Выбор лекарственных средств для терапии рака легких с помощью матриц на основе антител

Выбор лекарственных средств для терапии рака легких с помощью матриц на основе антител

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка претендует на приоритет Предварительной патентной заявки США №60/949,820, поданной 13 июля 2007 г., содержание которой включено в настоящее изобретение путем отсылки во всей полноте для всех целей.

Уровень техники

Процесс передачи сигналов в клетках отвечает за целый ряд биологических функций, включая деление и смерть клеток, метаболизм, активацию иммунных клеток, нейротрансмиссию и чувственное восприятие, если ограничиться лишь несколькими. Соответственно, нарушения нормальной передачи сигналов в клетках может вызвать ряд заболеваний, как то диабет, сердечные заболевания, аутоиммунные заболевания и рак.

Одним из хорошо изученных путей передачи сигналов является МАР-киназный путь, который отвечает за передачу сигналов от фактора роста эпидермиса (EGF) до стимуляции пролиферации клеток (см. фиг.1). EGF связывается с тирозинкиназой, связанной с трансмембранным рецептором - рецептором фактора роста эпидермиса (EGFR), который активируется при связывании EGF. Связывание EGF с EGFR активирует тирозинкиназную активность цитоплазматического домена рецептора. Одним из последствий активации этой киназы является аутофосфорилирование EGFR по остаткам тирозина. Фосфорилированные остатки тирозина на активированном EGFR образуют посадочное место для связывания содержащих домен SH2 адаптерных белков типа GRB2. При функционировании в качестве адаптера GRB2 еще связывается и с фактором обмена гуаниновых нуклеотидов SOS посредством домена SH3 на GRB2. Образование комплекса EGFR-GRB2-SOS приводит к активации фактора обмена гуаниновых нуклеотидов SOS, который вызывает удаление GDP из Ras. После удаления GDP Ras связывает GTP и активируется.

После активации Ras связывается с и активирует протеинкиназную активность RAF-киназы - серин/треонин-специфичной протеинкиназы. После этого происходит активация протеинкиназного каскада, ведущая к пролиферации клеток. В общих чертах, RAF-киназа затем фосфорилирует и активирует МЕК, другую сериновую/треониновую киназу. Активированная МЕК фосфорилирует и активирует митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК). В число мишеней для дальнейшего фосфорилирования МАРК входит киназа 40S-рибосомного белка S6 (RSK). Фосфорилирование RSK под действием МАРК вызывает активацию RSK, которая в свою очередь фосфорилирует рибосомный белок S6. Другой известной мишенью МАРК является протоонкоген с-Мус-ген, важный для пролиферации клеток, который подвергается мутации при различных раковых заболеваниях. МАРК также фосфорилирует и активирует еще одну протеинкиназу - MNK, которая в свою очередь фосфорилирует фактор транскрипции CREB. Косвенным образом МАРК также регулирует транскрипцию гена Fos, кодирующего другой фактор транскрипции, участвующий в пролиферации клеток. Путем изменения уровня и активности таких факторов транскрипции МАРК переводит исходный внеклеточный сигнал от EGF в изменение транскрипции генов, важных для прохождения клеточного цикла.

Учитывая, что пути передачи сигналов играют ключевую роль в развитии клеток, не удивительно, что многие раковые заболевания возникают в результате мутаций и других изменений компонентов передачи сигналов, что ведет к аномальной активации путей пролиферации клеток. Например, суперэкспрессия или гиперактивность EGFR связывают с рядом раковых заболеваний, включая мультиформную глиобластому, рак толстой кишки и рак легких. Это привело к разработке средств противораковой терапии, направленных против EGFR, включая гефитиниб и эрлотиниб при раке легких и цетуксимаб при раке толстой кишки.

Цетуксимаб является примером моноклонального антитела-ингибитора, который связывается с внеклеточным доменом связывания лигандов EGFR, предотвращая тем самым связывание лигандов, активирующих тирозинкиназу EGFR. Напротив, гефитиниб и эрлотиниб представляют собой небольшие молекулы, которые ингибируют имеющую внутриклеточную локализацию тирозинкиназу EGFR. В отсутствие активности киназы EGFR не может подвергаться аутофосфорилированию по остаткам тирозина, что является предпосылкой для связывания нижележащих адаптерных белков типа GRB2. При торможении сигнального каскада в клетках, зависящих от этого пути для роста, уменьшается пролиферация и миграция опухолей.

Кроме того, другие исследования показали, что у человека около 70% меланом и меньшая доля других опухолей содержат точечную мутацию (V599E) гена Raf, которая ведет к постоянной активации пути МАРК (например, см. Davies et al., Nature, 417:949-954 (2002)). Такие результаты свидетельствуют, что мутации в определенных путях передачи сигналов могут быть характерными для определенных типов опухолей, и такие специфически измененные пути передачи сигналов могут оказаться перспективной мишенью для химиотерапевтического вмешательства.

Учитывая, что различные способы лечения рака, в частности химиотерапия рака, могут функционировать, прямо или косвенно, путем блокирования либо активации клеточных путей передачи сигналов, участвующих в пролиферации или гибели клеток, соответственно, активность данного пути передачи сигналов при определенной форме рака может служить хорошим индикатором эффективности различных способов лечения рака. Соответственно, наряду с выполнением других потребностей, настоящим изобретением предусмотрен способ оценки эффективности потенциальной противораковой терапии для индивидуального пациента. При этом настоящим изобретением предусмотрены способы, помогающие врачу выбрать подходящую противораковую терапию в надлежащей дозировке и в надлежащее время для каждого пациента.

Раскрытие изобретения

Настоящим изобретением предусмотрены композиции и способы детектирования активационных состояний компонентов путей передачи сигналов в раковых клетках (например, циркулирующих клетках опухоли легких). Информация об активационных состояниях компонентов путей передачи сигналов, полученная с применением изобретения, может использоваться для диагностики, прогнозирования рака и при разработке способов лечения рака.

В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ выбора подходящего противоракового лекарственного средства для лечения рака легких, который включает:

(a) выделение клеток опухоли легких после введения противоракового лекарственного средства или до инкубации с противораковым лекарственным средством;

(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;

(c) детектирование активационного состояния одного или более анализируемых веществ в клеточном экстракте методом анализа, включающим несколько серийных разведений захватывающих антител, специфичных к одному или более анализируемым веществам, при этом захватывающие антитела фиксируются на твердой подложке; и

(d) определение того, подходит или не подходит это противораковое лекарственное средство для лечения рака легких путем сравнения активационного состояния, обнаруженного у одного или более анализируемых веществ, со стандартным активационным профилем, полученным в отсутствие противоракового лекарственного средства.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ выбора субъекта, страдающего раком легких, который будет подходящим кандидатом для лечения с помощью противоракового лекарственного средства, который включает:

(а) выделение клеток опухоли легких после введения противоракового лекарственного средства или до инкубации с противораковым лекарственным средством;

(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;

(c) детектирование активационного состояния одного или более анализируемых веществ в клеточном экстракте методом анализа, включающим несколько серийных разведений захватывающих антител, специфичных к одному или более анализируемых веществ, при этом захватывающие антитела фиксируются на твердой подложке; и

(d) определение того, подходит или не подходит данный субъект для лечения рака легких с помощью этого противоракового лекарственного средства путем сравнения активационного состояния, обнаруженного у одного или более анализируемых веществ, со стандартным активационным профилем, полученным в отсутствие противоракового лекарственного средства.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ идентифицирования реакции опухоли легких на лечение с помощью противоракового лекарственного средства, который включает:

(a) выделение клеток опухоли легких после введения противоракового лекарственного средства или до инкубации с противораковым лекарственным средством;

(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;

(c) детектирование активационного состояния одного или более анализируемых веществ в клеточном экстракте методом анализа, включающим несколько серийных разведений захватывающих антител, специфичных к одному или более анализируемых веществ, при этом захватывающие антитела фиксируются на твердой подложке; и

(d) идентификацию данной опухоли легких как реагирующей или не реагирующей на лечение с помощью этого противоракового лекарственного средства путем сравнения активационного состояния, обнаруженного у одного или более анализируемых веществ, со стандартным активационным профилем, полученным в отсутствие противоракового лекарственного средства.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ прогнозирования реакции субъекта, страдающего раком легких, на лечение с помощью противоракового лекарственного средства, который включает:

(a) выделение клеток опухоли легких после введения противоракового лекарственного средства или до инкубации с противораковым лекарственным средством;

(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;

(c) детектирование активационного состояния одного или более анализируемых веществ в клеточном экстракте методом анализа, включающим несколько серийных разведений захватывающих антител, специфичных к одному или более анализируемых веществ, при этом захватывающие антитела фиксируются на твердой подложке; и

(d) прогнозирование вероятности того, что субъект будет реагировать на лечение с помощью этого противоракового лекарственного средства путем сравнения активационного состояния, обнаруженного у одного или более анализируемых веществ, со стандартным активационным профилем, полученным в отсутствие противоракового лекарственного средства.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ прогнозирования исхода болезни у субъекта, страдающего раком легких, при лечении с помощью противоракового лекарственного средства, который включает:

(a) выделение клеток опухоли легких после введения противоракового лекарственного средства или до инкубации с противораковым лекарственным средством;

(b) лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта;

(c) детектирование активационного состояния одного или более анализируемых веществ в клеточном экстракте методом анализа, включающим несколько серийных разведений захватывающих антител, специфичных к одному или более анализируемых веществ, при этом захватывающие антитела фиксируются на твердой подложке; и

(d) прогнозирование исхода болезни у субъекта, получающего это противораковое лекарственное средство, путем сравнения активационного состояния, обнаруженного у одного или более анализируемых веществ, со стандартным активационным профилем, полученным в отсутствие противоракового лекарственного средства.

В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрена матрица, обладающая превосходным динамическим диапазоном, которая включает несколько серийных разведений захватывающих антител, фиксированных на твердой подложке, причем захватывающие антитела в каждом серийном разведении специфичны к одному или нескольким анализируемым веществам, которые соответствуют компонентам пути передачи сигналов в клеточном экстракте.

Другие задачи, особенности и преимущества настоящего изобретения станут понятными специалистам в этой области из следующего подробного описания и фигур.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлен пример пути передачи сигналов, участвующего в пролиферации клеток, который может использоваться при практическом применении изобретения. Представлены компоненты пути EGFR/MAPK/ERK, который используется клетками для преобразования митогенного сигнала в пролиферацию клеток.

На фиг.2 представлена схема применения адресуемых матриц по изобретению для отбора лекарственных средств в ходе лечения рака.

На фиг.3 представлен схематический пример адресуемой матрицы, содержащей разведения антител к компонентам пути рецепторных тирозинкиназ, таких как компоненты пути EGFR/MAPK/ERK.

На фиг.4 представлен схематический пример адресуемой матрицы, содержащей разведения антител к компонентам путей передачи сигналов, активируемым при ангиогенезе опухолей.

На фиг.5А-В представлено определение числа клеток СТС при помощи системы Veridex CellSearch у пациента 2002 (А) и у пациента 2015 (В).

Осуществление изобретения

I. Введение

Как описано выше, активация путей передачи сигналов, участвующих в пролиферации клеток, и дезактивация путей, участвующих в клеточной смерти, являются отдельными примерами молекулярных процессов, характерных для многих разных типов рака. Во многих случаях активность определенных путей передачи сигналов и их компонентов может служить молекулярной сигнатурой данного типа рака. К тому же такие активированные компоненты могут служить полезными мишенями для терапевтического вмешательства. Соответственно, знание уровня активности определенной системы передачи сигналов в раковых клетках до, во время и после обработки дает врачу очень важную информацию, которая может использоваться для выбора надлежащего курса лечения. Более того, непрерывное наблюдение за путями передачи сигналов, действующими в раковых клетках, по ходу лечения может дать врачу дополнительную информацию об эффективности лечения, побуждающую его либо продолжить определенный курс лечения, либо перейти к другому способу лечения, если, к примеру, раковые клетки стали устойчивыми к лечению из-за дальнейших отклонений, активирующих тот же самый либо другой путь передачи сигналов.

Соответственно, настоящим изобретением предусмотрены способы и композиции для детектирования экспрессии и активационных состояний нескольких разрегулированных молекул передачи сигналов в опухолевой ткани или внеопухолевых клетках типа редких циркулирующих клеток солидной опухоли специфическим, мультиплексным, высокопроизводительным методом. Изобретением также предусмотрены способы и композиции для выбора надлежащей терапии (монотерапии или комбинированной терапии) для понижающей регуляции или отключения разрегулированного сигнального пути. Таким образом, изобретение может применяться для облегчения разработки индивидуализированной терапии для раковых пациентов.

Важным преимуществом настоящего изобретения является способность детектировать и идентифицировать раковые клетки в кровотоке посредством определения активности путей передачи сигналов на уровне одиночных клеток. Раковые клетки часто обнаруживаются в крови пациентов на различных ранних стадиях рака в виде "микрометастазов" (рассеянных раковых клеток), а также обнаруживаются в раковых метастазах. Количество раковых клеток в крови зависит от стадии и типа опухоли. Как правило, биопсия проводится на первичных опухолях, но не затрагивает большинство метастатических опухолей, что сильно затрудняет молекулярный анализ таких образцов опухолей. При метастазировании наиболее агрессивные раковые клетки выходят из первичной опухоли и проходят через кровь и лимфатическую систему, достигая удаленных мест. Таким образом, циркулирующие раковые клетки в крови составляют наиболее агрессивную и однородную популяцию раковых клеток. Однако количество метастатических раковых клеток в крови зачастую бывает очень низким, от одной до нескольких тысяч клеток на мл крови. Одной из целей настоящего изобретения является способность выделять и определять пути передачи сигналов в таких редких клетках и применять эту информацию к более эффективным способам лечения рака.

В некоторых воплощениях мультиплексный, высокопроизводительный способ иммуноанализа по настоящему изобретению способен детектировать уровень активации одной или нескольких молекул передачи сигналов в циркулирующих клетках солидной опухоли на уровне одиночных клеток. Фактически такие молекулы передачи сигналов, как EGFR, можно детектировать с чувствительностью в 100 зептомоль и линейным динамическим диапазоном от 100 зептомоль до 100 фемтомоль. При этом одноклеточное детектирование активационных состояний множественных передатчиков сигналов в редких циркулирующих клетках способствует прогнозированию и диагностике рака, а также разработке индивидуализированных, адресных способов терапии.

Редкие циркулирующие клетки включают клетки солидной опухоли, которые дали метастазы либо микрометастазы из солидной опухоли. Циркулирующие опухолевые клетки, раковые стволовые клетки и клетки, мигрирующие к опухоли (например, вследствие химического привлечения), как то циркулирующие предшественники эндотелиальных клеток, циркулирующие эндотелиальные клетки, циркулирующие проангиогенные миелоидные клетки и циркулирующие дендритные клетки - вот некоторые примеры циркулирующих клеток, связанных с солидными опухолями.

Представляющие интерес молекулы передачи сигналов, как правило, экстрагируют вскоре после выделения циркулирующих клеток, чтобы сохранить их активационное состояние in situ, предпочтительно в пределах 24, 6 или 1 часа, более предпочтительно в пределах 30, 15 или 5 минут. Выделенные клетки также можно инкубировать с одним или несколькими факторами роста, обычно в наномолярных или микромолярных концентрациях, в течение 1-30 минут, чтобы реанимировать или стимулировать активацию молекул передачи сигналов (например, см. Irish et al., Cell, 118:217-228 (2004)).

Как изложено более подробно в настоящем изобретении, для оценки потенциальной противораковой терапии для индивидуального пациента можно инкубировать выделенные клетки с одним или несколькими противораковыми лекарственными средствами в различных дозах. Затем можно провести стимуляцию фактором роста в течение короткого времени (например, 1-5 мин) или нескольких часов (например, 1-6 ч). Дифференциальная активация сигнальных путей в присутствии или в отсутствие противораковых лекарственных средств может способствовать выбору подходящей противораковой терапии в надлежащей дозе для каждого индивидуального пациента. Также можно выделить циркулирующие клетки из образца пациента во время лечения противораковым лекарственным средством и стимулировать их одним или несколькими факторами роста, чтобы определить, нужно ли сделать изменения в терапии. При этом способы настоящего изобретения будут способствовать клиницистам в выборе надлежащего противоракового лекарственного средства в надлежащей дозе в подходящее время для каждого пациента.

II. Определения

В настоящем изобретении следующие термины имеют приданные им значения, если не указано иначе.

Термин "рак" служит для обозначения любых представителей класса заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом аномальных клеток. Термин охватывает все известные раковые и неопластические заболевания, которые характеризуются как злокачественные, доброкачественные, мягких тканей или солидных, и все стадии и степени рака, в том числе до и после метастазирования. Примеры различных типов рака включают рак легких (например, немелкоклеточный рак легких); рак пищеварительной системы и желудочно-кишечного тракта, как то рак толстого кишечника, желудочно-кишечные опухоли стромы, желудочно-кишечные карциноидные опухоли, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак заднего прохода, рак желчных протоков, рак тонкого кишечника, рак желудка; рак пищевода; рак желчного пузыря; рак печени; рак поджелудочной железы; рак аппендикса; рак молочной железы; рак яичников; рак почек (например, почечноклеточная карцинома); рак центральной нервной системы; рак кожи; лимфома; хориокарцинома; рак головы и шеи; остеогенная саркома; и рак крови. В настоящем изобретении "опухоль" включает одну или несколько раковых клеток. В предпочтительном воплощении легочная опухоль происходит из субъекта с немелкоклеточным раком легких, таким, к примеру, как плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома, крупноклеточная карцинома, бронхоальвеолярная карцинома (ВАС) или овсяноклеточная карцинома.

Термин "анализируемое вещество" обозначает любую представляющую интерес молекулу, как правило, макромолекулу типа полипептида, присутствие, содержание и/или идентичность которой подвергается определению. В некоторых случаях анализируемое вещество представляет собой клеточный компонент циркулирующих клеток солидной опухоли, предпочтительно молекулу передачи сигналов.

В настоящем изобретении термин "ряд разведений" служит для обозначения ряда понижающихся концентраций определенного образца (например, лизата клеток) или реагента (например, антител). Ряд разведений обычно получают при смешивании отмеренного количества образца или реагента в исходной концентрации с разбавителем (например, разбавляющим буфером), получая меньшую концентрацию образца или реагента и повторяя этот процесс достаточное количество раз для получения требуемого числа серийных разведений. Образец или реагент может подвергаться серийному разведению по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500 или 1000 раз, образуя ряд разведений, содержащий по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 понижающихся концентраций образца или реагента. Например, ряд разведений, содержащий 2-кратные серийные разведения реагента для захватывающих антител при исходной концентрации 1 мг/мл, может быть получен при смешивании одного объема захватывающих антител в исходной концентрации с равным объемом разбавляющего буфера, получая концентрацию захватывающих антител в 0,5 мг/мл и повторяя этот процесс до получения концентраций захватывающих антител в 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл, 0,0625 мг/мл, 0,0325 мг/мл и т.д.

Термин "превосходный динамический диапазон" относится к способности метода детектировать конкретное анализируемое вещество всего лишь в одной клетке, либо в тысячах клеток. Например, описанные в настоящем изобретении способы иммуноанализа обладают превосходным динамическим диапазоном, поскольку они способны детектировать определенную конкретную молекулу передачи сигналов в 1-10000 клеток при помощи ряда разведений захватывающих антител в различных концентрациях.

Термин "молекула передачи сигналов" или "передатчик сигналов" охватывает белки и другие молекулы, участвующие в процессе, при помощи которого клетка преобразует внеклеточный сигнал или раздражитель в ответ, который обычно включает упорядоченные последовательности биохимических реакций внутри клетки. Примеры молекул передачи сигналов включают тирозинкиназы таких рецепторов, как EGFR (например, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR-1/FLT-1, VEGFR-2/FLK-1/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, PDGFR (например, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (инсулиновый рецептор), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (рецептор, родственный инсулиновому рецептору), CSF-1R, FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE 1-2, ТЕК, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, LTK (тирозинкиназа лейкоцитов), ALK (киназа анапластической лимфомы), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3 и RTK 106; нерецепторные тирозинкиназы, как то BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack и LIMK; компоненты сигнальных каскадов тирозинкиназ, как то Akt, MAPK/ERK, MEK, RAF, PLA2, МЕКК, JNKK, JNK, p38, She (p66), PI3K, Ras (например, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Rac1, Cdc42, PLC, PKC, киназа p70 S6, p53, циклин D1, STAT1, STAT3, PIP2, PIP3, PDK, mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, PTEN, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67 и пакксиллин; а также их комбинации.

В настоящем изобретении термин "циркулирующие клетки" охватывает внеопухолевые клетки, которые дали метастазы либо микрометастазы из солидной опухоли. Примеры циркулирующих клеток включают циркулирующие опухолевые клетки, раковые стволовые клетки и/или клетки, мигрирующие к опухоли (например, циркулирующие предшественники эндотелиальных клеток, циркулирующие эндотелиальные клетки, циркулирующие проангиогенные миелоидные клетки, циркулирующие дендритные клетки).

Термин "образец" в настоящем изобретении обозначает любой биологический образец, полученный от пациента. Образцами служат цельная кровь, плазма, сыворотка, эритроциты, лейкоциты (например, мононуклеары периферической крови), слюна, моча, кал, мокрота, смыв из бронхов, слезы, аспират из сосков, лимфа (например, диссеминированные опухолевые клетки лимфатических узлов), аспират тонкой иглой, любая другая жидкость организма, образец ткани (например, опухолевой ткани), как то биопсия из опухоли (например, биопсия иглой) и ее клеточные экстракты. В некоторых воплощении образцом является цельная кровь или ее составная часть, как то плазма, сыворотка или клеточный осадок. В предпочтительных воплощениях образец получают путем выделения циркулирующих клеток солидной опухоли из цельной крови или ее клеточной фракции любым известным методом. В других воплощениях образцом является фиксированный формалином и заключенный в парафин (FFPE) образец опухолевой ткани, например, солидной опухоли легких, толстой или прямой кишки.

"Биопсия" относится к процессу взятия образца ткани для диагностической или прогностической оценки и к самому образцу ткани. Любой известный метод биопсии может применяться к способам и композициям настоящего изобретения. Используемый метод биопсии обычно зависит от типа исследуемой ткани и размера и типа опухоли - солидной или взвешенной (т.е. крови или асцитов), среди других факторов. Репрезентативными методами биопсии являются эксцизионная биопсия, инцизионная биопсия, биопсия иглой (например, пункционная биопсия, аспирационная биопсия тонкой иглой и др.), хирургическая биопсия и биопсия костного мозга. Методы биопсии обсуждаются, к примеру, в Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper et al., eds., 16 th ed., 2005, Chapter 70, и по всей Part V.

Термин "субъект" или "пациент" обычно означает человека, но может включать и других животных, как то других приматов, грызунов, собак, кошек, лошадей, овец, свиней и др.

"Матрица" или "микроматрица" включает отдельный набор и/или ряд разведений захватывающих антител, иммобилизованных или фиксированных на твердой подложке, такой, к примеру, как стекло (например, предметное стекло), пластик, чип, штырек, фильтр, шарики, бумага, мембрана (например, из нейлона, нитроцеллюлозы, поливинилиденфторида (PVDF) и др.), пучки волокон или любой другой подходящий субстрат. Захватывающие антитела обычно иммобилизуют или фиксируют на твердой подложке при помощи ковалентных или нековалентных взаимодействий (например, ионных связей, гидрофобных взаимодействий, водородных связей, ван-дер-ваальсовых сил, дипольных связей). Матрицы, используемые в методах настоящего изобретения, как правило, содержат несколько различных захватывающих антител и/или концентраций захватывающих антител, сцепленных с поверхностью твердой подложки в различных известных/ адресуемых местах.

Термин "захватывающее антитело" служит для обозначения иммобилизованного антитела, которое специфично к (т.е. связывается или образует комплекс с) одному или нескольким представляющим интерес анализируемым веществам в образце. В предпочтительных воплощениях захватывающее антитело фиксировано на твердой подложке в матрице. Подходящие захватывающие антитела для иммобилизации любых из целого ряда молекул передачи сигналов на твердой подложке доступны от фирм Upstate (Temecula, СА), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, МО) и BD Biosciences (San Jose, CA).

Термин "детектирующее антитело" в настоящем изобретении охватывает антитела, содержащие детектируемую метку, которая специфична к (т.е. связывается или образует комплекс с) одному или нескольким представляющим интерес анализируемым веществам в образце. Термин также охватывает такие антитела, специфичные к (т.е. связывающиеся или образующие комплекс с) одному или нескольким представляющим интерес анализируемым веществам в образце, которые могут связываться с другими антителами, содержащими детектируемую метку. Примеры детектируемых меток включают метки типа биотин/стрептавидин, метки из нуклеиновых кислот (например, олигонуклеотидов), химически активные метки, флуоресцентные метки, ферментные метки, радиоактивные метки и их комбинации. Подходящие детектирующие антитела для детектирования активационных состояний любых из целого ряда молекул передачи сигналов доступны от фирм Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, МО) и BD Biosciences (San Jose, CA). Для примера, фосфо-специфичные антитела против различных фосфорилированных форм таких молекул передачи сигналов, как EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, Akt, MAPK/ERK, PTEN, Raf и МЕК, доступны от фирмы Santa Cruz Biotechnology.

Термин "зависимое от активационного состояния антитело" охватывает детектирующие антитела, которые специфичны к (т.е. связываются или образуют комплекс с) определенному активационному состоянию одного или нескольких представляющих интерес анализируемых веществ в образце. В предпочтительных воплощениях зависимое от активационного состояния антитело детектирует состояние фосфорилирования, убиквитинирования и/или комплексообразования одного или нескольких анализируемых веществ типа одной или нескольких молекул передачи сигналов. В некоторых воплощениях с помощью зависимых от активационного состояния антител детектируют фосфорилирование тирозинкиназ представителей семейства рецепторов EGFR и/или образование гетеродимерных комплексов между представителями семейства EGFR. Неограничивающие примеры активационных состояний (перечисленных в скобках), пригодных для детектирования с помощью зависимых от активационного состояния антител, включают: EGFR (EGFRvIII, фосфорилированный (р-) EGFR, EGFR:Shc, убиквитинированный (u-) EGFR, p-EGFRvIII); ErbB2 (р85:укороченный (Tr)-ErbB2, p-ErbB2, p85:Tr-p-ErbB2, Her2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbВ3 (р-ЕrbВ3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); IGF-1R (p-IGF-1R, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); KIT (p-KIT); FLT3 (p-FLT3); HGFRI (p-HGFRI); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRa (p-PDGFRa); PDGFRP (p-PDGFRP); VEGFRI (p-VEGFRI, VEGFRI:PLCg, VEGFR1:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCy, VEGFR2:Src, VЕGFR2:гепаринсульфат, VEGFR2:VЕ-кадгерин); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); Tiel (p-Tiel); Tie2 (p-Tie2); EphA (p-EphA); EphB (p-EphB); NFKB и/или 1KB (p-IK (S32), p-NFKB (S536), p-P65:IKBa); Akt (p-Akt (T308, S473)); PTEN (p-PTEN); Bad (p-Bad (S112, S136), Bad:14-3-3); mTor (p-mTor (S2448)); p70S6K (p-p70S6K (T229, T389)); Mek (p-Mek (S217, S221)); Erk (p-Erk (T202, Y204)); Rsk-1 (p-Rsk-1 (T357, S363)); Jnk (p-Jnk (T183, Y185)); P38 (p-P38 (T180, Y182)); Stat3 (p-Stat-3 (Y705, S727)); Fak (p-Fak.(Y576)); Rb (p-Rb (S249, T252, S780)); Ki67; p53 (p-p53 (S392, S20)); CREB (p-CREB (S133)); c-Jun (p-c-Jun (S63)); cSrc (p-cSrc (Y416)); и паксиллин (р-paxillin(Y118)).

Термин "независимое от активационного состояния антитело" охватывает детектирующие антитела, которые специфичны к (т.е. связываются или образуют комплекс с) одному или нескольким представляющим интерес анализируемым веществам в образце независимо от их активационного состояния. Например, независимое от активационного состояния антитело может детектировать как фосфорилированные, так и нефосфорилированные формы одного или нескольких анализируемых веществ типа одной или нескольких молекул передачи сигналов.

Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" охватывает дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды и их полимеры в одноцепочечном или двухцепочечном виде, такие, к примеру, как ДНК и РНК. Нуклеиновые кислоты включают и такие нуклеиновые кислоты, которые содержат известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или связи в остове, как синтетические или природные, так и не встречающиеся в природе, но обладающие такими же свойствами связывания, как у стандартной нуклеиновой кислоты. Примеры таких аналогов включают фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2'-O-метилрибонуклеотиды и пептид-нуклеиновые кислоты (PNA). Если не указаны конкретные ограничения, то термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов и обладающие такими же свойствами связывания, как у стандартной нуклеиновой кислоты. Если не указано иначе, то определенная последовательность нуклеиновой кислоты также неявно охватывает и ее подвергнутые консервативным модификациям варианты и комплементарные последовательности, а также указанную в явном виде последовательность.

Термин "олигонуклеотид" обозначает одноцепочечный олигомер или полимер РНК, ДНК, гибрида РНК/ДНК и/или миметика. В некоторых случаях олигонуклеотиды состоят из природных (т.е. немодифицированных) оснований нуклеотидов, сахаров и межнуклеозидных (в главной цепи) связей. В некоторых других случаях олигонуклеотиды содержат модифицированные основания нуклеотидов, сахара и/или межнуклеозидные связи.

В настоящем изобретении термин "несовпадающий мотив" или "участок несовпадения" обозначает ту часть олигонуклеотида, которая не на все 100% комплементарна своей комплементарной последовательности. Олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше участков несовпадения. Участки несовпадения могут быть смежными или же отстоять на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше нуклеотидов. Несовпадающие мотивы или участки могут содержать один единственный нуклеотид или же 2, 3, 4, 5 или больше нуклеотидов.

Выражение "строгие условия гибридизации" относится к условиям, при которых олигонуклеотид будет гибридизироваться со своей комплементарной последовательностью, но не с другими последовательностями. Строгие условия зависят от последовательности и будут различными при различных обстоятельствах. В частности, более длинные последовательности гибридизуются при более высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот приведено в Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Обычно строгие условия выбирают так, чтобы они были на 5-10°С меньше температуры плавления (Т_m) для конкретной последовательности при заданной ионной силе и рН. Точка Т_m - это температура (при заданной ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой в равновесном состоянии с последовательностью мишени гибридизуется 50% зонда, комплементарного мишени (поскольку последовательность мишени находится в избытке, то в равновесном состоянии в точке Т_m будет связано 50% зонда). Строгие условия также достигаются добавлением дестабилизирующих реагентов типа формамида. При избирательной или специфической гибридизации положительный сигнал по меньшей мере в два раза превышает фон, а предпочтительно в 10 раз превышает фоновую гибридизацию.

Термины "по существу идентичны" или "существенная идентичность" в контексте двух или нескольких нуклеиновых кислот означают то, что эти две или несколько последовательностей или подпоследовательностей одинаковы либо имеют заданный процент одинаковых нуклеотидов (т.е. идентичность составляет по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% на заданном участке) при сравнении и выравнивании по максимальному соответствию на всем окне сравнения или заданном участке и при измерении с помощью алгоритма сравнения последовательностей или при выравнивании вручную и визуальном контроле. Данное определение, если это вытекает из контекста, также относится и к комплементарной последовательности. Предпочтительно существенная идентичность отмечается на участке, длина которого составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или 100 нуклеотидов.

III. Описание воплощений

В одном воплощении настоящего изобретения предусмотрены способы детектирования экспрессии и активационного состояния нескольких разрегулированных молекул передачи сигналов в раковых клетках из опухолевой ткани или циркулирующих клетках солидной опухоли специфическим, мультиплексным, высокопроизводительным методом. Изобретением также предусмотрены способы и композиции для выбора надлежащей терапии для понижающей регуляции или отключения одного или нескольких разрегулиров