуанин:	0,1 г/л
Цитозин:	0,1 г/л
Тимидин:	0,1 г/л
2'-Деоксиаденозин:	0,1 г/л
2'-Деоксиуридин:	0,1 г/л
К2НРO4:	2 г/л
Натрия ацетат:	5 г/л
МgSO4-гептагидрат:	0,1 г/л
Диаммония гидроцитрат:	2 г/л
СаСl2-дигидрат:	0,5 г/л
Олеиновая кислота:	0,1% (масса / объем)
Цианокобаламин:	0,02 мг/л
Рибофлавин:	10 мг/л
Фолиевая кислота:	0,2 мг/л
Пиридоксал-5-фосфат-моногидрат:	10 мг/л
4-Аминобензойная кислота:	0,2 мг/л
D (+)-Биотин:	1 мг/л
Аскорбиновая кислота:	500 мг/л
Никотиновая кислота:	10 мг/л
Са-пантотенат:	10 мг/л
Тиамин:	1 мг/л
Кобальт(II)-Нитрат-Гексагидрат:	500 мг/л
МnSO4-моногидрат:	20 мг/л
МnSO4-гептагидрат:	500 мг/л
Na2МоO4:	0,04 мг/л
Экстракт PTU (Ohiy, Deutsche	15 г/л (или как указано в данном
Hefewerke, Germany):	случае)
D-Глюкозы моногидрат:	10 г/л

Термин «содержащий 15 г/л пептидов» (или «содержащий 7 г/л пептидов») означает, что искусственная среда на момент начала инкубационного периода содержит 15 г/л пептидов (или 7 г/л пептидов соответственно). В принципе, пептиды могут быть любыми пептидами. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пептиды, содержащиеся в искусственной среде, находятся в форме дрожжевого экстракта, предпочтительно экстракта PTU. Экстракт PTU (пептидный ультрафильтрованный экстракт) можно приобрести в Ohly, Deutsche Hefewerke, Germany. Это ультрафильтрованный низкосолевой дрожжевой экстракт с высоким содержанием легкодоступных пептидов и предпочтительно он обладает следующими характеристиками:

Усредненный анализ:

Сухой материал:	96%
Белок (N×6,25) в сухом материале:	72,9%
Полный азот в сухом материале:	11,7%
NaCl:	≤ 1,0%
Зола:	10%
рН (в 2% растворе):	5,7

Витамины (типичные):

Тиамингидрохлорид×HCl (B1):	1,2 мг/100 г
Рибофлавин (В2):	7,0 мг/100 г
Пиридоксин×HCl (B6):	5,9 мг/100 г
Никотиновая кислота:	47,8 мг/100 г
Биотин:	0,022 мг/100 г
Ca-D-Пантотенат:	17,9 мг/100 г
Фолевая кислота:	3,7 мг/100 г
Аминокислотный профиль (типичный):	как показано на Фигуре 7

Термин «исходная плотность клеток в клетках/мл» означает, что искусственная среда инокулируется в начале периода культивирования микроорганизмом, так чтобы в среде находилось 1·10⁷ клеток/мл.

Концентрацию пептидов можно определить любым известным специалисту в данной области способом. Хорошо изученными способами являются, например, биуретовый способ, способ Лоури, способ Бредфорда. Более того, можно использовать любой имеющийся в продаже набор или другую систему для определения концентрации пептидов. Одним предпочтительным примером являются системы или наборы, основанные на флуоресцентных красителях, такие как набор Quant-it Protein фирмы Invitrogen.

Снижение концентрации пептидов в вышеупомянутых анализах (а) и/или (А) предпочтительно исследуется так, как описано в прилагаемых Примерах.

Как показано в прилагаемых Примерах, неожиданно было обнаружено, что молочнокислые бактерии могут проявлять способность существенно снижать в окружающей их среде концентрацию пептидов. Это эффект проявляется не только с живыми бактериями, но также с их лиофилизованными формами. Более того, в Примерах показано, что микроорганизмы согласно изобретению проявляют вышеупомянутый эффект не только в описанных выше анализах, но также в слюне, и что присутствие микроорганизма согласно изобретению приводит к значительному снижению продуцирования H₂S при добавлении в слюну.

В частности, в предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм согласно изобретению также проявляет следующее свойство (г), когда подвергается следующему анализу (в):

Анализ (в):

(а) микроорганизм культивируют в 100 мл искусственной среды при 37°С в течение 24 часов в анаэробных условиях с исходной плотностью клеток 1·10⁷ клеток/мл;

(б) затем клетки центрифугируют при 4000·g в течение 15 мин и ресуспендируют в 20 мл Н₂О;

(в) затем клетки замораживают до -80°С и лиофилизируют в вакууме в течение 16 часов;

(г) 10 мг лиофилизированных бактерий ресуспендируют в H₂O в глубоколуночном планшете и центрифугируют при 4000·g в течение 10 мин;

(д) 1 мл искусственной среды, содержащей 3 г/л пептидов, добавляют к осадку, образовавшемуся после центрифугирования, и после 5 мин инкубации при 37°С клетки удаляют центрифугированием при 4000·g в течение 15 мин;

(е) супернатант затем переносят в новый глубоколуночный планшет и далее инокулируют от 10 до 100 мкл, предпочтительно 50 мкл, нестерильной человеческой слюны и инкубируют в анаэробных условиях в течение 6 часов при 37°С, в то время как глубоколуночный планшет накрывают стерильной фильтровальной бумагой, пропитанной ацетатом свинца;

(ж) продуцирование микроорганизмами сероводорода в реакции контролируют отслеживанием почернения фильтровальной бумаги.

Свойство (г): в присутствии микроорганизма согласно изобретению почернение фильтровальной бумаги, пропитанной ацетатом свинца, снижается по сравнению с контролем, в котором среда не была предварительно инкубирована с указанным микроорганизмом. Сниженное почернение фильтровальной бумаги является показателем сниженного продуцирования H₂S бактериями, содержащимися в нестерильной человеческой слюне, используемой для инокуляции среды.

Термин «сниженное продуцирование H₂S» означает снижение продуцирования H₂S, по меньшей мере, на 10%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 30% и особенно предпочтительно, по меньшей мере, на 40% или даже, по меньшей мере, на 50% по сравнению с контролем. Снижение можно измерить, например, с помощью денситометрического анализа почернения фильтровальной бумаги. В альтернативном варианте, продуцирование сульфида водорода в шагах (е) и (ж) не определяют с использованием фильтровальной бумаги, а измеряют с помощью парофазного анализа, используя газовую хроматографию.

Второй объект настоящего изобретения также относится к микроорганизму, принадлежащему к группе молочнокислых бактерий, характеризуемому тем, что способен стимулировать рост Streptococcus salivarius, но не стимулировать рост Streptococcus mutans и/или Porphyromonas gingivalis.

Термин «стимулировать» в отношении роста микроорганизмов вида Streptococcus salivarius означает, что рост этих микроорганизмов увеличивается при контакте с микроорганизмом согласно изобретению. Увеличенный рост предпочтительно означает рост пролиферации, т.е. клеточных делений в единицу времени. В качестве альтернативы, термин «стимулировать» также относится к росту отдельных клеток в размерах. Размер бактериальной клетки может быть оценен с помощью проточной цитометрии (например, проточный цитометр Becton-Dickinson FACSort, San Jose, CA) после окрашивания с красителем SYBR Green I (Molecular Probes, USA). Размер бактериальной клетки оценивают в режиме Side-Angle Light Scatter (SSC). Увеличенный рост, таким образом, означает рост продуцирования биомассы в единицу времени.

Стимулирование роста соответствующего микроорганизма предпочтительно можно наблюдать in vitro, более предпочтительно в анализе, в котором микроорганизм согласно изобретению контактирует со Streptococcus salivarius и определяется рост Streptococcus salivarius. Рост можно определить с помощью подсчета количества клеток/колоний после различных интервалов времени инкубации и сравнить с контролем, который не содержит микроорганизм согласно изобретению, тем самым позволяя узнать, есть ли увеличение роста.

Анализ in vitro для определения стимулирования роста описывается в Примерах и содержит так называемый «Фотометрический соинкубационный анализ». Вкратце такой анализ содержит следующие шаги:

(а) микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, который будет тестироваться, смешивают со Streptococcus salivarius в соотношении клеток 1:100 (молочнокислые бактерии: Streptococcus salivarius) в ¹/₂ триптиказосоевой среды с дрожжевым экстрактом (TSY среда, trypticase soy yeast extract);

(б) культуральную суспензию инкубируют в аэробных условиях в течение 12 часов при 37°С;

(в) в качестве контроля используют неизрасходованную ¹/₂ среды TSY или облегченную среду MRS;

(г) определяют максимальную оптическую плотность (OD₆₀₀, _max) и/или определяют максимальную скорость роста (V_max) во время экспоненциального роста; и

(д) микроорганизм классифицируют как микроорганизм, способный стимулировать рост Streptococcus salivarius, если максимальная оптическая плотность (OD_{600, max}) и/или максимальная скорость роста (V_max) увеличивается, по меньшей мере, на 10% по сравнению с контролем.

Термин «¹/₂ среды TSY» относится к TSY среде, которая разбавлена Н₂O в соотношении 1:1 (об.: об.).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения инкубация осуществляется в 96-луночном планшете. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения инкубация осуществляется в микропланшетном спектрофотометре Bio Tek PowerWave (Biotek Instruments Gmbh, Germany).

Предпочтительно OD_{600, max} и V_max определяют следующим образом.

Оптическую плотность OD при 600 нм измеряют в течение расширенного периода времени, предпочтительно около от 8 до 12 часов, после начала инкубации через равномерные интервалы, например каждые 2,5 минуты. Для определения OD_{600, max} предпочтительно проводят инкубацию в течение 10 часов.

Для определения значения OD_{600, max} вычисляют среднее значение из трех наибольших измеренных значений.

Значение V_max предпочтительно определяют, выбирая 15 последовательных значений, которые показывают самый крутой градиент. Единицей, показывающей V_max, является мОП/мин (единиц миллиоптической плотности в минуту). Определение OD_{600, max} для вычисления V_max предпочтительно проводят в течение периода времени, которое позволяет охватить фазу экспоненциального роста культурируемого микроорганизма.

Предпочтительно микроорганизм согласно изобретению приводит к росту максимальной оптической плотности (OD_{600, max}) или максимальной скорости роста (V_max) Streptococcus salivarius в описанном выше анализе, по меньшей мере, на 15%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 30% и особенно предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, 50%, 60%, 70% и даже 80% по сравнению с контролем.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения описанный выше микроорганизм согласно изобретению не только стимулирует рост Streptococcus salivarius, но также стимулирует рост по меньшей мере одного другого микроорганизма здоровой микрофлоры полости рта. Примерами таких микроорганизмов являются Streptococcus oralis и Streptococcus epidermidis. Стимулирование этих бактерий можно измерить с помощью описанного выше анализа.

Описанный выше микроорганизм согласно изобретению также характеризуется тем, что не стимулирует рост Streptococcus mutans и/или Porphyromonas gingivalis. Микроорганизм считается не стимулирующим рост микроорганизма транзиторной патогенной микрофлоры, если он не приводит к увеличенному росту Streptococcus mutans и/или Porphyromonas gingivalis при контакте с ними. Стимулирование роста или его отсутствие можно исследовать in vitro. Анализ in vitro для определения стимулирования роста или его отсутствия описывается в Примерах и содержит так называемый «Фотометрический соинкубационный анализ». Вкратце, такой анализ в случае Streptococcus mutans содержит следующие шаги:

(а) микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, который будет тестироваться, культивируют в анаэробных условиях в 96-луночном планшете со 150 мкл искусственной среды в течение 24 часов при 37°С, клетки осаждают центрифугированием при 4000·g в течение 15 мин и восстанавливают супернатант;

(б) Streptococcus mutans культивируют в анаэробных условиях в 5 мл TSY среды в закрытых 15-миллилитровых пробирках Falcon в течение ночи при 37°С;

(в) культуру клеток Streptococcus mutans смешивают в объемном соотношении 2:1 с супернатантом с шага (а);

(г) культуральную суспензию инкубируют в аэробных условиях в течение 12 часов при 37°С;

(д) в качестве контроля используют неизрасходованную ¹/₂ среды TSY или облегченную среду MRS;

(е) определяют максимальную оптическую плотность (OD_{600, max}) и/или определяют максимальную скорость роста (V_max) во время экспоненциального роста; и

(ж) микроорганизм классифицируют как микроорганизм, неспособный стимулировать рост Streptococcus mutans, если максимальная оптическая плотность (OD_{600, max}) и/или максимальная скорость роста (V_max) не увеличивается по сравнению с контролем.

В альтернативном варианте, такой анализ может содержать следующие шаги:

(A) тестируемый микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, смешивают со Streptococcus salivarius в соотношении клеток 1:100 (lactobacillus: S. mutans) в ¹/₂ среды TSY;

(Б) культуральную суспензию инкубируют в аэробных условиях в течение 12 часов при 37°С;

(B) в качестве контроля используют неизрасходованную ¹/₂ среды TSY или облегченную среду MRS;

(Г) определяют максимальную оптическую плотность (OD_{600, max}) и/или определяют максимальную скорость роста (V_max) во время экспоненциального роста; и

(Д) микроорганизм классифицируют как микроорганизм, неспособный стимулировать рост Streptococcus mutans, если максимальная оптическая плотность (OD_{600, max}) и/или максимальная скорость роста (V_max) не увеличивается по сравнению с контролем.

В случае Porphyromonas gingivalis анализ содержит следующие шаги:

(з) тестируемый микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, культурируется в анаэробных условиях в 96-луночном планшете со 150 мкл искусственной среды в течение 24 часов при 37°С, клетки осаждают центрифугированием при 4000·g в течение 15 мин и восстанавливают супернатант;

(и) Porphyromonas gingivalis культивируют в анаэробных условиях в 5 мл среды FAB в закрытых 15-миллилитровых пробирках Falcon в течение ночи при 37°С;

(к) культуру клеток Porphyromonas gingivalis смешивают в объемном соотношении 2:1 с супернатантом с шага (з);

(л) культуральную суспензию инкубируют в аэробных условиях в течение 45 часов при 37°С;

(м) в качестве контроля используют неизрасходованную среду FAB;

(н) определяют оптическую плотность (OD₆₀₀) после 10, 15, 21, 39 и 45 часов инкубации; и

(о) микроорганизм классифицируют как микроорганизм, неспособный стимулировать рост Porphyromonas gingivalis, если оптическая плотность (OD₆₀₀) в каждый момент измерения не увеличивается по сравнению с контролем.

В альтернативном варианте, такой анализ содержит следующие шаги:

(З) тестируемый микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, смешивают с Porphyromonas gingivalis в соотношении клеток 1:100 (lactobacillus: P. gingivalis) в среде FAB;

(И) культуральную суспензию инкубируют в аэробных условиях в течение 45 часов при 37°С;

(К) в качестве контроля используют неизрасходованную среду FAB;

(Л) определяют максимальную оптическую плотность (OD_{600, max}) и/или определяют максимальную скорость роста (V_max) во время экспоненциального роста; и

(М) микроорганизм классифицируют как микроорганизм, неспособный стимулировать рост Porphyromonas gingivalis, если максимальная оптическая плотность (OD_{600, max}) и/или максимальная скорость роста (V_max) не увеличивается по сравнению с контролем.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения инкубацию в шагах (г) и (Б) осуществляют в 96-луночном планшете. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения инкубацию осуществляют в микропланшетном спектрофотометре Bio Tek PowerWave (Fa Biotek Instruments GmbH, Germany).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения инкубацию в шагах (л) и (И) осуществляют в 96-луночном планшете. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения инкубацию осуществляют в анаэробной рабочей станции Whitley DG250 (Meintrup-DWS, Germany).

По отношению к OD_{600, max} и V_max применяется то же самое, что было сформулировано здесь выше.

Микроорганизм считается не стимулирующим рост микроорганизма Streptococcus mutans или Porphyromonas gingivalis, если рост не увеличивается или только слегка увеличивается при контакте с микроорганизмом. «Слегка увеличивается» означает, что рост увеличивается не более чем на 5% по сравнению с контролем, более предпочтительно не более чем на 2% по сравнению с контролем. Термин «не увеличивается» означает, что не может быть обнаружено никакого статистически значимого различия между ростом Streptococcus mutans или Porphyromonas gingivalis при контакте с микроорганизмом изобретения по сравнению с контролем, где отсутствует микроорганизм изобретения. Термин «не увеличивается» в предпочтительном варианте осуществления изобретения также включает те случаи, когда микроорганизм фактически приводит к снижению роста Streptococcus mutans или Porphyromonas gingivalis, т.е. когда он подавляет рост такого микроорганизма.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм настоящего изобретения не влияет негативно на рост Streptococcus mutans или Porphyromonas gingivalis. Термин «не влияет негативно» означает, что не может быть обнаружено никакого ингибирования роста Streptococcus mutans или Porphyromonas gingivalis при контакте с микроорганизмом изобретения по сравнению с контролем, где отсутствует микроорганизм изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизм согласно изобретению не стимулирует не только рост Streptococcus mutans и/или Porphyromonas gingivalis, но также не стимулирует рост по меньшей мере одного другого патогенного микроорганизма микрофлоры полости рта. Представителями патогенных бактерий полости рта являются анаэробные, грамотрицательные бактерии. Другими примерами являются Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium nucleatum polymorphum, Prevotella intermedia, Solobacterium moorei, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis, Tannerella forsynthensis и Treponema denticola.

Стимуляция или отсутствие стимуляции роста этих бактерий может быть измерено с помощью анализов, описанных выше для S. Mutans и Р. gingivalis.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения описанные выше микроорганизмы согласно изобретению характеризуются тем, что они не только проявляют эффект стимуляции роста Streptococcus salivarius в виде живых клеток, но также в виде культурального супернатанта. Это означает, что также культуральный супернатант, полученный из микроорганизма согласно изобретению, проявляет эффект стимуляции роста Streptococcus salivarius. Предпочтительно этот эффект проявляется в следующем анализе:

(а) Streptococcus salivarius культивируют в анаэробных условиях в 6-луночных планшетах с 8 мл TSY среды в течение ночи при 37°С;

(б) тестируемый микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, культивируют в анаэробных условиях в 96-луночных планшетах со 150 мкл искусственной среды в течение 24 часов при 37°С, клетки осаждают центрифугированием при 4000·g в течение 15 мин и супернатант восстанавливают;

(в) культуру клеток Streptococcus salivarius с шага (а) смешивают в объемном соотношении от 2:1 до 4:1 с супернатантом с шага (б) в ¹/₂ среды TSY;

(г) культуральную суспензию инкубируют в аэробных условиях в течение 12 часов при 37°С;

(д) в качестве контроля используют неизрасходованную ¹/₂ среды TSY или облегченную среду MRS;

(е) определяют максимальную оптическую плотность (OD_{600, max}) и/или определяют максимальную скорость роста (V_max) во время экспоненциального роста; и

(ж) микроорганизм классифицируют как микроорганизм, способный стимулировать рост Streptococcus salivarius, если максимальная оптическая плотность (OD_{600, max}) и/или максимальная скорость роста (V_max) увеличивается, по меньшей мере, на 10% по сравнению с контролем.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения инкубацию осуществляют в 96-луночном планшете. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения инкубацию осуществляют в спектрофотометре для микропланшета Bio Tek PowerWave (Fa Biotek Instruments GmbH, Germany).

По отношению к OD_{600, max} и V_max применяется то же самое, что было сформулировано здесь выше.

Предпочтительно микроорганизм согласно настоящему изобретению приводит к увеличению максимальной оптической плотности (OD₆₀₀, _max) или максимальной скорости роста (V_max) Streptococcus salivarius в описанном выше анализе, по меньшей мере, на 15%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 30% и особенно предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, 50%, 60%, 70% или даже 80% по сравнению с контролем.

В особенно предпочтительно варианте осуществления изобретения стимуляция роста Streptococcus salivarius, проявляемая микроорганизмом согласно изобретению, устойчива к термической обработке, т.е. она также происходит, когда клетки (или их экстракты) или культуральный супернатант подвергаются термической обработке. Термическая обработка предпочтительно представляет собой термическую обработку при температуре между 60°С и 100°С, более предпочтительно между 70°С и 90°С, еще более предпочтительно между 75°С и 85°С и наиболее предпочтительно при температуре около 80°С или ровно 80°С.

Обычно термическая обработка должна длиться в течение по меньшей мере 1 минуты. Предпочтительно, термическая обработка длится в течение по меньшей мере n минут, где n представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 60, где n=10, или 15, или 20 является особенно предпочтительным. Тем не менее, в принципе не существует верхнего предела для времени инкубации. Однако предпочтительно оно не должно быть больше чем 4, 3, 2 или 1 час. Наиболее предпочтительной термической обработкой является обработка в течение 10 минут при температуре 80°С в инкубаторе. Наиболее предпочтительной термической обработкой считается обработка, разрушающая любую функцию белка и любую функцию жизнеспособности клеток, и, таким образом, вышеупомянутый микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, отличает от другого микроорганизма то, что он все еще способен стимулировать рост Streptococcus salivarius. Следовательно, он очень полезен для использования в любом продукте питания, кормовом продукте, напитке или композиции в контексте настоящего изобретения, если желательно, чтобы микроорганизм не являлся живым.

После остывания способность микроорганизма согласно изобретению (или его экстрактов) или его культурального супернатанта стимулировать рост Streptococcus salivarius определяется в анализе, как описано здесь выше или как описано в прилагаемых Примерах. Применительно к культуральному супернатанту микроорганизма согласно изобретению соответствующий анализ предпочтительно содержит следующие шаги:

(з) Streptococcus salivarius культивируют в анаэробных условиях в 6-луночных планшетах с 8 мл TSY среды в течение ночи при 37°С;

(и) тестируемый микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, культивируют в анаэробных условиях в 96-луночных планшетах со 150 мкл искусственной среды в течение 24 часов при 37°С, клетки осаждают центрифугированием при 4000·g в течение 15 мин и супернатант восстанавливают;

(к) супернатант инкубируют при 80°С в течение 10 мин в инкубаторе и затем охлаждают до комнатной температуры;

(л) культуру клеток Streptococcus salivarius с шага (з) смешивают в объемном соотношении 2:1 с супернатантом с шага (к) в ¹/₂ среды TSY;

(м) культуральную суспензию инкубируют в аэробных условиях в течение 12 часов при 37°С;

(н) в качестве контроля используют неизрасходованную ¹/₂ среды TSY или облегченную среду MRS;

(о) определяют максимальную оптическую плотность (OD_{600, max}) и/или определяют максимальную скорость роста (V_max) во время экспоненциального роста; и

(п) микроорганизм классифицируют как микроорганизм, способный стимулировать рост Streptococcus salivarius, если максимальная оптическая плотность (OD_{600, max}) и/или максимальная скорость роста (V_max) увеличивается, по меньшей мере, на 10% по сравнению с контролем.

Более того, также свойство отсутствия стимуляции роста Streptococcus mutans и/или Porphyromonas gingivalis микроорганизмом согласно изобретению устойчиво к термической обработке. По отношению к определению времени термической обработки применяется то же самое, что было сформулировано выше.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения стимуляция роста Streptococcus salivarius, проявляемая микроорганизмом согласно изобретению, устойчива к лиофилизации, т.е. она также происходит, когда клетки подвергаются лиофилизирующей обработке. Лиофилизирующая обработка предпочтительно представляет собой лиофилизирующую обработку, в которой клетки (или их экстракты) или клеточный супернатант сначала замораживают до -80°С и затем лиофилизируют в вакууме в течение 16 часов. После лиофилизирующей обработки способность микроорганизма согласно изобретению стимулировать рост Streptococcus salivarius может тестироваться с помощью анализов, уже описанных выше, или как описано в прилагаемых Примерах. Применительно к культуральному супернатанту микроорганизма согласно изобретению соответствующий анализ предпочтительно содержит следующие шаги:

(р) Streptococcus salivarius культивируют в анаэробных условиях в 6-луночных планшетах с 8 мл TSY среды в течение ночи при 37°С;

(с) тестируемый микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, культивируют в анаэробных условиях в 96-луночных планшетах с 50 мкл искусственной среды в закрытых 100-миллилитровых бутылках в течение ночи при 37°С, клетки осаждают центрифугированием при 4000·g в течение 15 мин и супернатант восстанавливают;

(т) 20 мл супернатанта с шага (с) замораживают до -80°С и лиофилизируют в вакууме в течение 16 часов;

(у) лиофилизированный супернатант ресуспендируют в 20 мл Н₂О;

(ф) культуру клеток Streptococcus salivarius с шага (p) смешивают в объемном соотношении 2:1 с супернатантом с шага (у) в ¹/₂ среды TSY в 96-луночных планшетах;

(х) культуральную суспензию инкубируют в аэробных условиях в течение 12 часов при 37°С;

(ч) в качестве контроля используют неизрасходованную ¹/₂ среды TSY или облегченную среду MRS;

(ш) определяют максимальную оптическую плотность (OD_{600, max}) и/или определяют максимальную скорость роста (V_max) во время экспоненциального роста; и

(щ) микроорганизм классифицируют как микроорганизм, способный стимулировать рост Streptococcus salivarius, если максимальная оптическая плотность (OD_{600, max}) и/или максимальная скорость роста (V_max) увеличивается, по меньшей мере, на 10% по сравнению с контролем.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения микроорганизм согласно изобретению проявляет оба свойства, соответственно описанных для первого и второго объекта настоящего изобретения, т.е. он показывает свойства (б) и/или (Б), как описано для первого объекта (резкое снижение концентрации пептидов) и проявляет свойства, как описано для второго объекта (стимуляция роста Streptococcus salivarius и отсутствие стимуляции роста Streptococcus mutans и/или Porphyromonas gingivalis).

Микроорганизмы согласно изобретению, как описано здесь выше, благодаря их свойствам позволяют сдвинуть баланс микрофлоры полости рта в сторону Streptococcus salivarius, что приводит к оздоровлению с точки зрения развития меньшего количества неприятного запаха изо рта.

Как очевидно из изложенного, все вышеупомянутые характеристики делают вышеупомянутый микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, подходящим агентом для снижения неприятного запаха изо рта и/или халитоза или для предотвращения и/или лечения неприятного запаха изо рта и/или халитоза, особенно неприятного запаха изо рта и/или халитоза, вызываемых патогенными микроорганизмами микробной флоры полости рта, особенно анаэробными грамотриц