Рационально разработанные среды для культивирования клеток

Рационально разработанные среды для культивирования клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка испрашивает приоритет согласно предварительной патентной заявке США №60/858289 от 8 ноября 2006 г., содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Изобретение относится к способам рационального создания среды для культивирования клеток, предназначенной для клеточных культур, применяемых, например, для получения полипептидов; к среде для культивирования клеток, полученной указанными способами; к способам получения в больших количествах полипептида, представляющего интерес, например антитела, с использованием указанной среды; к полипептидам, полученным с использованием способов и среды, описанных в данной заявке; а также к фармацевтическим составам, содержащим такие полипептиды. Изобретение является особенно полезным для крупномасштабного производства клеточных культур. Способы и составы, описанные здесь, особенно полезны для получения значительных количеств полипептидов в порционных, подпитываемых и перфузионных культурах клеток животных.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Большую часть биотехнологических продуктов, серийно выпускаемых или находящихся только в стадии разработки, составляют белковые лекарственные препараты, поэтому существует потребность в получении таких полипептидов в клеточных культурах. Кроме того, для получения многих форм полипептидных лекарственных препаратов (в частности, гликозилированных белков или образованных гибридомами моноклональных антител (моноклональные антитела, MAbs)) часто требуется клеточный механизм клеток животных (в отличие, например, от клеток бактерий). Вследствие этого существует большая потребность в оптимизации продуцирования таких полипептидов в клеточных культурах, и в особенности - в клеточных культурах животных.

[0003] По сравнению с культурами клеток бактерий культуры клеток животных имеют более низкие скорости продуцирования и более низкий выход. Поэтому значительное количество исследований сфокусировано на определении условий получения культуры клеток животных, которые оптимизируют выход полипептида, т.е. условий, которые поддерживают высокую плотность клеток и высокий титр. Так, например, установлено, что поддержание концентраций глюкозы в среде для культивирования клеток на низком уровне и культивирование клеток в фазе продуцирования при осмотической концентрации примерно от 400 до 600 мОсм увеличивает продуцирование рекомбинантных белков культурой клеток животных, при этом культивацию во всех фазах проводят также при определенной концентрации глутамина (предпочтительно - примерно от 0.2 до примерно 2 мМ). Установлено также, что ограниченная подача глюкозы в культуры клеток животных в процессах с подпиткой регулирует продуцирование лактата, при этом постоянного потока глюкозы не требуется. Кроме того, известно, что модификация суммарной кумулятивной концентрации аминокислот, концентрации отдельных аминокислот и отношения содержания одних аминокислот к содержанию других (например, глутамина к аспарагину) и к суммарному содержанию аминокислот (например, глутамина к суммарному содержанию аминокислот) в среде культуры клеток для крупномасштабного производства может приводить к существенному усовершенствованию крупномасштабного производства полипептидов.

[0004] Традиционно исследования среды для культур клеток животных проводят по трем направлениям: 1) обогащение компонентов исходной среды и повышение частоты подпитки культуры; 2) применение многофакторного плана к средам различного состава и с различными концентрациями компонентов и 3) анализ содержания в кондиционированной (отработанной) среде аминокислот, витаминов и других компонентов и добавление тех компонентов, которые содержатся в недостаточном количестве или израсходованы. В качестве показателей оптимизации в этих способах обычно используют плотность клеток, жизнеспособность и титр.

[0005] Однако вышеуказанные способы позволяют лишь косвенно определить требования к питанию клеток исходя из конечного результата, т.е. плотности клеток, жизнеспособности и титра, не выясняя и не удовлетворяя фактических требований к питанию клеток для оптимального продуцирования белков.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Настоящее изобретение обеспечивает способы рационального создания среды для культивирования клеток, например культуры клеток для крупномасштабного производства для применения, например для получения культуры клеток для крупномасштабного продуцирования полипептидов; к среде для культивирования клеток, например культуры клеток для крупномасштабного производства, полученной указанными способами; к способам получения в больших количествах полипептида, представляющего интерес, например антитела, с использованием указанной среды, к полипептидам, полученным при помощи указанных способов и описанной здесь среды, а также к фармацевтическим составам, содержащим эти полипептиды. Такие способы и составы полезны для культивирования, например периодического культивирования, культивирования в подпитываемых культурах и перфузионного культивирования клеток. Эти способы и составы особенно полезны для крупномасштабного культивирования, например периодического культивирования, культивирования в подпитываемых культурах и перфузионного культивирования клеток животных, например клеток млекопитающих.

[0007] Рационально разработанная среда согласно настоящему изобретению включает концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для использования в клеточной массе, концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для поддержания жизнедеятельности клеток, и концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для введения в полипептид, представляющий интерес.

[0008] В одном варианте реализации изобретение обеспечивает способ получения полипептида в культуре клеток, включающий обеспечение культуры клеток, которая содержит клетки, включающие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, представляющий интерес, и желаемую среду для культивирования клеток, содержащую концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для использования в клеточной массе, концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для поддержания жизнедеятельности клеток, и концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для введения в полипептид, представляющий интерес, а также поддержание культуры клеток при условиях, которые позволяют экспрессировать полипептид, представляющий интерес. В одном варианте реализации изобретения желаемая среда для культивирования клеток содержит концентрацию А аминокислоты, откорректированную по базовому уровню, которую определяют по формуле A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F, где X - концентрация аминокислоты, используемая на единицу клеточной массы, Р - концентрация аминокислоты, используемая для введения в полипептид, представляющий интерес, на единицу титра полипептида, М - коэффициент желаемой пиковой плотности клеток в клеточной культуре, N - коэффициент желаемой концентрации полипептида, представляющего интерес, Y - коэффициент стабилизации клеток и F - коэффициент базового уровня.

[0009] В другом варианте реализации изобретение обеспечивает способ получения полипептида в культуре клеток, включающий обеспечение культуры клеток, содержащей клетки с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, представляющий интерес, и исходную среду для культивирования клеток, при этом объем исходной среды для культивирования клеток составляет примерно 60-99% от объема желаемой среды для культивирования клеток, подачу питательной среды для культивирования клеток в культуру клеток, при этом объем питательной среды для культивирования клеток составляет примерно 1-40% желаемой среды для культивирования клеток, а образующаяся желаемая среда для культивирования клеток содержит концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для использования в клеточной массе, концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для поддержания жизнедеятельности клеток, и концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для введения в полипептид, представляющий интерес, а также поддержание культуры клеток в условиях, которые позволяют экспрессировать полипептид, представляющий интерес. В одном варианте реализации изобретения образующаяся желаемая среда для культивирования клеток содержит концентрацию А аминокислоты, откорректированную по базовому уровню, которую определяют по формуле A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F, где X - концентрация аминокислоты, используемая на единицу клеточной массы, Р - концентрация аминокислоты, используемая для введения в полипептид, представляющий интерес, на единицу титра полипептида, М - коэффициент желаемой пиковой плотности клеток в клеточной культуре, N - коэффициент желаемой концентрации полипептида, представляющего интерес, Y - коэффициент стабилизации клеток и F - коэффициент базового уровня, а также поддержание культуры клеток при условиях, которые позволяют экспрессировать полипептид, представляющий интерес. В другом варианте реализации изобретения исходная среда для культивирования клеток содержит концентрацию В аминокислоты согласно формуле B=[A-(Z*V)]/(1-V), где Z - концентрация аминокислоты в питательной среде для культивирования клеток, а V - объем питательной среды культуры, представляющий собой часть объема желаемой среды для культивирования клеток. В другом варианте реализации описанных здесь способов Y составляет от 0 до примерно 1.5. В еще одном варианте реализации описанных здесь способов F составляет примерно от 1 до примерно 1.5. В следующем варианте реализации описанных здесь способов Y составляет от 0 до примерно 1.5, a F - примерно от 1 до примерно 1.5.

[0010] В одном варианте реализации описанных здесь способов желаемая среда для культивирования клеток имеет содержание тирозина примерно 3 мМ или более. В других вариантах реализации описанных здесь способов желаемая среда для культивирования клеток содержит: примерно от 7 мМ до примерно 30 мМ лейцина, примерно от 7 мМ до примерно 30 мМ лизина, примерно от 7 мМ до примерно 30 мМ треонина, примерно от 7 мМ до примерно 30 мМ пролина и/или примерно от 7 мМ до примерно 30 мМ валина. В следующем варианте реализации описанных здесь способов суммарная концентрация лейцина, лизина, треонина, пролина и валина в желаемой среде для культивирования клеток составляет примерно от 35 мМ до примерно 150 мМ. В еще одном варианте реализации суммарная концентрация лейцина, лизина, треонина и валина в желаемой среде для культивирования клеток составляет примерно от 60% до примерно 80% от суммарной концентрации незаменимых аминокислот.

[0011] В одном варианте реализации описанных здесь способов суммарная концентрация незаменимых аминокислот в желаемой среде для культивирования клеток составляет примерно от 30% до примерно 50% концентрации всех аминокислот. В другом варианте реализации описанных здесь способов концентрация аминокислот в желаемой среде для культивирования клеток составляет примерно от 120 мМ до примерно 350 мМ. В следующем варианте реализации описанных здесь способов концентрацию пролина в культуре клеток поддерживают большей чем примерно 1 мМ. В еще одном варианте реализации описанных здесь способов концентрацию пролина в культуре клеток поддерживают большей чем примерно 2 мМ. В некоторых вариантах реализации способов получения полипептида культивирование представляет собой крупномасштабное культивирование. В других вариантах реализации клетки представляют собой клетки животных.

[0012] Следующий аспект изобретения обеспечивает полипептиды, полученные описанными здесь способами. Еще один аспект изобретения обеспечивает фармацевтический состав, содержащий полипептид, полученный описанными здесь способами, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0013] Следующий аспект изобретения обеспечивает способ получения культуры клеток, включающий: обеспечение культуры клеток, содержащей клетки, и желаемую среду для культивирования клеток, содержащую концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для использования в клеточной массе, и концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для поддержания жизнедеятельности клеток, а также проведение культивирования при условиях, которые позволяют обеспечить рост и репликацию клеток при культивировании. В одном варианте реализации изобретения желаемая среда для культивирования клеток содержит концентрацию А' аминокислоты, откорректированную по базовому уровню согласно формуле A'=[(M*X)+(Y*M*X)]*F, где X - концентрация аминокислоты, которую используют на единицу клеточной массы, М - коэффициент желаемой пиковой плотности клеток в культуре клеток, Y - коэффициент стабилизации клеток и F - коэффициент базового уровня. В некоторых вариантах реализации способов получения культуры клеток культивирование представляет собой крупномасштабное культивирование. В других вариантах реализации клетки представляют собой клетки животных.

[0014] Следующий аспект изобретения обеспечивает среду для культивирования клеток, содержащую суммарную концентрацию аминокислот примерно от 120 мМ до примерно 350 мМ. Другой аспект изобретения обеспечивает среду для культивирования клеток, предназначенную для получения полипептида, представляющего интерес, и содержащую суммарную концентрацию аминокислот примерно от 120 мМ до примерно 350 мМ.

[0015] Другой аспект изобретения обеспечивает среду для культивирования клеток, предназначенную для получения полипептида, представляющего интерес, и содержащую концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для использования в клеточной массе, концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для поддержания жизнедеятельности клеток, и концентрацию аминокислоты, которую рассчитывают для введения в полипептид, представляющий интерес. В одном варианте реализации изобретения среда для культивирования клеток, предназначенная для получения полипептида, представляющего интерес, содержит концентрацию А аминокислоты, откорректированную по базовому уровню согласно формуле A=[(M*X)+(N*P)+(Y*M*X)]*F, где X - концентрация аминокислоты, которую используют на единицу клеточной массы, Р - концентрация аминокислоты, которую используют для введения в полипептид, представляющий интерес, на единицу титра полипептида, М - коэффициент желаемой пиковой плотности клеток в культуре клеток, N - коэффициент желаемой концентрации полипептида, представляющего интерес, Y - коэффициент стабилизации клеток, a F - коэффициент базового уровня.

[0016] Еще один аспект изобретения обеспечивает среду для культивирования клеток, содержащую концентрацию А' аминокислоты, откорректированную по базовому уровню согласно формуле A'=[(M*X)+(Y*M*X)]*F, где X - концентрация аминокислоты, которую используют на единицу клеточной массы, М - коэффициент желаемой пиковой плотности клеток в культуре клеток, Y - коэффициент стабилизации клеток, a F - коэффициент базового уровня. В некоторых вариантах реализации среда для культивирования клеток представляет собой среду для крупномасштабного культивирования клеток. В других вариантах реализации среда для культивирования клеток представляет собой среду для культивирования клеток животных.

[0017] Еще один аспект изобретения обеспечивает способ определения оптимальной концентрации аминокислоты, используемой в среде для культивирования клеток, которая предназначена для получения при культивировании полипептида, представляющего интерес, включающий: определение концентрации аминокислоты, которая требуется для клеточной массы клеток при культивировании при целевой плотности клеток, определение концентрации аминокислоты, которая требуется для получения полипептида, представляющего интерес, при культивировании при целевом титре полипептида, определение концентрации аминокислоты, которая требуется для поддержания жизнедеятельности клеток при культивировании, и повышение концентраций для обеспечения оптимальной концентрации аминокислоты, применяемой в среде для культивирования клеток, для получения полипептида, представляющего интерес, при культивировании.

[0018] Следующий аспект изобретения обеспечивает способ определения оптимальной концентрации А аминокислоты, используемой в среде для культивирования клеток, предназначенной для получения полипептида, представляющего интерес, при культивировании, включающий: определение концентрации аминокислоты X, которая требуется для клеточной массы при установленной плотности клеток, определение концентрации аминокислоты Р, которая требуется для получения полипептида, представляющего интерес, при установленном титре полипептида, и определение оптимальной концентрации аминокислоты А согласно формуле A=[(M*X)+(N*P)+(M*Y*X)]*F, где М - коэффициент желаемой целевой плотности клеток в культуре клеток, N - коэффициент желаемой целевой концентрации полипептида, представляющего интерес, Y - коэффициент стабилизации клеток; a F - коэффициент базового уровня. В некоторых вариантах реализации способов определения оптимальной концентрации аминокислоты культивирование представляет собой крупномасштабное культивирование. В других вариантах реализации клетки представляют собой клетки животных.

[0019] Другие особенности и достоинства изобретения станут очевидными из следующего подробного описания и прилагаемой формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0020] Фигура 1 показывает зависимость плотности клеток (ось Y; "Плотность клеток (10⁶ клеток/мл)") от времени (ось X; "Дни") для клеток яичника китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary, СНО), сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в рационально разработанной среде примера 2.

[0021] Фигура 2 показывает зависимость титра (ось Y; "Титр (г/л)") антитела анти-IL-22 от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в рационально разработанной среде примера 2.

[0022] Фигура 3 показывает зависимость плотности клеток (ось Y; "Плотность клеток (10⁶ клеток/мл)") от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в рационально разработанной среде примера 3.

[0023] Фигура 4 показывает зависимость титра (ось Y; "Титр (г/л)") антитела анти-IL-22 от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в рационально разработанной среде примера 3.

[0024] Фигура 5 показывает зависимость титра (ось Y; "Титр (г/л)") антитела анти-IL-22 от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в "традиционной среде" (в среде, созданной на основе традиционных требований к культуре клеток, см., например, опубликованную патентную заявку США №2006/0121568), в "рационально разработанной среде", полученной способами согласно настоящему изобретению, или в "традиционной среде + пролин", которая содержит дополнительно 3.7 мМ пролина, добавленного в "традиционную среду" (см. пример 4).

[0025] Фигура 6 показывает зависимость плотности клеток (ось Y; "Плотность клеток (10⁶ клеток/мл)") от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в "традиционной среде", в "рационально разработанной среде" или в "традиционной среде + пролин" (см. пример 4).

[0026] Фигура 7 показывает зависимость жизнеспособности клеток (ось Y; "Жизнеспособность [%]") от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в "традиционной среде", в "рационально разработанной среде" или в "традиционной среде + пролин" (см. пример 4).

[0027] Фигура 8 показывает зависимость концентрации соответствующей аминокислоты (ось Y, "[мкМ]") ((Фигура 8А) - пролин, (Фигура 8В) - треонин, (Фигура 8С) - валин, (Фигура 8D) - триптофан или (Фигура 8Е) - тирозин) от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в "традиционной среде", в "рационально разработанной среде" или в "традиционной среде + пролин" (см. пример 4).

[0028] Фигура 9 показывает зависимость плотности клеток (ось Y; "Плотность клеток (10⁶ клеток/мл)") от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в "рационально разработанной среде" или в "рационально разработанной среде без учета коэффициентов стабилизации и базового уровня". На фигуре показаны типичные результаты 5 независимых повторных экспериментов (n=5) (см. пример 6).

[0029] Фигура 10 показывает зависимость жизнеспособности клеток (ось Y: "Жизнеспособность (%)") от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в "рационально разработанной среде" или в "рационально разработанной среде без учета коэффициентов стабилизации и базового уровня". На фигуре показаны типичные результаты 5 независимых повторных экспериментов (n=5) (см. пример 6).

[0030] Фигура 11 показывает зависимость титра антитела (ось Y; "Титр (г/л)") от времени (ось X; "Дни") для клеток СНО, сконструированных для экспрессии анти-IL-22. Клетки культивировали в "рационально разработанной среде" или в "рационально разработанной среде без учета коэффициентов стабилизации и базового уровня" На фигуре показаны типичные результаты 5 независимых повторных экспериментов (n=5) (см. пример 6).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0031] Термин "периодическое культивирование", используемый в данном описании, относится к способу культивирования клеток, при котором все компоненты, которые, в конечном счете, используются в культивируемых клетках, включая среду, а также непосредственно клетки, вводят в начале процесса культивирования. Периодическое культивирование прекращают в определенный момент, а клетки и/или компоненты в среде собирают и по желанию очищают.

[0032] Термин "культивирование с подпиткой", используемый в данном описании, относится к способу культивирования клеток, при котором дополнительные компоненты подают в культуру спустя некоторое время после начала процесса культивирования. Вводимые компоненты обычно содержат питательные добавки, которые расходуются в процессе культивирования. Культивирование с подпиткой прекращают в определенный момент, а клетки и/или компоненты в среде собирают и по желанию очищают. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения культура клеток представляет собой культуру клеток животных, например культуру клеток млекопитающих, которую культивируют периодически или с подпиткой.

[0033] Термин "перфузионное культивирование", используемый в данном описании, относится к способу культивирования клеток, при котором в культуру непрерывно или полунепрерывно подают дополнительные компоненты спустя некоторое время после начала процесса культивирования. Вводимые компоненты обычно содержат питательные добавки, которые расходуются в процессе культивирования. Порции клеток и/или компонентов в среде обычно собирают в непрерывном или полунепрерывном режиме и по желанию очищают.

[0034] Термин "биореактор", используемый в данном описании, относится к любому резервуару, который используют для выращивания прокариотной или эукариотной культуры клеток, например культуры клеток животных (в частности, культуры клеток млекопитающих). Биореактор может иметь любой размер, если он является пригодным для культивирования клеток, например клеток млекопитающих. Обычно объем биореактора составляет, по меньшей мере, 30 мл и может быть равным 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 120000 литрам или более или какой-либо промежуточной величине. Внутренние режимы биореактора, включая, в частности, но без ограничения, pH и температуру, обычно регулируют в процессе культивирования. Биореактор может быть изготовлен из любого материала, пригодного для содержания культуры клеток млекопитающих, суспендированной в среде при условиях культивирования согласно настоящему изобретению, включая стекло, пластмассу или металл. Термин "производственный биореактор ", используемый в данном описании, относится к конечному биореактору, который используют для получения полипептида или белка, представляющего интерес. Объем производственного биореактора для крупномасштабного культивирования, как правило, превышает примерно 100 мл, обычно составляет, по меньшей мере, примерно 10 литров и может быть равен 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 120000 литрам или более или какой-либо промежуточной величине. Специалисты в данной области техники имеют соответствующую информацию и могут выбрать биореакторы, пригодные для применения при реализации настоящего изобретения.

[0035] Термины "плотность клеток", "концентрация клеток" или т.п., используемые в данном описании, относятся к количеству, весу, массе и т.п. клеток, присутствующих в данном объеме среды. Термин "пиковая плотность клеток" или т.п. относится к максимальному количеству клеток, которое можно получить в данном объеме среды, а термин "желаемая пиковая плотность клеток" или т.п. относится к максимальному количеству клеток (например, к заданной величине), которое желает получить практикующий специалист в данном объеме клеток. Отклонения таких заданных величин очевидны для специалистов в данной области техники, например, специалист может представить заданную величину как желаемую клеточную массу и выразить такую заданную величину одной или несколькими соответствующими единицами измерения (например, единицами желаемой пиковой клеточной массы).

[0036] Термин "жизнеспособность клеток", используемый в данном описании, относится к способности клеток выживать в культуре при заданной совокупности условий культивирования или экспериментальных отклонениях. Данный термин включает также отношение той части клеток, которые в определенное время являются живыми, к суммарному количеству живых и мертвых клеток в культуре в указанное время.

[0037] Термины "культура" и "культура клеток", используемые в данном описании, относятся к популяции клеток, которая суспендирована в среде для культивирования клеток в условиях, пригодных для выживания и/или выращивания популяции клеток. Эти термины в данном описании могут относиться к комбинации, включающей популяцию клеток (например, культуру клеток животных) и среду, в которой суспендирована указанная популяция.

[0038] Термин "интегральная плотность жизнеспособных клеток" или "IVC", используемый в данном описании, относится к средней плотности жизнеспособных клеток в процессе культивирования, умноженной на время культивирования. Если допустить, что масса полученного полипептида и/или белка пропорциональна количеству жизнеспособных клеток, присутствующих в процессе культивирования, интегральная плотность жизнеспособных клеток является полезным инструментом для определения массы полипептида и/или белка, образовавшегося при культивировании.

[0039] Термины "среда", "среда для культивирования клеток" и "культуральная среда", используемые в данном описании, относятся к раствору, содержащему питательные вещества, которые питают выращиваемые клетки животных, например клетки млекопитающих. Обычно эти растворы содержат незаменимые и заменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и микроэлементы, которые требуются для минимального роста и/или выживания клеток. Раствор может также содержать компоненты, которые усиливают рост и/или выживание, превышающие минимальный уровень, в том числе гормоны и факторы роста. Для раствора предпочтительно подбирают величину pH и концентрацию соли, оптимальные для выживания и пролиферации клеток. В одном варианте реализации указанная среда представляет собой определенную среду. Определенные среды представляют собой среды, в которых все компоненты имеют определенную химическую структуру. В другом варианте реализации изобретения среда может содержать одну или несколько аминокислот, полученных из какого-либо источника или каким-либо способом, известным специалистам, включая, в частности, но без ограничения, аминокислоты, полученные из добавок одной аминокислоты или из добавок пептонового или белкового гидролизата (в том числе из животных или растительных источников).

[0040] Термин "посев", используемый в данном описании, относится к процессу введения культуры клеток в биореактор или в другой резервуар. Клетки можно предварительно репродуцировать в другом биореакторе или резервуаре. Альтернативно клетки можно предварительно подвергнуть замораживанию и оттаиванию, например, непосредственно перед их подачей в биореактор или резервуар. Термин относится к любому количеству клеток, включая одиночную клетку.

[0041] Термин "титр", используемый в данном описании, представляет собой отношение полной массы представляющего интерес полипептида, который вырабатывается культурой клеток животных, к величине данного объема среды, таким образом, термин "титр" относится к концентрации. Титр обычно выражают в миллиграммах полипептида на миллилитр среды.

[0042] Термин "антитело", используемый в данном описании, включает белок, содержащий, по меньшей мере, одну, а типично - две вариабельные области тяжелой цепи или их части и/или, по меньшей мере, одну, а типично две вариабельные области легкой цепи или их части. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой тетрамер, состоящий из двух тяжелых и двух легких цепей иммуноглобулина, при этом тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина связаны друг с другом, например, при помощи дисульфидных связей. Антитела или их части можно получить из любого источника, включая, в частности, но без ограничения, грызунов, приматов (например, человека и обезьян), верблюдовых и т.п., или их можно получить рекомбинантно, например химерными, гуманизованными и/или генерированными in vitro, например, способами, хорошо известными специалистам в данной области.

[0043] Примеры связывающих фрагментов, которые описывает термин "антиген-связывающий фрагмент" антитела, включают, в частности, но без ограничения, (1) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1, (2) фрагмент F(ab')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирном участке, (3) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1, (4) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (5) фрагмент dAb, который состоит из домена VH, (6) верблюжий или камелизированный вариабельный домен тяжелой цепи (VHH), (7) одиночную цепь Fv (scFv; см. ниже), (8) биспецифическое антитело и (9) один или более фрагментов молекулы иммуноглобулина, слитых с участком Fc. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH кодируются отдельными генами, их можно соединять, используя рекомбинантые способы, синтетическим линкером, позволяющим им образовывать одну белковую цепь, в которой участки VL и VH связываются попарно, образуя одновалентные молекулы (известные как одиночная цепь Fv (scFv)); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83). Такие антитела с одиночной цепью также включаются в термин "антиген-связывающий фрагмент" антитела. Эти фрагменты можно получить, пользуясь традиционными способами, известными специалистам в данной области, а функцию фрагментов определяют таким же образом, как и функцию целых антител.

[0044] Антиген-связывающий фрагмент" может дополнительно содержать функциональную группу, которая усиливает один или несколько таких параметров, как, например, стабильность, эффекторная функция клетки или фиксация комплемента. Антиген-связывающий фрагмент может включать также, например, пегилированную группу, альбумин или константную область тяжелой и/или легкой цепи.

[0045] За исключением "биспецифических" или "бифункциональных" антител все сайты связывания остальных антител являются идентичными. "Биспецифическое" или "бифункциональное антитело" является искусственным гибридным антителом, которое имеет две различные пары тяжелой/легкой цепи и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получить разными способами, включая слияние гибридом или соединение фрагментов Fab'. См., например, Songsivilai and Lachmann. (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-21; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-53.

[0046] Выражение "белок" или "белковый продукт" относится к одной или нескольким цепям аминокислот. Термин "белок", используемый в данном описании, является синонимом "полипептида" и, как в общем случае понимают специалисты в данной области техники, относится, по меньшей мере, к одной цепи аминокислот, присоединенной посредством последовательных пептидных связей. В некоторых вариантах реализации "белок, представляющий интерес" или "полипептид, представляющий интерес" является белком, кодированным молекулой экзогенной нуклеиновой кислоты, которая трансформирована в клетку-хозяина. В некоторых вариантах реализации, где "белок, представляющий интерес", кодируется экзогенной ДНК, с которой трансформируется клетка-хозяин, последовательность экзогенной ДНК определяет последовательность аминокислот. В некоторых вариантах реализации "белок, представляющий интерес", является белком, кодированным молекулой нуклеиновой кислоты, которая является эндогенной по отношению к клетке-хозяину. В некоторых вариантах реализации экспрессию такого эндогенного белка, представляющего интерес, изменяют путем трансфицирования клетки-хозяина молекулой экзогенной нуклеиновой кислоты, которая может содержать, например, одну или несколько регуляторных последовательностей и/или кодировать белок, усиливающий экспрессию белка, представляющего интерес. Способы и составы согласно настоящему изобретению можно использовать для получения любого белка, представляющего интерес, включая, в частности, но без ограничения, белки, имеющие фармацевтические, диагностические, агротехнические и/или какие-либо иные из многочисленных свойств, полезных для применения в промышленной, исследовательской и/или других областях. Кроме того, белок, представляющий интерес, может быть терапевтическим белком. Терапевтический белок является белком, который оказывает биологический эффект на область организма, в которой он непосредственно действует, или на область организма, на которую он действует дистанционно посредством промежуточных компонентов. Более подробно примеры терапевтических белков рассматриваются далее. В некоторых вариантах реализации белки, получаемые с использованием способов и/или составов согласно настоящему изобретению, можно процессировать и/или модифицировать. Например, белок, получаемый согласно настоящему изобретению, можно гликозилировать.

[0047] Настоящее изобретение можно использовать для культивирования клеток с целью эффективного производства любого терапевтического белка, в частности пригодных для фармацевтического или промышленного применения ферментов, рецепторов, антител (например, моноклональных и/или поликлональных антител), Fc-слитых белков, цитокинов, гормонов, регуляторных факторов, факторов роста, факторов коагуляции/свертывания, антиген-связывающих агентов и т.п. Специалистам в данной области техники известны другие белки, которые можно получать согласно настоящему изобретению, и для получения таких белков они могут использовать описанные здесь способы.

Модели экспрессии и создание рекомбинантных клеток хозяина

[0048] Настоящее изобретение использует рекомбинантные клетки хозяина, например прокариотные или эукариотные клетки хозяина, т.е. клетки, трансфицированные конструктом экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, представляющий интерес. Выражение "клетки животных" включает клетки беспозвоночных, позвоночных немлекопитающих (например, птиц, рептилий и земноводных), а также клетки млекопитающих. Неограничительные примеры клеток беспозвоночных включают следующие клетки насекомых: Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (дрозофила) и Bombyx mori (тутовый шелкопряд).

[0049] Ряд клеточных линий млекопитающих пригоден в качестве клеток хозяина для рекомбинантной экспрессии полипептидов, представляющих интерес. Клеточные линии клетки-хозяина млекопитающих включают, например, COS, PER.C6, ТМ4, VERO076, MDCK, BRL-3A, W138, Hep G2, ММТ, MRC 5, FS4, СНО, 293Т, А431, 3Т3, CV-1, С3Н10Т1/2, Colo205, 293, Не La, клетки L, BHK, HL-60, FRhL-2, U937, HaK, клетки Jurkat, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x, клетки мышиной миеломы (например, SP2/0 и NS0) и клетки С2С12, а также трансформированные клеточные линии приматов, гибрид