Биомаркеры и биомаркерные признаки почечной сохранности, обладающие предсказательной силой, для использования в мониторинге состояния почек

Биомаркеры и биомаркерные признаки почечной сохранности, обладающие предсказательной силой, для использования в мониторинге состояния почек

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[01] Изобретение относится к биомаркерным признакам и их использованию в методах и приемах для мониторинга, прогнозирования, диагностики и/или лечения почечного или печеночного токсического повреждения, конкретнее токсического повреждения почечных канальцев как следствия заболевания или применения лекарственных препаратов.

Предпосылки к созданию изобретения

[02] Прогрессия до конечной стадии почечной недостаточности является широко распространенным исходом различных протеинурических нефропатий. Уровень протеинурии связан со степенью прогрессирования поражения почек.

[03] В случае протеинурии у человека тубулоинтерстициальное поражение является более достоверным предсказателем ухудшения почечной функции, чем клубочковое поражение. Проникающие тубулотоксичные белки плазмы, по-видимому, ответственны за эту связь, хотя природа данных белков точно не известна. Проникающие белки проявляют свое негативное влияние частично через активацию проксимальных тубулярных клеток (ПТК), которые экскретируют хемокины и цитокины, что вызывает воспаления, миотрансформацию интерстициальных фибробластов, фиброз и апоптоз. В итоге это приводит к конечной стадии почечной недостаточности. Таким образом, эпителиальные клетки почечных канальцев играют важнейшую роль в развитии интерстициального поражения. Предполагается, что протеинурия вызывает поражение канальцев и интерстициальный фиброз.

[04] Существует постоянная потребность в методах определения и мониторинга почечной и печеночной функции у животных и людей после применения лекарственных препаратов или при возможном влиянии перенесенного заболевания на почечную функцию.

[05] Изобретение предоставляет тесты и приемы для диагностики и предсказания состояния, функции и сохранности почек и печени. Биомаркеры изобретения, другие клинико-химические параметры или их комбинации могут быть использованы в тестах и устройствах для диагностики состояния почек или печени, мониторинга неблагоприятных изменений, таких как нефро- или гепатотоксические повреждения, вызванные применением лекарственных препаратов, для подбора режима лечения на базе оценки состояния почек или печени, разработки клинических тестов для диагностики заболеваний почек или печени и оценки степени поражения этих органов.

[06] Изобретение позволяет проводить предсказание, классификацию, оценку взаимосвязанности и диагностику почечного или печеночного токсичного поражения, основанную на данных, представленных в этом документе.

[07] Также здесь описаны испытания на животных, в которых проводилось изучение влияние разных нефро- и гепатотоксинов с использованием различных режимов дозирования. Различные биологические образцы были получены от животных на разных временных промежутках. Моча, кровь, образцы тканей органов, мРНК из образцов тканей и крови получали в различные моменты времени и для разных исследованных групп. Оценка состояния животных на протяжении in vivo периода и после него проводилась с использованием различных методов, в частности с использованием клинического наблюдения и полученных in vivo данных (таких как масса тела, потребление пищи, макроскопическое и микроскопическое обследование органов (в частности, почек и печени)).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[08] Приведенные рисунки демонстрируют предпочтительные варианты выполнения в качестве примеров, а не в качестве единственно возможных.

[09] РИС.1 - это список соединений, примененных на животных в in vivo испытаниях.

[10] РИС.2 отражает случаи повреждений почек, обнаруженных во всех 10 испытаниях. Повреждения разделены по степени тяжести и группам воздействия (животные, на которых применялись нефротоксины, в сравнении с животными, на которых применялись гепатотоксины или плацебо).

[11] РИС.3 - это ТАБЛИЦА, в которой описаны гистопатологические изменения в почках, показанные в 10 in vivo испытаниях. Проявления повреждений разделены по степени и группам воздействия (применение нефротоксинов в сравнении с применением гепатотоксинов и плацебо).

[12] РИС.4 - это матрица гистопатологических данных исследования состояния почек при изучении цисплатина. Каждая колонка представляет собой локализованное повреждение. Каждый ряд соответствует животному, они следуют в порядке полученной животным дозы (контрольная группа, низкая доза, средняя доза и высокая доза) и в пределах каждой группы дозирования - по времени окончания испытания. Если наблюдалось повреждение, оно отмечается с помощью оранжевого поля с указанием в нем соответствующей степени повреждения (степень 1, степень 2-5, нет повреждения/степень 0). Преобладающие процессы обозначены.

[13] РИС.5 - это ТАБЛИЦА, в которой описаны гистопатологические изменения в печени, отмеченные в 10 in vivo испытаниях. Повреждения перечислены.

[14] РИС.6 - это ТАБЛИЦА, демонстрирующая результаты ROC-анализа для биомаркеров и современные стандарты для определенных патологий. В колонке 1 перечислены биомаркеры, в колонке 2 - их молекулярная природа, в колонке 3 - среды, в которых проводились измерения, и в колонке 4 - патологии, для которых проводился ROC-анализ. В колонке 5 представлены значения площади под кривой и стандартных ошибок для них. Колонка 6 показывает, возрастает (+) или снижается (-) значение уровня биомаркера при наличии соответствующей патологии. В колонках 7 и 8 указано число животных, участвовавших в соответствующем анализе. В колонке 11 представлены данные о соответствующей чувствительности при 95% специфичности (колонка 10), в колонке 9 - соответствующий порог для каждого биомаркера. Кроме исследованных биомаркеров, также показаны современные стандартные значения для уровня азота мочевины крови и сывороточного креатинина в случае 10 интересующих патологий. Эта ТАБЛИЦА отражает использование и достижения применения различных устройств, способов, диагностических тестов и диагностических наборов на основе перечисленных специфических биомаркеров при мониторинге почечных патологий.

[15] РИС.7 - это набор диаграмм разброса данных по оценке гепатотоксичности с использованием различных белковых биомаркеров. Биомаркеры получали из животных, на которых применялись плацебо или различные дозы гепатотоксичного АНИТ (альфа-нафтилизотиоцианата). В этом исследовании были обнаружены зависящие от дозы гистопатологические изменения в печени, но не в почках. На диаграммах показаны относительные концентрационные уровни (кратные изменения по отношению к уровню в контрольной группе). Уровни полученных доз представлены различными цветами точек, время получения образцов указано числовыми метками. Определяемые уровни биомаркеров хорошо коррелируют с полученной дозой, а потому и с зависящей от дозы гепатотоксичностью. Биомаркеры, представленные на данных графиках: уровень АЛТ в плазме (РИС.7А вверху), уровень липокалина-2 в плазме (РИС.7А внизу), уровень глутатион-S-трансферазы-мю в плазме (РИС.7Б вверху) и уровень липокалина-2 в моче (РИС.7Б внизу).

[16] РИС.8 - это набор диаграмм разброса данных по оценке повреждений почек с использованием различных белковых биомаркеров и клинико-химических параметров. Биомаркеры получали из животных, у которых применялись плацебо или различные дозы нефротоксичного цисплатина. На диаграммах показаны относительные концентрационные уровни (изменения по отношению к уровню в контрольной группе). Уровни полученных доз показаны как отметки на оси х, время получения образцов указано числовыми метками. Образцы помечены различными цветами в соответствии с наивысшей степенью гистопатологических изменений, обнаруженных в почках. Горизонтальная черта обозначает наивысший уровень биомаркера, обнаруженный в контрольной группе животных (группа, получавшая плацебо, без гистопатологических изменений в почках). Уровни выше этой черты значительно повышены (100% специфичность в испытании методом случай-контроль). Различные клинические параметры и белки определяют повреждения почек с различной степенью чувствительности. Измерение уровня креатинина в сыворотке крови, которое стандартно используется как периферический показатель повреждения почек и их функции, является наименее чувствительным методом (РИС.8А вверху). Измерение уровня цистатина С в плазме (РИС.8А внизу), уровня Kim-1 в моче (РИС.8Б вверху), уровня липокалина-2 в моче (РИС.8Б внизу), уровня остеопонтина в моче (РИС.8 В вверху) и уровня кластерина в моче (РИС.8В внизу) выявляет больше животных со значимыми изменениями в почках..

[17] РИС.9 - это набор диаграмм разброса данных по оценке повреждения почек с помощью уровня транскрипции различных генов в мРНК в почках. Биомаркеры получали из животных, на которых применялись плацебо или различные дозы нефротоксичного цисплатина. На диаграммах показаны уровни экспрессии (значения Ct против Polr2g). Уровни полученных доз показаны как отметки на оси х, время получения образцов указано числовыми метками. Образцы помечены различными цветами в соответствии с наивысшей степенью гистопатологических изменений, обнаруженных в почках. Горизонтальная черта показывает наивысший уровень экспрессии (наименьшее значение на диаграмме), обнаруженный в контрольной группе животных. Значения под чертой соответствуют значительному увеличению уровня экспрессии (100% специфичность для животных, не получавших дозы). Как уровень Kim-1 (РИС.9А), так и уровень Cyr61 (РИС.9Б) могут определять повреждение почек раньше (по истечении меньшего времени после начала процесса) и более чувствительным образом, чем гистопатологические обследование.

Детальное описание изобретения

[18] Определения. Используемые в этом документе определения "токсическое повреждение почек" или "повреждение почек" или, аналогично, "почечная недостаточность" или "дисфункция" следует понимать как ренальную или почечную недостаточность или дисфункцию внезапного (острого) характера или медленно прогрессирующую во времени (хроническую), которая может возникать в результате некоторых заболеваний или патологических процессов, включая (но не ограничиваясь) острое токсическое повреждение типа сепсиса (инфекции), шока, травмы, почечных камней, почечной инфекции, лекарственной токсичности, действия ядов или токсинов, неблагоприятного воздействия инъекции йодсодержащего контрастного вещества, а для хронического - длительную гипертонию, диабет, ишемическую болезнь сердца, волчанку или серповидноклеточную анемию. Обе формы почечной недостаточности приводят к угрожающим жизни нарушениям метаболических процессов.

[19] Определение "образцы" включает биопсии, в основном почек, и пробы жидкостей организма, таких как кровь, плазма, сыворотка крови, лимфа, ликвор, содержимое кист, асциты, моча, кал и желчь, но не ограничивается ими. Одним из преимуществ изобретения является то, что уровень каждого маркера может чрезвычайно хорошо определяться в жидкостях организма, таких как плазма крови или моча. Например, уровень экспрессии кластерина может хорошо определяться в плазме.

[20] Используемый здесь термин "индивидуум" означает человека, животное, такое как мышь или крыса, популяцию или группу особей.

[21] Используемый термин "потенциальный агент" или "потенциальное лекарство" означает природные или синтетические молекулы, такие как белки или их фрагменты, антитела, небольшие молекулы-ингибиторы или молекулы-агонисты, молекулы нуклеиновой кислоты, органические или неорганические соединения и тому подобное.

[22] Основные методы. При применении изобретения используются многие традиционные методы молекулярной биологии и микробиологии, а также рекомбинантные ДНК. Эти методы хорошо известны и описаны, например, в Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F.M.Ausubel ed.); Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, D.N.Glover ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. L. Gait ed. (1984); Hames & Higgins, Nucleic Acid Hybridization, (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins eds. (1984); Animal Cell Culture, R.I.Freshney ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes, (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, the series. Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.H.Miller & M.P.Calos eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1987); and Methods in Enzymology Vol.154 and Vol.155 (Wu & Grossman, and Wu, eds., respectively).

[23] Все упоминания документов, указанные здесь по любой теме, включены как ссылки, по которым возможно получение полной необходимой информации, как если бы каждая отдельная публикация, или патент, или заявка на патент были определенно и индивидуально описаны в данном документе. Например, все номера из GenBank, Unigen Cluster и кодовые номера белков, указанные здесь, дают возможность получить полную информацию так, как если бы информация по ним была указана в этом документе.

[24] Биомаркеры изобретения. Измерялись геномная и белковая экспрессия некоторых биомаркеров (перечислены в ТАБЛИЦАХ 1 и 2) в тканях почек. Также измерялись уровни соответствующего белка в моче и плазме крови. Были обнаружены корреляции между геномной или белковой экспрессией в тканях, концентрациями белка в моче и плазме, с одной стороны, и гистопатологией, параметрами анализа мочи, такими как протеинурия (ТАБЛИЦА 2), и клинико-химическими параметрами (см. ТАБЛИЦУ 2), такими как креатинин, азот мочевины крови (BUN) и коэффициент очищения, с другой стороны. Исследуемым вопросом было то, отражают ли почечные биомаркеры мочи повреждение почечных тканей и, возможно, функцию почек.

[25] В ТАБЛИЦЕ 1 представлен список биомаркеров, оцененных при помощи измерения уровня транскрипции (с использованием мРНК из печени или почек) и белкового уровня (в моче и крови). Измерение уровней этих биомаркеров из ТАБЛИЦЫ 1 описано ниже.

ТАБЛИЦА 1.1
Список биомаркеров, оцененных при помощи измерения уровня транскрипции и белкового уровня
Название	мРНК	Белок	Номер Swissprot	Символ гена
β-2-микроглобулин	нет	да	Р07151	B2m
N-ацетил-бета-глюкозаминидаза, Альфа-	нет	да	Q641X3	Гекса-
цепь бета-гексоаминидазы, Н-Ацетил-глюкозамин
Альфа-глутатион-8-трансфераза(альфа-ГСТ) / глутатион-3-трансфераза 5	да	да	Р46418	Gsta5
Кальбиндин d28	да	да	Р07171	Calb1
Кластерин	да	да	Р05371	Clu
Цистатин С	да	да	Р14841	Cst3
Цистеин-богатый белок 61 (CYR61)	да	да	Q9ES72	Cyr61
Эпидермальный фактор роста (ЭФР)	да	да	Р07522	Egf
Глутатион-8-трансфераза мю 1, ГСТ	да	да	Р04905	Gstm1
Yb1, мю-ГСТ
Повреждающая почки молекула-1,	да	да	054947	Haver1
Гомолог клеточного рецептора вируса				или Kim1
гепатита A, Kim-1
Нейтрофильный желатиназо-	да	да	Р30152	Lcn2
ассоциированный липокалин,
Липокалин 2
Остеопонтин, Секретируемый	да	да	Р08721	Spp1 или
фосфопротеин 1				2b7
Подоцин	да	да	Q8K4G9	Nphs2
Ингибитор металла протеиназ-1, TIMP-1	да	да	Р30120	Timp1
ФРЭС / Фактор роста эндотелия сосудов	да	да	Р16612	ФРЭС
А				[или] ФРЭС-А

[26] Среди биомаркеров изобретения имеются следующие:

[27] Кальбиндин D-28k - кальций-связывающий белок большого семейства белков EF-руки. Кальбиндин D-28k присутствует в организмах всех классов позвоночных во многих тканях. Некоторые исследователи показали, что наибольшие количества кальбиндина D-28k находятся в дистальных отделах канальцев, что коррелирует с ролью дистальных отделов канальцев в абсорбции кальция. Rhoten WB et al., Anat. Rec. 227:145-151; Borke JL et al., Am. J. Physiol. (Renal Fluid Electrolyte Physiol) 257: F842-F849 26 (1989). Более того, было показано, что снижение экспрессии кальбиндина D-28R с возрастом может способствовать возрастному снижению Са⁺⁺-транспорта в кишечник и почки. Armbrecht HJ et al., Endocrinology 125: 2950-2956 (1989). Индуцированное циклоспорином А снижение почечного кальбиндина D-28R у крыс является следствием снижения уровня его мРНК. Grenet О et al., Biochem. Pharmacol. 55(7): 1131-1133 (1998); Grenet O et al., Biochem. Pharmacol. 59(3): 267-272 (2000).

[28] Кластерин, также известный как сульфатированный гликопротеин-2 (TRPM-2), -это широко распространенный гликопротеин, секретируемый в различных органах, включая почки, при повреждении или изменениях в тканях. Он был обнаружен в трубчатых просветах эпителиальных каналов. Jenne DE & Tschopp J, Trends Biochem. Sci. 14: 154-159 (1992). Кластерин способен сохранять клеточные взаимодействия, которые иначе нарушаются в результате повреждений почек. Silkensen JR et al,, J. Am. Soc. Nephrol. 8(2); 302-305 (1997). Более того, циклоспорин А увеличивает уровень мРНК кластерина в почках крысы. Darby IA et al., Exp. Nephrol. 3(4): 234-239 (1995).

[29] Эпидермальный фактор роста (ЭФР) - это маленький полипептид, относящийся к классу веществ, вызывающих клеточный рост, дифференцировку и острофазные реакции. мРНК ЭФР транскрибируются преимущественно в клетках почек. При различных экспериментально вызванных формах острой почечной недостаточности уровни почечного ЭФР и его мРНК значительно снижались и оставались низкими в течение долгого времени. Price РМ et al., Am J Physiol. 268(4 Pt 2): F664-670 (1995). Более того, считается, что ЭФР играет главную роль в восстановлении почечных канальцев после ишемического повреждения почек (Di Paolo S, et al., Nephrol Dial Transplant 1: 2687-2693 (1997)) и в восстановлении почечных тканей после вызванного лекарственными препаратами нефротоксического повреждения.(Моrin NJ et al., Am. J. Physiol. 263: F806-F811 (1992). Было показано значительное снижение уровней экспрессии ЭФР у пациентов, страдающих от хронического отторжения после почечной трансплантации или вызванной лекарствами нефротоксичности. Кроме того, было показано снижение уровня экспрессии ЭФР в почках после применения циклоспорина A. Deng JT et al., Transplant Proc. 26(5): 2842-2844; Yang CW, et al., Kindey Int. 60: 847-857 (2001).

[30] Повреждающая почки молекула-1 (Kim-1) относится к мембранным белкам первого типа и включает внеклеточный иммуноглобулиновый домен из шести цистеинов. Уровень экспрессии Kim-1 и его мРНК очень низкий, практически не выявляемый при нормальном состоянии почек, однако он резко возрастает в проксимальных отделах канальцев пост-ишемической почки. Kim-1 участвует в восстановлении морфологической целостности и функционирования почек после ишемического поражения. Ichimura Т et al., J. Biol. Chem. 273: 4135-4142 (1998). Kim-1 иногда описывается как "Havcrl". Ранняя и интенсивная канальцевая экспрессия, которая следует за повреждениями различных типов, делает Kim-1 специфическим маркером повреждения клеток канальцев, которое может быть связано с восстановительными или повреждающими механизмами, управляющими процессом интерстициального поражения. См. включенную в документ ссылку на WO 2004/005544.

[31] Альфа-2u глобулин-связанный белок (Альфа-2u), также известный как липокалин-2 или нейтрофильный желатиназо-ассоциированный липокалин, у человека находится в гранулах нейтрофилов. Он связывается с небольшими липофильными субстанциями и, как считается, играет роль в развитии воспалительного процесса. Bundgaard JR et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 202: 1468-1475 (1994); Cowland JB & Borregaard N, Genomics 45: 17-23 (1997); Zerega В et al., Eur. J. Cell Biol. 79(165): 172-2000 (2000).

[32] Остеопонтин, также известный как секретируемый фосфопротеин 1, содержит высокое количество кислых групп, является высокогликозилированным фосфопротеином, содержащим мотив клеточной адгезии "аргинин-глицин-аспарагиновая кислота". Положительная регуляция остеопонтина была показана в некоторых моделях почечного повреждения, что позволяет предположить его возможную роль в процессах изменения и восстановления тканей. Persy VP et al., Kidney Int. 56(2): 601-611 (1999). Также было обнаружено, что остеопонтин является основным компонентом кальциевых оксалатных почечных камней. Kohri К et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 84: 859-864 (1992). Более того, наблюдается высокая экспрессия остеопонтина в клетках дистальных отделов канальцев крыс, склонных к образованию почечных камней. Kohri К et al., Biochem. Biol. Chem. 26S: 15180-15184 (1993).

[33] Подоцин, также известный как PDCN, SRN1, белок нефроза 2, идиопатический белок, является протеином, экспрессируемым в подоцитах почек, который играет роль в регуляции гломерулярной проницаемости. Этот белок экпрессируется практически исключительно в подоцитах гломерул плода и взрослого организма. Мутации в белках подоцитов, например в подоцине, вызывают врожденный фокальный сегментарный гломерулосклероз (Komatsuda A et al., Ren. Fail. 25(1): 87-93 (2003)), и вовлечен, главным образом, в развитие стероид-устойчивого нефротического синдрома.

[34] Фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) индуцирует ангиогенез, увеличивает проницаемость сосудов, служит хемотаксическим веществом для моноцитов и играет роль в протекании диабета, заживлении ран, воспалительных реакциях и изменениях в тканях. Benjamin LE, Am J Pathol. 158: 1181-1184 (2001).

[35] Так как каждый маркер можно связать с определенными патологическими изменениями в почках, существует возможность определить продукты экспрессии генов таких маркеров, которые сами связаны с почечной патологией. Например, уровень кальбиндина-D28k используется как ранний маркер нарушения обмена кальция в почках, предсказывающий развитие кальциноза. Уровень белка Kim-1 является маркером генерализованного инсульта почки. Уровень остеопонтина является ранним маркером инфильтрации макрофагами, что часто бывает связано с почечной токсичностью, а также маркером перестроек в тканях после повреждения почек. Уровень ЭФР является ранним маркером генерализованного токсического повреждения почек. Уровень кластерина является ранним маркером иммунно-опосредованного токсического повреждения почек.

[36] В ТАБЛИЦЕ 2 представлен список параметров клинико-химических анализов мочи и крови. Измерения уровней этих биомаркеров из ТАБЛИЦЫ 2 описаны ниже.

ТАБЛИЦА 2
Список клинико-химических параметров
Параметры мочи	Параметры крови
Кальций (Са++)	Альбумин (ALB)
Хлорид (Cl-)	Соотношение альбумин/глобулин (A/G)
Креатинин (CREAT)	Щелочная фосфатаза (ALP)
Очищение креатинина (CLEAR)	Аланиновая аминотрансфераза (ALAT)
Неорганический фосфор (I.PHOS)	Аспартат-аминотрансфераза (ASAT)
Лактат-дегидрогеназа (LDH)	Кальций (Са++)
Магний (Mg++)	Хлорид (Cl-)
Калий (К+)	Креатинин (CREAT)
Натрий (Na+)	Глюкоза (GLUC)
Удельный вес (SP.GRAV)	Неорганический фосфор (I.PHOS)
Общий белок (PROT)	Лактат-дегидрогеназа (LDH)
Мочевина (UREA)	Магний (MAGN)
Объем (VOLUME)	Калий (К+)
Цвет (COLOR)	Натрий (Na+)
Проявление (АРР)	Общий билирубин (ТОТ.Вт)
	Общий холестерин (CHOL)
	Общий белок (PROT)
	Триглицериды (TRIG)
	Мочевина (UREA)

[37] Результаты исследований in vivo и гистопатологических исследований. Все 10 испытаний in vivo на крысах были успешно проведены. Достаточное количество мочи было собрано практически от всех животных в конце дней 3, 7, 14, 21 и 22. Только животные, для которых были доступны полные наборы данных (данные гистопатологического исследования почек, клинико-химического анализа мочи, данные о выделении белковых биомаркеров с мочой, клинико-химического анализа крови, о содержании белковых биомаркеров в плазме крови, содержании мРНК-биомаркеров в почках), участвовали в анализе и описаны здесь. В целом, были проанализированы данные по 739 животным, в том числе по 447, у которых применялись нефротоксины, по 104, у которых применялись гепатотоксины, и по 188, которые получали плацебо. Для 9 проб не были доступны данные об уровне Kim-1 в моче, для 84 - данные об уровне Kim-1 в крови. Эти пробы не были включены в анализ данных по Kim-1, но были включены в анализ по другим параметрам и биомаркерам.

[38] На РИС.2 показано распределение по степеням гистопатологических изменений. Преобладание изменений степени 1 и степени 2, как и отсутствие изменений степени 5, указывают на то, что цель вызвать, в основном, умеренное токсическое повреждение почек была достигнута. Обнаружение значительного количества изменений степени 1 и некоторого количества изменений степени 2 у животных, которым было назначено применение гепатотоксинов или плацебо, указывает на уровень чувствительности гистопатологической оценки, примененной в этом проекте. Не было случаев существенного проявления дозозависимой нефротоксичности при применении гепатотоксинов. На РИС.3 представлен детальный список обнаруженных локализованных повреждений, в том числе количество наблюдений каждой степени изменений отдельно для группы животных, получавших нефротоксины, и контрольной группы (животные, получавшие плацебо и гепатотоксины). Было обнаружено 75 локализованных изменений.

[39] Различные типы повреждений наблюдались обычно не изолированно, а группами с высокой корреляцией, отражающими протекание различных молекулярных процессов. На РИС.4 показаны все гистопатологические изменения, обнаруженные в исследовании применения цисплатина. Протекавшие процессы затрагивали не отдельные изолированные сегменты нефрона, а несколько сегментов коррелируемым образом (например, проксимальные отделы канальцев и нисходящие прямые отделы канальцев). Кроме того, прослеживается логическая последовательность протекающих молекулярных процессов при распределении животных по времени исследования и полученной дозе препарата. Сначала наблюдается некроз как следствие повреждения, после чего наблюдаются регенерационные процессы, такие как базофилия и митоз, а параллельно развиваются вторичные процессы (такие как увеличение канальцев, дилатация канальцев, отторжение некротических масс и т.п..).

[40] Существуют два условия использования конкретного биомаркера. Во-первых, необходимо иметь достаточное количество данных, по которым можно судить о его локализованности, которая лучше всего коррелирует с уровнем экспрессии биомаркера. Во-вторых, отдельные виды гистопатологических изменений необходимо связать с протеканием определенных молекулярных процессов, вызывающих изменения уровня экспрессии биомаркера. Поэтому в данном исследовании локализованные повреждения были связаны с протеканием 10 различных процессов, в результате чего для каждого образца наибольшая степень соответствующего локализованного повреждения связывалась с определенным патологическим процессом. В частности, были исследованы следующие 10 патологических процессов:

[41] 1. Повреждение проксимальных отделов канальцев: повреждения степени 1 ("минимальные", "единичные", "небольшие") или более высокой степени типа "некроз", "апоптоз" или "отторжение клеток канальцев", локализованные в любом из сегментов канальца S1, S2 или S3 либо нелокализуемые.

[42] 2. Гломерулярные изменения/повреждения: повреждения степени 1 ("минимальные", "единичные", "небольшие") или более высокой степени типа "пролиферация мезангиальных клеток", "увеличение мезангиальных клеток", "гломерулярная вакуолизация" или "интерстициальный фиброз капсулы Боумена".

[43] 3. Повреждение/регенерация/дилатация канальцев: повреждения степени 1 ("минимальные", "единичные", "небольшие") или более высокой степени типа "некроз", "апоптоз", "отторжение клеток канальцев", "базофилия" или "усиление митоза", локализованные в любом из сегментов канальцев S1, S2, S3, петле Генле, толстых восходящих отделах канальцев, дистальных отделах канальцев или собирающих канальцах либо нелокализуемые, "дилатация канальцев" в коре, мозговом слое или папилле почек.

[44] 4. Гломерулярные изменения/повреждения или повреждение/регенерация/дилатация канальцев: повреждения степени 1 ("минимальные", "единичные", "небольшие") или более высокой степени типа "пролиферация мезангиальных клеток", "увеличение мезангиальных клеток", "гломерулярная вакуолизация" или "интерстициальный фиброз капсулы Боумена" или типа "некроз", "апоптоз", "отторжение клеток канальцев", "базофилия" или "усиление митоза", локализованные в сегментах канальцев S1, S2, S3, петле Генле, толстых восходящих отделах канальцев, дистальных отделах канальцев или собирающих канальцах либо нелокализуемые, или "дилатация канальцев" в коре, мозговом слое или папилле почек.

[45] 5. Повреждение/регенерация толстых восходящих отделов канальцев: повреждения степени 1 ("минимальные", "единичные", "небольшие") или более высокой степени типа "некроз", "апоптоз", "базофилия" или "усиление митоза", локализованные в толстых восходящих отделах канальцев.

[46] 6. Повреждение/регенерация дистальных отделов канальцев: повреждения степени 1 ("минимальные", "единичные", "небольшие") или более высокой степени типа "некроз", "базофилия" или "усиление митоза", локализованные в дистальных отделах канальцев.

[47] 7. Повреждение/регенерация собирающих канальцев: повреждения степени 1 ("минимальные", "единичные", "небольшие") или более высокой степени типа "некроз", "апоптоз", "отторжение клеток канальцев" или "базофилия", локализованные в собирающих канальцах.

[48] 8. Минерализация канальцев: повреждения степени 1 ("минимальные", "единичные", "небольшие") или более высокой степени типа "интратубулярные включения - минерализация", локализованные в любом из сегментов канальцев S1, S2, S3, петле Генле, толстых восходящих отделах канальцев, дистальных отделах канальцев или собирающих канальцах.

[49] 9. Межканальцевые гиалиновые цилиндры: Повреждения степени 1 ("минимальные", "одиночные", "небольшие") или выше, типа "межканальцевые цилиндры - гиалин (белковый, пигментированный)", локализованные в каком-либо из канальцевых сегментов S1, S2, S3, в петле Генли, толстых восходящих отделах, дистальных канальцах или собирающих трубках.

[50] 10. Гипертрофия юкстагломерулярного аппарата: Патологии, наблюдаемые в 10 исследованиях печени животных, показаны на РИС. 5.

[51] Описание метода анализа. Протеиновые биомаркеры определялись с помощью проверенных мультиплексных методов анализа белков, разработанных и предоставляемых компанией RulesBasedMedicine (Техас, США). Клинические химические показатели (например, азот мочевины крови, н-ацетил-глюкозамин, креатинин и ЛДГ) измерялись с помощью стандартных методов клинико-химического анализа (прибор ADVIA 1650). Биомаркеры мРНК измерялись с помощью методов генной экспрессии TaqMan фирмы Applied Biosystems в матрицах низкой плотности на приборе для ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems 7900HT). мРНК была получена из половины почки с использованием стандартных методов.

[52] Описание предварительной обработки данных. Значения концентраций биомаркеров, полученные аналитическими устройствами, были предварительно обработаны в следующем порядке: (1) значения концентраций выше предельного значения количественного определения заменяются верхними предельными значениями количественного определения; (2) значения концентраций ниже предельного значения количественного определения заменяются нижними предельными значениями количественного определения; (3) биомаркеры в моче приводятся к концентрации креатинина в моче делением для каждого образца на соответствующее значение креатинина в моче; и (4) для выражения данных в виде кратных изменений, каждое значение делилось на среднее арифметическое для контрольной группы с одинаковым временем и методом исследования (обычно из 6 животных).

[53] Описание анализа данных. Все количественные анализы данных были основаны на анализе рабочих характеристик приемника (ROC). При ROC-анализе порог принятия решения систематически изменялся для проблемы альтернативных решений (например, соотношение контрольных и больных животных), и истинно положительные значения (чувствительность) были представлены как функция истинно отрицательных значений (1-специфичность). Площадь под кривой (AUC) является мерой диагностической силы, объединяющей чувствительность и специфичность в одном значении, при котором случайный дискриминатор соответствует AUC 0,5, а идеальный дискриминатор - 1. Расчет AUC проводился с использованием численного интегрирования по формуле трапеций, описанного Bradley АР, Pat. Recogn. 30 (7): 1145-1159 (1997). Стандартная погрешность для AUC была рассчитана на основании стандартной погрешности статистики Уилкоксона, описанной Bradley (1997).

[54] В качестве примера применения ROC-анализа для данного биомаркера и патологии порог для биомаркера / патологии для заранее заданного минимального значения специфичности был установлен следующим образом:

[55] Для данной минимальной специфичности (например, 95%) сначала определяется наименьшая точная специфичность при минимальном значении специфичности или выше этого значения. Для этой точной специфичности выбирается порог с наибольшей соответствующей чувствительностью. Алгоритм не выполняет проверку, если возможны более высокие значения специфичности для данной чувствительности при дальнейшем изменении порога. Для этого порога здесь приводятся соответствующие специфичность и чувствительность.

[56] При анализе данных были использованы следующие определения для контрольных животных и заболевших животных: (а) Контрольная группа: Животные, которым ввели плацебо или гепатотоксиканты и для которых изучаемые повреждения не были обнаружены. (b) Заболевшая группа: Животные, которым ввели нефротоксиканты и повреждениям которых была присвоена как минимум степень 1 при гистопатологической оценке.

[57] Животные, которым ввели гепатотоксиканты, были включены в контрольную группу для тестирования зависимости специфичности маркеров от других гепатотоксических изменений и благодаря тому, что в этих исследованиях не было отмечено зависимости нефротоксичности от дозы.

[58] Животные, которым ввели дозу, но которые не получили никаких повреждений или получили только другие повреждения (не те, которые представляли интерес для данного гистопатологического исследования), были исключены из ROC, принимая во внимание, что такие животные не являлись "чистыми". Эта группа животных находится в неопределенном состоянии, особенно в том случае, когда ответная реакция на молекулярном уровне наступает раньше и быстрее, чем гистопатологические проявления. В таком случае невозможно определить, (1) что отдельный гистопатологический срез одной почки не представителен для общего состояния почки (ложная отрицательная гистопатология); (2) что ответная реакция на молекулярном уровне является боле ранней/более чувствительной, чем гистопатология, так называемое продромальное состояние; или (3) что животные являются ложноположительными, если гистопатология - единственный установленный факт (ложный положительный биомаркер). Наиболее консервативным способом обращения с такими животными является исключение их из какого-либо анализа, поскольку их невозможно однозначно причислить ни к одной из групп.

[59] Результаты для исследуемых биомаркеров и патологий при наблюдении за повреждениями почек. Результаты ROC-анализа, включающие гистопатологию, информацию об исследовании и значения биомаркеров для представляющих наибольший интерес почечных патологий и биомаркеров, показаны на ФИГ.6.

[60] Протеины и клинические химические показатели для наблюдения и установления повреждений печени. Биомаркеры были получены из животных, которым вводились плацебо или различные концентрации гепатотоксиканта ANIT (альфа-нафтилизотиоцианата). См. РИС.7. Показатели гистопатологии, зависящие от дозы, наблюдались в печени, но не наблюдались в почках. На графиках показаны уровни отплацебных концентраций (зависимость кратных изменений от числа контрольных животных). Уровни доз представлены разными цветовыми оттенками, моменты взятия образцов обозначены метками. Уровни биомаркеров хорошо коррелируют с дозами, а значит и с зависящей от дозы гепатотоксичностью. Биомаркеры, представленные на этих графиках, представляют собой действующую стандартную аланин-аминотрансферазу, определенную в плазме (РИС.7А вверху), и новые маркеры липокалина-2, определенные в плазме (РИС.7А внизу), GST-мю, определенный в плазме (РИС.7В вверху), и липокалин-2, определенный в моче (РИС.7В внизу).

[61] Протеины и клинико-химические показатели для наблюдения и установления повреждений почек. Б