Ячмень с низким содержанием гордеинов

Ячмень с низким содержанием гордеинов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам получения продуктов питания или напитков на основе солода, подходящих для потребления лицом, страдающим целиакией. В частности настоящее изобретение относится к способам получения продуктов питания или напитков на основе солода с низким содержанием гордеинов. Также предлагаются растения ячменя, дающие зерно, которое может применяться в способах изобретения.

Целиакия (глютеновая энтеропатия) (CD, называемая также целиакия-спру) является опосредованным T-клетками аутоиммунным заболеванием тонкой кишки, которая вызывается у восприимчивых людей при потреблении в пищу определенных запасных белков, известных в целом как проламины, из пшеницы (глютена, состоящего из глютенинов и глиадинов), ячменя (гордеинов) или ржи (секалинов). Проламины овса (авенины), по-видимому, переносятся большинством больных целиакией (Hogberg et al., 2004; Peraaho et al, 2004a), однако у меньшего числа больных целиакией они могут вызвать положительные реакции (Lundin et al. 2003; Peraaho et al. 2004b). CD встречается у приблизительно 0,25-1% населения, по меньшей мере, в Австралии, Северной и Южной Америке, Европе, Африке и Индии (Hovell et al. 2001; Fasano et al. 2003; Treem 2004), однако данное заболевание, вероятно, диагностируется на недостаточном уровне. Увеличение информированности по поводу симптомов и последствий неподвергавшихся лечению случаев CD в Австралии приводит к повышению количества диагностируемых случаев на 15% ежегодно. Приблизительно 1-4 европейцев и жителей западной Азии имеют аллели HLA-DQ8 или -DQ2, которые являются необходимой, но не достаточной детерминантой CD (Treem 2004). При этом лишь у приблизительно 1 - 20 человек с данными аллелями развивается CD. В настоящее время единственным лечением является полный отказ от пшеницы, ячменя и ржи, поскольку рецидивы могут быть вызваны потреблением всего лишь 10 миллиграммов глютена в день (Biagi et al., 2004).

В случае невыявления заболевания или отсутствия лечения, CD приводит к серьезным последствиям для здоровья, которые могут угрожать жизни, особенно у детей первого года жизни. CD вызывает деформацию абсорбирующих ворсинок тонкой кишки и может приводить к разрушению ворсинок. В результате питательные вещества плохо всасываются, причем это может быть связано с потерей веса, усталостью, минеральной недостаточностью, дерматитом и потерей ночного зрения, а также интенсивного кишечного расстройства, которое обычно включает вздутие, диарею и спазмы. Лица с нелеченной CD подвергаются повышенному риску развития рака, например, 10-кратному повышению риска возникновения карциномы тонкой кишки, 3-6-кратному повышению риска возникновения неходжкинской лимфомы и 28-кратному повышению риска возникновения Т-клеточной лимфомы кишечника. CD также представляет 3-кратное повышение риска развития диабета I типа (Peters et al., 2003; Peters et al., 2003; Verkarre et al., 2004). Также сообщали о пятикратном повышении частоты психической депрессии у пациентов с целиакией (Pynnonen et al., 2004).

Молекулярная основа целиакии в настоящее время довольно хорошо изучена (Sollid 2002; Hadjivassiliou et al. 2004) и представляет собой реакцию на определенную последовательность аминокислот в проламинах. Плохо переваренные пептиды проламинов, богатые пролином и глутамином, соответствуют субстратному мотиву, с которым в слизистой оболочке кишечника взаимодействует тканевая трансглутаминаза (tTG) человека, которая дезамидирует ключевые остатки глутамина. Образующаяся в результате отрицательно заряженная глутаминовая кислота позволяет дезамидированному проламину связываться со специфическим классом молекул HLA (DQ2 или DQ8) (Kim et al. 2004). Стимулируется пролиферация специфичных клонов T-клеток, так называемых DQ2 (8)/CD4⁺ несущих T-клеток, направленных на эндотелий кишечника, которые секретируют лимфокины, вызывающие атрофию кишечных ворсинок или выработку антител (Hadjivassiliou et al. 2004). Указанные клоны T-клеток достигают максимальной концентрации в периферической крови больных целиакией приблизительно через шесть дней после пищевой провокации (Anderson et al. 2000). Токсичность очищенных белков при целиакии, таким образом, может быть точно и специфично определена путем измерения их способности стимулировать T-клетки к выработке IFN-γ - цитокина, являющегося основным в патогенезе энтеропатии, наблюдаемой при целиакии. Поэтому вероятно, что заболевание вызывается иммунной системой хозяина, которая реагирует на проламины, формируя мощный иммунный ответ, как если бы они являлись скорее патогеном, чем аллергеном.

Глютен пшеницы состоит из многих сотен различных, но родственных белков, включая мономерные глиадины и полимерные глютенины. Глиадины составляют приблизительно половину глютеновой фракции, при этом α-глиадины составляют более 50% глиадинов (Wieser et al., 1994; Gellrich et al., 2003). До настоящего времени большинство данных по токсичности при целиакии было сосредоточено на α-глиадине - первом клонированном и полностью отсеквенированном проламине (Kasarda et al., 1984). Токсичность α-глиадина пшеницы при целиакии в значительной степени определяется одним остатком глутамина в пределах ключевого эпитопа длиной 17 аминокислот (Arentz-Hansen et al., 2000; Anderson et al., 2000; Shan et al., 2002). Были идентифицированы природные и синтетические пептиды, несущие точковые мутации в данной области, которые не являлись токсичными (Vader et al., 2003). Таким образом, кажется возможным, что могут быть идентифицированы другие нетоксичные, но функциональные проламиновые молекулы. В настоящий момент практическое предсказание токсичности при целиакии ограничивается небольшой фракцией проламинов, которые были описаны по аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности генов, кодирующих их.

Ячмень представляет собой диплоидную злаковую культуру, которую широко выращивают в зонах с более прохладным климатом для производства напитков и продуктов питания. Белки семени ячменя подразделяются на альбумин, глобулин, проламин (гордеин) и глютелин в зависимости от их растворимости в воде, растворе соли, водном растворе спирта, а также в щелочных или кислотных растворах соответственно. Приблизительно половина запасных белков семени в ячмене присутствует в проламиновой фракции. Данные проламины, прежде всего, являются запасными белками, которые служат в качестве источников углерода, азота или серы для роста и развития после прорастания. Гордеин составляет приблизительно 40% белка семени, хотя это зависит от обеспечения растения азотом в процессе роста. Локусы, кодирующие проламины ячменя, были характеризованы главным образом из-за их вклада в качество ячменного солода, а также в пенообразование и мутность в производстве пива. В ячмене присутствует четыре класса проламинов - B-, C-, D- и γ-гордеины, кодируемые локусами Hor2, Horl, Hor3 и Hor5 соответственно, на хромосоме 1H (Shewry et al. 1999). Указанные локусы кодируют белки, которые варьируют от одного проламина (например, D-гордеин) до семейств белков, содержащих 20-30 членов (например, B- и C-гордеины). B- и C-гордеины встречаются относительно более часто, включая приблизительно 70% и 24% от общего количества гордеинов соответственно. D- и γ-гордеины представляют минорные компоненты, приблизительно по 2-4% каждый. Молекулярная масса гордеинов изменяется приблизительно от 35 кДа до 100 кДа. Каких-либо проламинов ячменя, которые имеют близкую гомологию с α-глиадинами пшеницы, нет, однако общеизвестно, что гордеины токсичны для больных целиакией (Williamson & Marsh 2000). Относительно степени, в которой отдельные гордеины ячменя стимулируют CD, не сообщали.

Пиво является широко потребляемым продуктом, производимым из соложеного ячменя, поэтому пиво, как широко предполагается, не подходит для больных целиакией и, как правило, исключено из их диеты. Kanerva et al. (2005) смогли идентифицировать проламины в низких уровнях во всех сортах из множества сортов пива, кроме одного. Врачи и диетологи обычно убеждают своих пациентов с CD стараться избегать потребления любых продуктов, содержащих пшеницу, ячмень или рожь, включая пиво. В США определение FDA "не содержит глютена" требует, чтобы продукт был произведен только из сырья, не содержащего глютен, то есть вообще не содержащего пшеницу, ячмень или рожь. Кодекс алиментариус допускает пометку "не содержит глютена" на пищевых продуктах, содержащих не более 200 м.д. глютена (0,2 г на килограмм или литр), это также соответствует европейскому стандарту для продуктов, которые "не содержат глютена". Большинство больных целиакией может потреблять приблизительно до 10 мг глютена в день без развития основного эффекта (Thompson, 2001).

Проламины, токсичные для пациентов с целиакией, можно специфично обнаружить с помощью иммуноанализов, таких как ELISA (Ellis et al., 1990; Sorell et al., 1998). Данные анализы основаны на специфичном взаимодействии между белком и антителом. Также использовали электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ) и ВЭЖХ (Kanerva et al., 2005; Marchylo et al., 1986; Sheehan and Skerritt, 1997).

Таким образом, существует потребность в ячмене со значительно более низким содержанием CD-индуцирующих гордеинов, который может применяться в продуктах питания и напитках, предназначенных для лиц, подверженных риску развития CD.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В ячмене присутствует четыре класса проламинов - B-, C-, D-и γ-гордеины, кодируемые локусами Hor2, Horl, Hor3 и Hor5 соответственно. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что, по меньшей мере, B, C и D классы вызывают нежелательные воспалительные ответы у лиц с целиакией.

Тогда как ранее были идентифицированы различные мутанты ячменя с продукцией определенных классов гордеинов в уменьшенных уровнях, также наблюдали, что это, по меньшей мере, компенсировалось увеличенной продукцией гордеинов других классов. Это позволяет предположить, что семя ячменя имеет компенсационные механизмы, которые обеспечивают определенные уровни гордеинов, необходимые для того, чтобы семя являлось жизнеспособным. Неожиданно авторы настоящего изобретения определили, что большая часть, если не все количество, гордеинов, вырабатываемых в ячмене, можно удалить и получить при этом жизнеспособные семена, которые способны прорастать и давать растения ячменя в полевых условиях, несмотря на потерю основной запасной формы азота в семени. Указанные семена в частности полезны для производства продуктов питания и напитков, пригодных для потребления лицами, страдающими целиакией.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения продукта питания или напитка на основе солода, включающий смешивание зерна ячменя или солода, муки или непросеянной муки, полученной из указанного зерна с по меньшей мере другим компонентом продукта питания или напитка, причем зерно, солод, мука или непросеянная мука содержит около 25% или менее от содержания гордеинов в зерне, от соответствующего растения ячменя дикого типа, или солоде, муке или непросеянной муке, полученных аналогичным путем из зерна, получаемого из соответствующего растения ячменя дикого типа, с получением в результате продукта питания или напитка на основе солода.

Предпочтительно, зерно, солод, мука или непросеянная мука содержит около 15% или менее, около 10% или менее, около 7,5% или менее, около 5% или менее или, более предпочтительно около 2,5% или менее от содержания гордеинов в зерне соответствующего растения ячменя дикого типа, или солоде, муке или непросеянной муке, полученных аналогичным путем из зерна дикого типа.

Примеры растения ячменя дикого типа включают, помимо прочих, Bomi, Sloop, Carlsberg II, K8 или L1.

В другом варианте осуществления зерно содержит около 25% или менее, около 20% или менее, около 15% или менее, около 10% или менее, около 7,5% или менее, около 5% или менее или более предпочтительно около 2,5% или менее от содержания B-, C- и/или D-гордеинов или любых комбинаций перечисленного в зерне соответствующего растения ячменя дикого типа. Солод, мука или непросеянная мука могут включать аналогичную степень снижения уровня гордеинов B, C и/или D, или любых комбинаций перечисленного.

В другом варианте осуществления мука содержит менее чем около 0,4%, менее чем около 0,3%, менее чем около 0,2% и более предпочтительно менее чем около 0,1% гордеинов. Уровни гордеина в муке, полученной из указанного зерна, могут быть определены с помощью любого метода, известного в уровне техники, такого как спиртовое фракционирование.

В одном из вариантов осуществления зерно имеет средний вес (ср. вес 100 зерен), по меньшей мере, около 2,4 г. Предпочтительно, зерно имеет средний вес от около 2,4 до около 6 г, более предпочтительно средний вес от около 3,5 до около 6 г.

В другом варианте осуществления, содержание крахмала в зерне составляет, по меньшей мере, приблизительно 50% (по весу). Более предпочтительно, содержание крахмала в зерне составляет от приблизительно 50% до приблизительно 70% (по весу). Содержание крахмала может быть определено с использованием любой методики, известной в уровне техники. Например, может применяться способ, приведенный в Примере 4.

В следующем варианте осуществления токсичность при целиакии муки, полученной из зерна, составляет менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 25%, более предпочтительно приблизительно 10% или менее, от соответствующего показателя муки, полученной из зерна соответствующего растения ячменя дикого типа. Токсичность при целиакии может быть определена, используя любую технику, известную в уровне техники. Например, может применяться способ, приведенный в Примере 1.

В еще одном варианте осуществления солод, полученный из зерна, содержит менее чем приблизительно 200 м.д. гордеинов, менее чем приблизительно 125 м.д. гордеинов, более предпочтительно менее чем приблизительно 75 м.д. гордеинов. Содержание гордеина также может быть определено с помощью любого метода, известного в уровне техники. Например, может применяться способ, приведенный в Примере 7.

В другом варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 50% генома зерна ячменя идентичны геному ячменя сорта Sloop.

Предпочтительно, зерно получено из растения, которое является гомозиготным, по меньшей мере, по одному, по меньшей мере, по двум, по меньшей мере, по трем или более локусам для генетической вариации (вариаций), которая приводит к пониженному содержанию гордеина, по меньшей мере, одного, по меньшей мере, двух или всех трех классов B, C и D, по сравнению с соответствующим растением ячменя дикого типа. Более предпочтительно, указанные генетические вариации представляют собой аллели, в которых удалена большая часть или все гены, кодирующие B-гордеин, в локусе Hor2, и/или мутантный аллель в локусе Lys3 ячменя.

В одном варианте осуществления зерно получено из нетрансгенного растения. Например, зерно может быть получено в результате скрещивания между Riso 56 и Riso 1508 или их потомства, включающих мутации hor2 и Lys3 соответственно, присутствующие в указанных родительских линиях. Предпочтительно, такие растения, полученные в результате скрещивания, включают генетический фон, по существу отличный от Riso 56 или Riso 1508, например, содержащий менее чем приблизительно 25% генетического фона указанных родительских линий.

В другом варианте осуществления зерно получено из трансгенного растения. Одним из вариантов осуществления трансгенного растения является растение, которое включает трансген, кодирующий полинуклеотид, который подавляет продукцию, по меньшей мере, одного гордеина в зерне. Предпочтительно, полинуклеотид данного варианта осуществления является антисмысловым полинуклеотидом, смысловым полинуклеотидом, каталитическим полинуклеотидом, искусственной микроРНК или РНК дуплексом, которые подавляют экспрессию одного или предпочтительно нескольких генов, кодирующих гордеины.

Другим вариантом осуществления трансгенного растения является растение, которое включает трансген, кодирующий проламин, который менее токсичен, или предпочтительно нетоксичен, для лица, страдающего целиакией. Пример проламина, который является нетоксичным для лица, страдающего целиакией, включает, помимо прочего, авенины овса и зеины кукурузы.

В одном из вариантов осуществления способ включает получение из зерна муки или непросеянной муки.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает солод, полученный из зерна. В варианте осуществления способ дополнительно включает фракционирование высушенного, пророщенного зерна на две или более из фракции эндосперма, фракции эндотелиального слоя, фракции шелухи, фракции зародышей и фракции солодовых ростков; а также комбинирование и смешивание заданного количества двух или более фракций.

Что касается производства солода и пива, важным компонентом семени ячменя является крахмал. При этом уровни крахмала в мутантах ячменя с уменьшенным содержанием гордеинов, как было показано ранее, снижены, что может привести к тому, что семя будет неподходящим для производства солода и пива. Авторы изобретения в частности неожиданно обнаружили, что семена ячменя, в которых большая часть, если не все количество, продуцируемого гордеина была удалена, могут использоваться для производства солода и пива с подходящими свойствами для коммерческого производства. Таким образом, в наиболее предпочтительном варианте осуществления напитком на основе солода является пиво или виски, причем способ включает проращивание зерна.

В одном из вариантов осуществления напитком на основе солода является пиво, которое содержит, по меньшей мере, около 2%, более предпочтительно, по меньшей мере, около 4% спирта. Предпочтительно, спирт является этанолом.

В еще одном варианте осуществления напитком на основе солода является пиво, которое содержит менее чем около 1 м.д. гордеинов.

В следующем варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 50% зерна прорастает в течение 3 дней после набухания в стандартных условиях, используемых при соложении.

Примеры продуктов питания, которые могут быть произведены с применением способов изобретения, включают, помимо прочих, муку, крахмал, дрожжевой или бездрожжевой хлеб, пасту, лапшу, корм для животных, готовые завтраки (хлопья), закусочные пищевые продукты, пироги, солод, мучные кондитерские изделия или продукты питания, содержащие соусы на основе муки.

Предпочтительно, продукт питания или напиток на основе солода предназначен для потребления человеком. В другом предпочтительном варианте осуществления после употребления продукта питания или напитка, по меньшей мере, один симптом целиакии не развивается у лица с указанным заболеванием.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения продукта питания или напитка на основе солода, включающий смешивание солода, включающего один или более белков зерна ячменя и менее чем приблизительно 200 м.д. гордеинов, и/или муки, включающей один или более белков зерна ячменя и менее чем приблизительно 0,4% гордеинов, по меньшей мере, с одним другим компонентом продукта питания или напитка, с получением в результате продукта питания или напитка на основе солода.

В одном из вариантов осуществления способ включает получение солода и/или муки.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения продукта питания или напитка на основе солода, включающий смешивание зерна ячменя или солода, муки или непросеянной муки, полученной из указанного зерна, по меньшей мере, с одним другим компонентом продукта питания или напитка, с получением в результате продукта питания или напитка на основе солода, где мука, полученная из зерна, содержит менее чем приблизительно 0,4% гордеинов, и/или солод, полученный из зерна, содержит менее чем приблизительно 200 м.д. гордеинов.

В одном из вариантов осуществления способ включает получение солода и/или муки.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает растение ячменя, из которого получают зерно, включающее приблизительно 25% или меньшее количество гордеинов, от уровня в зерне, полученном из соответствующего растения ячменя дикого типа.

Предпочтительно, зерно содержит около 15% или менее, около 10% или менее, около 7,5% или менее, около 5% или менее, или более предпочтительно около 2,5% или менее гордеинов, от содержания в зерне от соответствующего растения ячменя дикого типа. Примеры растения ячменя дикого типа включают, помимо прочих, Bomi, Sloop, Carlsberg II, K8 или L1.

В другом варианте осуществления зерно содержит около 25% или менее, около 20% или менее, около 15% или менее, около 10% или менее, около 7,5% или менее, около 5% или менее или более предпочтительно около 2,5% или менее от содержания B-, C- и/или D-гордеинов, или любых комбинаций перечисленного, в зерне от соответствующего растения ячменя дикого типа.

В другом варианте осуществления мука, полученная из зерна, содержит менее чем около 0,4%, менее чем около 0,3%, менее чем около 0,2% и более предпочтительно менее чем около 0,1% гордеинов.

В варианте осуществления зерно имеет средний вес (ср. вес 100 зерен), по меньшей мере, около 2,4 г. Предпочтительно, зерно имеет средний вес от около 2,4 г до около 6 г, более предпочтительно средний вес от около 3,5 г до около 6 г.

В другом варианте осуществления содержание крахмала в зерне составляет, по меньшей мере, около 50% (по весу). Более предпочтительно, содержание крахмала в зерне составляет от около 50% до около 70 % (по весу).

В следующем варианте осуществления токсичность при целиакии муки, полученной из зерна, составляет менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 25%, более предпочтительно приблизительно 10% или меньше, от уровня токсичности муки, полученной из зерна соответствующего растения ячменя дикого типа.

В еще одном варианте осуществления солод, полученный из зерна, содержит менее чем около 200 м.д. гордеинов, менее чем около 125 м.д. гордеинов, более предпочтительно менее чем около 75 м.д. гордеинов.

В другом варианте осуществления, по меньшей мере, около 50% генома зерна ячменя идентичны геному сорта ячменя Sloop.

Предпочтительно, зерно получено из растения, которое является гомозиготным, по меньшей мере, по одному, по меньшей мере, по двум, по меньшей мере, по трем или более локусов для генетической вариации (вариаций), которая приводит к снижению уровня гордеина, по меньшей мере, одного, по меньшей мере, двух или всех трех классов B, C и D, по сравнению с уровнем в соответствующем растении ячменя дикого типа.

В одном варианте осуществления зерно получено из нетрансгенного растения. Например, зерно может быть получено в результате скрещивания Riso 56 и Riso 1508 или их потомства, включающих мутации hor2 и Lys3 соответственно, присутствующие в указанных родительских линиях. Предпочтительно, такое зерно включает генетический фон, по существу отличный от Riso 56 или Riso 1508, например, содержащий менее чем приблизительно 25% генетического фона указанных родительских линий.

В другом варианте осуществления зерно получено из трансгенного растения.

Один из вариантов осуществления трансгенного растения является растением, которое включает трансген, кодирующий полинуклеотид, который подавляет продукцию в зерне, по меньшей мере, одного гордеина. Предпочтительно, полинуклеотид данного варианта осуществления является антисмысловым полинуклеотидом, смысловым полинуклеотидом, каталитическим полинуклеотидом, искусственной микроРНК или РНК дуплексом, которые подавляют экспрессию одного или предпочтительно нескольких генов, кодирующих гордеины.

Другим вариантом осуществления трансгенного растения является растение, которое включает трансген, кодирующий проламин, который менее токсичен, предпочтительно нетоксичен для лица с целиакией. Пример проламина, который является нетоксичным для лица с целиакией, включает, помимо прочих, авенин овса.

В следующем варианте осуществления, по меньшей мере, приблизительно 50% зерна прорастает в течение 3 дней после набухания в стандартных условиях, используемых при соложении.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает растение ячменя, из которого получают зерно, где мука, полученная из зерна, включает менее чем приблизительно 0,4% гордеины, и/или солод, полученный из зерна, включает менее чем приблизительно 200 м.д. гордеинов.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает зерно растения ячменя согласно изобретению.

В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения зерна ячменя, включающий:

a) выращивание растения ячменя изобретения,

b) сбор урожая зерна, и

c) возможно, обработка зерна.

Предпочтительно, растения выращивают в коммерческом масштабе в полевых условиях. Например, в одном варианте осуществления способ включает выращивание, по меньшей мере, 1000, более предпочтительно, по меньшей мере, 5000 растений в поле на площади, по меньшей мере, один гектар.

Также предлагается способ получения муки, непросеянной муки, крахмала или другого продукта, полученного из зерна, включающий:

a) получение зерна изобретения, и

b) обработку зерна для получения муки, непросеянной муки, крахмала или другого продукта.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает продукт, полученный из растения ячменя изобретения или зерна изобретения.

В одном из вариантов осуществления продукт является продуктом питания или напитком на основе солода.

Предпочтительно напиток на основе солода является пивом или виски.

В другом варианте осуществления продукт является непищевым продуктом, предпочтительно включающим крахмал или состоящим, по меньшей мере, из приблизительно 50% крахмала. Примеры включают, помимо прочего, пленки, покрытия, клеящие материалы, бумагу, строительные материалы и упаковочные материалы, или продукты, не содержащие крахмал, такие как этанол.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает продукт питания или напиток на основе солода, произведенный с применением способа изобретения.

В одном из вариантов осуществления напиток на основе солода является пивом, которое включает, по меньшей мере, приблизительно 2%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 4% спирта. Предпочтительно, спирт является этанолом.

В еще одном варианте осуществления напиток на основе солода является пивом, которое включает менее чем приблизительно 1 м.д. гордеинов.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает пиво, включающее один или более белков зерна ячменя и менее чем приблизительно 1 м.д. гордеинов. В одном из вариантов осуществления пиво содержит менее чем приблизительно 0,5 м.д. гордеинов.

Предпочтительно пиво включает, по меньшей мере, приблизительно 2%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 4% спирта. Предпочтительно спирт является этанолом. Примеры белков зерна ячменя включают, помимо прочих, 9 кДа белок переноса липидов 1 ячменя (LTP1) и белок Z.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает муку, включающую один или более белков зерна ячменя и менее чем приблизительно 0,4% гордеинов.

В одном из вариантов осуществления мука включает менее чем приблизительно 0,3%, менее чем приблизительно 0,2% и более предпочтительно менее чем приблизительно 0,1% гордеинов.

Предпочтительно мука включает менее чем приблизительно 7 мг, более предпочтительно менее чем приблизительно 5 мг спирторастворимого белка/г сухого веса муки.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает солод, включающий один или более белков зерна ячменя и менее чем приблизительно 200 м.д. гордеинов.

В одном из вариантов осуществления солод включает менее чем приблизительно 125 м.д. гордеинов, более предпочтительно менее чем приблизительно 75 м.д. гордеинов.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации зерна ячменя, которое может использоваться для получения продукта питания и/или напитка на основе солода, пригодного для употребления лицом с целиакией, включающий:

a) получение одного или нескольких следующих материалов:

i) образца из растения, способного давать указанное зерно,

ii) зерна,

iii) солода, полученного из зерна, и/или

iv) экстракта указанного зерна,

b) анализ материала стадии a) на наличие, по меньшей мере, одного гордеина и/или, по меньшей мере, одного гена, кодирующего гордеин,

где чем больше количество гордеинов, продуцированных в зерне, тем зерно меньше подходит для производства продукта питания и/или напитка на основе солода, пригодного для употребления лицом с целиакией.

В варианте осуществления образец является зерном, а стадия b) включает анализ материала на наличие гордеинов B и/или C. Это может быть выполнено с использованием любого метода, известного в уровне техники, например, с использованием иммунологического метода, такого как анализ ELISA. Может применяться способ, описанный в Примере 1. В одном из вариантов осуществления стадия b) включает пероральное введение материала из стадии a) лицу с целиакией и определение иммунореактивности T-клеток, полученных у лица, в отношении к одному или нескольким гордеинам ячменя.

В другом варианте осуществления материал образца стадии a) включает геномную ДНК, а стадия b) включает обнаружение отсутствия одного или нескольких функциональных генов гордеинов. Опять же, это может быть выполнено с использованием любого метода, известного в уровне техники. Например, выполняя стадию амплификации гена, как описано в Примере 9.

В одном из вариантов осуществления способ включает стадию селекции растения ячменя, зерна или солода согласно изобретению из множества образцов растений, зерна или солода для культивирования или применения. Такая селекция основана, прямо или косвенно, на уменьшенной токсичности материала при целиакии.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ профилактики или снижения частоты или тяжести целиакии у лица, включающий пероральное введение лицу продукта питания или напитка на основе солода изобретения, или зерна изобретения. Частота или тяжесть заболевания в данном контексте, как понимают, снижены относительно введения равного количества продукта питания или напитка, приготовленного из ячменя дикого типа. Продукт питания или напиток могут применяться для обеспечения питательными веществами, или повышенным количеством питательных веществ, лица, страдающего целиакией, уменьшая при этом риск провоцирования симптомов заболевания.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает применение продукта питания или напитка на основе солода изобретения, или зерна изобретения, в целях производства лекарственного средства, предназначенного для перорального введения лицу питательных веществ, предотвращая или уменьшая в то же время частоту или тяжесть целиакии.

Как очевидно, предпочтительные признаки и особенности одного из аспектов изобретения применимы к любому другому аспекту изобретения.

По всему тексту настоящего описания слово "включает", или такие вариации, как "включающий", следует понимать, как включение указанного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, а не исключение какого-либо другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.

Далее изобретение описано посредством неограничивающих Примеров со ссылкой на сопровождающие иллюстрации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СОПРОВОЖДАЮЩИХ ИЛЛЮСТРАЦИЙ

Фиг.1: Обращено-фазовая FPLC суммарного экстракта проламинов, на которой показаны хроматограммы A280 нм пшеницы (a), ячменя (b), овса (c); кукурузы (d) или чистый градиент (e). Наносили проламины, эквивалентные 0,2 г муки. Показан окисленный ДТТ (DTTox); хроматограммы были сведены для ясности.

Фиг.2: Обращено-фазовая FPLC гордеинов. На репрезентативной хроматограмме показаны A280 нм (сплошная линия) и смесь растворителей (пунктирная линия) в ходе выделения гордеиновой фракции 1 (#1), 2 (#2), 3 (#3), 4 (#4), 5 (#5), или 6 (#6) из экстракта ячменя. Указанные фракции были объединены, как показано (жирная линия), из последовательных введений проб.

Фиг.3: Анализ 20 мкг гордеиновых фракций #1-6 с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, гель окрашен 0,06% Coomassie Blue G250. На левой дорожке указано положение стандартов молекулярной массы (в кДа, BenchMark, Invitrogen).

Фиг.4: Стимуляция выработки IFN-γ в T-клетках, выделенных у больных целиакией через шесть дней после диетической провокации, суммарными препаратами проламинов, приготовленными из ячменя, пшеницы, овса или кукурузы в присутствии (•, n=21)) или отсутствии (o, n=13) предварительной обработки tTG. IFN-γ положительные колонии были подсчитаны и представлены, как среднее SFU ± SE. Планки погрешностей не показывали, когда SE было меньше, чем символы.

Фиг.5: Стимуляция выработки IFN-γ в T-клетках, выделенных у больных целиакией через шесть дней после диетической провокации гордеиновыми фракциями #1, 2, 3, 4, 5 и 6, в присутствие (•, n=21)), или отсутствие (o, n=13) предварительной обработки tTG. IFN-γ положительные колонии были подсчитаны и представлены, как среднее SFU ± SE. Планки погрешностей не показывали, когда SE было меньше, чем символы.

Фиг.6: Хроматограммы аналитической обращено-фазовой ВЭЖХ выделенных гордеиновых фракций. На репрезентативных хроматограммах показаны A280 нм в ходе ВЭЖХ гордеиновых фракций #1, 2, 3, 4, 5, 6, выделенных из ячменя. Для сравнения показаны хроматограммы для ячменя дикого типа (Himalaya), на которых показана элюция (сплошная линия) гордеины D, C, и B, а также мутант R56, в котором накапливаются главным образом C гордеины.

Фиг.7: Характеристика проламинов в Riso56 и Riso1508 с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга. Двадцать мкг проламина, очищенного, как в Примере 1, из указанной линии ячменя, инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в буфере, содержащем 6,6 М мочевины, 2% (вес./об.) ДСН, 1% (вес./об.) ДТТ, 62,5 мМ Трис-HCl (pH 6,8) и 0,01% (вес./об.) бромфенолового синего, а затем наносили на две дорожки в 12% акриламидный гель и проводили электрофорез при 200 V в течение 40 мин. Гель промывали в буфере для переноса, содержащем 192 мМ глицина, 25 мМ Трис-основания и 20% (об./об.) метанола, в течение 10 минут, после чего выполняли перенос на нитроцеллюлозу (Amersham Hybond C+) при 100 V в течение 1 часа. Мембрану слева окрашивали в 0,2% Ponceau S (вес./об.) в 3% (вес./об.) трихлоруксусной кислоте, 3% 5-сульфосалициловой кислоте и быстро удаляли излишки красителя в воде; мембрану справа блокировали в 5% обезжиренном молоке в PBST в течение 1 часа, затем инкубировали с мышиным моноклональным антителом 12224 (Skerrit, 1988) в PBST, 3x промывали в PBST в течение 10 минут, инкубировали с антителом овцы против мышиного антитела, конъюгированным с HRP (Selenius), в PBST, 3x промывали в PBST 5 минут, инкубировали в ECL-реагенте Amersham согласно инструкции изготовителя, и выдерживали на Amersham Hyperfilm. MAb 12224 индуцировали против суммарного глютенинового экстракта, поэтому детектировали все гордеины и проламины (Skerrit, 1988).

Фиг.8: Обращено-фазовая FPLC гордеиновых экстрактов в Riso56 и Riso1508 в сравнении с диким типом Bomi и Carlsberg II. Гордеины выделяли из указанных линий, как в Примере 1, при этом на FPLC колонку наносили количество, эквивалентное 0,2 г муки, используя первый метод FPLC в Примере 1. Указано время элюирования C-гордеина (C-Hor) и B-гордеина (B-Hor).

Фиг.9: Репрезентативный электрофорез в ДСН-ПААГ спирторастворимых белков, нанесенных в расчете на семя. Проламиновые экстракты (10 мкл) отдельных семян ячменя F2 из скрещивания Riso1508 и Riso56 получали, как описано выше. Положения белковых стандартов 30, 50, 70 и 100 кДа указаны на дорожке слева. Также показаны белковые профили родительских линий Riso1508 и Riso56, и дикого типа (Bomi). Шесть дорожек из предполагаемых двойных нулевых проб содержат очень мало белка (ноль), шесть других дорожек содержат низкие уровни белка (сниженный).

Фиг.10: Репрезентативный электрофорез в ДСН-ПААГ спирторастворимых белков, нанесенных исходя из равного количества белка. Пробы, содержащие 20 мкг спирторастворимого белка, экстрагированного из отдельных семян ячменя F2, разделяли с помощью электрофореза, а гель окрашивали Coomassie blue. Наносили пробы из родительских линий (Riso 1508 и Riso 56), а также дикого типа (Bomi). Внешние и центральные дорожки (10 кДа) содержали белковые стандарты с известным молекулярным весом, указаны положения полос 30, 50, 70 и 100 кДа.

Фиг.11: Хроматограммы ОФ FPLC спирторастворимых экстрактов из семян ячменя F3. Спирторастворимые белки экстрагировали из отдельных семян F3, как описано; супернатанты двух семян из каждой линии объединяли, 50 мкл вводили в колонку ОФ FPLC и элюировали, как описано в Примере 1.