Профилактика и лечение патологических состояний глаз, вызванных комплементом

Профилактика и лечение патологических состояний глаз, вызванных комплементом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к профилактике и лечению патологических состояний глаз, вызванных комплементом, таких как хороидальная неоваскуляризация (CNV) и возрастная дегенерация макулы (AMD).

Уровень техники изобретения

Система комплемента представляет собой сложный ферментативный каскад, составленный из серии сывороточных гликопротеинов, которые обычно существуют в неактивной форме проферментов. Активация комплемента может происходить двумя основными путями, классическим и альтернативным, которые сливаются на уровне C3, где две одинаковых C3-конвертазы расщепляют C3 на C3a и C3b.

Макрофаги являются специализированными клетками, у которых развилась характерная способность распознавать едва уловимые различия в структуре экспрессированных на поверхности клеток идентификационных маркеров, так называемые молекулярные паттерны (Taylor et al., Eur. J. Immunol. 33, 2090-2097 (2003); Taylor et al., Annu. Rev. Immunol. 23, 901-944 (2005)). В то время как прямое узнавание данных поверхностных структур является фундаментальным аспектом врожденного иммунитета, опсонизация позволяет типичным макрофагальным рецепторам опосредовать поглощение, повышая эффективность и диверсифицируя репертуар узнавания фагоцита (Stuart and Ezekowitz, Immunity 22, 539-550 (2005)). Процесс фагоцитоза включает множественные взаимодействия лиганд-рецептор, и в настоящее время известно, что различные опсонины, включая иммуноглобулины, коллектины и компоненты комплемента, стимулируют клеточные функции, необходимые для интернализации патогена посредством взаимодействия с рецепторами клеточной поверхности макрофагов (обзор в Aderem and Underhill, Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999); Underhill and Ozinsky, Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002)). В то время как природные иммуноглобулины, кодируемые генами зародышевой линии, могут узнавать множество различных патогенов, большинство опсонизирующих IgG производятся в процессе развития приобретенного иммунитета, и вследствие этого эффективное выведение патогенов с помощью Fc-рецепторов не является быстродействующим (Carroll, Nat. Immunol. 5, 981-986 (2004)). С другой стороны, комплемент быстро распознает поверхностные молекулы патогена и готовит частицу для поглощения при помощи рецепторов комплемента (Brown, Infect. Agents Dis. 1, 63-70 (1991)).

Комплемент состоит из более 30 сывороточных белков, которые опсонизируют множество различных патогенов для узнавания рецепторами комплемента. В зависимости от инициации каскада различают три пути (обзор в (Walport, N. Engl. J. Med. 344, 1058-1066 (2001))). Для всех трех общим является этап активации центрального компонента C3, но они различаются по природе узнавания и начальным биохимическим этапам, приводящим к активации C3. Классический путь активируется антителами, связанными с поверхностью патогена, которые, в свою очередь, связывают компонент комплемента C1q, запуская каскад сериновой протеазы, которая в конечном итоге расщепляет C3 до его активной формы, C3b. Лектиновый путь активируется после узнавания углеводных мотивов лектиновыми белками. В настоящее время идентифицированы три участника данного пути: связывающие маннозу лектины (MBL), SIGN-R1 семейство лектинов и фиколины (Pyz et al. Ann. Med. 38, 242-251 (2006)). Как MBL, так и фиколины связаны с сериновыми протеазами, которые действуют как C1 в классическом пути, активируя компоненты C2 и C4, ведущие к центральному этапу C3. Альтернативный путь отличается как от классического, так и от лектинового путей тем, что он активируется в результате прямой реакции внутреннего сложного эфира C3 с узнаваемыми мотивами на поверхности патогена. Начальное связывание C3 с активирующей поверхностью приводит к быстрому увеличению накопления C3b в результате действия протеаз альтернативного пути фактора B и фактора D. Важно отметить, что C3b, накопленный либо при классическом, либо при лектиновом пути, также может приводить к увеличению накопления C3b в результате действия фактора B и фактора D. Во всех трех путях активации комплемента главным этапом в опсонизации является превращение компонента C3 в C3b. Расщепление C3 ферментами каскадов комплемента открывает тиоэфир для нуклеофильной атаки, делая возможным ковалентное присоединение C3b на поверхности антигена через тиоэфирный домен. Это является первым этапом в комплементной опсонизации. Последующий протеолиз связанного C3b приводит к образованию iC3b, C3c и C3dg, фрагментов, которые узнаются различными рецепторами (Ross and Medof, Adv. Immunol. 37, 217-267 (1985)). Данное расщепление отменяет способность C3b к дальнейшему увеличению накопления C3b и активирует поздние компоненты каскада комплемента, включая атакующий мембрану комплекс, способный непосредственно повреждать мембрану. Однако макрофагальные фагоцитарные рецепторы преимущественно узнают C3b и его фрагменты; из-за неустойчивости образования сложноэфирной связи опосредованная C3 опсонизация является центральным моментом узнавания патогена (Holers et al., Immunol. Today 13, 231-236 (1992)), и вследствие этого рецепторы для различных продуктов деградации C3 играют важную роль в иммунном ответе хозяина.

Собственно C3 представляет собой сложный и гибкий белок, состоящий из 13 отдельных доменов. Центр молекулы составлен из 8 так называемых макроглобулиновых (MG) доменов, которые представляют собой плотно упакованные α и β цепи C3. В данную структуру встроены CUB (Clr/Cls, Uegf и Bone mophogenetic protein-1 (костный морфогенетический белок-1)) и TED домены, при этом последний содержит тиоэфирную связь, которая делает возможной ковалентную ассоциацию C3b с поверхностями патогенов. Оставшиеся домены содержат C3a или действуют как линкеры и спейсеры центральных доменов. Сравнение структур C3b и C3c с C3 свидетельствует о том, что молекула претерпевает крупные конформационные перестройки при каждом протеолизе, при котором обнажается не только TED, но и новые дополнительные поверхности молекулы, которые могут взаимодействовать с клеточными рецепторами (Janssen and Gros, Mol. Immunol. 44, 3-10 (2007)).

Возрастная дегенерация макулы (AMD) во всем мире является основной причиной слепоты у пожилых людей. AMD характеризуется прогрессивной потерей центрального зрения, связанной с дегенеративными и неоваскулярными изменениями в макуле, высокоспециализированной области сетчатки глаза, ответственной за хорошую остроту зрения. Согласно последним оценкам 14 миллионов человек ослепли или страдают от серьезных нарушений зрения вследствие AMD. Данное заболевание оказывает колоссальное влияние на физическое и психическое здоровье людей старческого возраста и членов их семей и становится основной нагрузкой на общественное здравоохранение.

Новые открытия, однако, начинают проливать свет на общую картину соответствующих клеточных процессов, генетических факторов и биохимических процессов, связанных с ранней AMD. Ген фактора H комплемента является первым геном, идентифицированным благодаря множеству независимых исследований, который обуславливает значительный генетический риск развития AMD. Так, три независимые исследовательские группы сообщили, что полиморфизм тирозина-гистидина на аминокислотной позиции 402 фактора H связан с развитием AMD (Klein et al., Science 308: 385-389 (2005); Haines et al., Science 308: 419-421 (2005) и Edwards et al., Science 308: 421-424 (2005)). Было высказано предположение, что нарушенное ингибирование альтернативного пути связанным с заболеванием аллелем фактора H либо вызывает, либо вносит существенный вклад в развитие AMD (Thurman and Holers, J. Immunol. 176: 1305-1310 (2006)).

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения патологического состояния глаз, вызванного комплементом, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста фактора D.

В различных вариантах осуществления нуждающийся субъект представляет собой млекопитающее, такое как человек, и антагонист фактора D выбирают из группы, состоящей из антител против фактора D и их фрагментов, связывающих полипептидов, пептидов и малых молекул непептидной природы.

В предпочтительном варианте осуществления антагонист фактора D представляет собой антитело или фрагмент антитела. В различных вариантах осуществления данное антитело может связываться с активным центром фактора D либо может связывать эпитоп, включающий остатки активного центра фактора D.

Специфические антитела, входящие в объем данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, антитела 20D12, 31A9, 25A1 и 32H12, а также их варианты. В предпочтительном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела связывается в основном с тем же эпитопом, что и антитело 20D12, либо содержит последовательности CDR тяжелой и/или легкой цепи антитела 20D12 (SEQ ID NO:1 и 2), либо представляет собой антитело 20D12 или его фрагмент.

Антитела против фактора D включают человеческие, гуманизированные или химерные антитела.

Фрагменты антител могут представлять собой, например, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, dAb, фрагменты определяющей комплементарность области (CDR), линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител, минитела, диатела или мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Патологические состояния глаз, вызванные комплементом, включают, например, возрастную дегенерацию макулы (AMD), хороидальную неоваскуляризацию (CNV), увеит, диабетическую и другие вызванные ишемией ретинопатии, диабетический макулярный отек, патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, окклюзию центральной ретинальной вены (CRVO), неоваскуляризацию роговицы и неоваскуляризацию сетчатки.

В другом аспекте изобретение относится к набору, включающему антагонист фактора D и инструкции по введению указанного антагониста для лечения патологического состояния глаз, вызванного комплементом.

В еще одном аспекте изобретение относится к применению антагониста фактора D в создании лекарственного средства для лечения патологического состояния глаз, вызванного комплементом.

В дополнительном аспекте изобретение относится к применению антагониста фактора D в лечении патологического состояния глаз, вызванного комплементом.

Краткое описание рисунков

Фиг.1. A: Уровни фактора D в стекловидном теле и оболочке Бруха, полученных из нормальных и с заболеванием AMD донорских глаз. Уровни фактора D измеряли методом ELISA, специфичным для фактора D, как описано. B: общие уровни фактора D в глазе определяли, рассчитывая общий вклад фактора D, экспрессированного в оболочке Бруха, и общее количество фактора D, обнаруженного в стекловидном теле.

Фиг.2. Иммуногистохимическое определение фактора D в поперечном срезе оболочки Бруха из донорского глаза с AMD. На врезке показано окрашивание фактора D в друзе, наслоенной на поверхность оболочки Бруха. В дополнение к друзе оболочка Бруха и хориоид были положительны по фактору D.

Фиг.3. Характеристика 12D20 в гемолитическом анализе, избирательном для альтернативного пути активации комплемента. Значения IC50 указаны ниже, и анализ выполнен, как описано в разделе «Методы».

Фиг.4. Последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 12D20 (SEQ ID NO:1 и 2).

Фиг.5. Картирование эпитопов различных антител против фактора D. Указаны их относительные активности в анализе гемолиза.

Фиг.6. Аминокислотная последовательность природного полипептида фактора D человека (SEQ ID NO:3).

Таблица 1. Анализ компонентов комплемента при AMD.

Таблица 2. Донорские ткани, используемые в исследованиях.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

1. Определения

Термины «фактор D» и «фактор D комплемента» используются взаимозаменяемо и относятся к полипептидам с природной последовательностью и вариантам фактора D.

Фактор D с «природной последовательностью» представляет собой полипептид, обладающий той же аминокислотной последовательностью, что и полипептид фактора D, полученный из природных источников, независимо от способа его получения. Таким образом, фактор D с природной последовательностью можно выделять из природных источников или получать при помощи рекомбинантных методов и/или синтеза. В дополнение к зрелому белку фактора D, такому как зрелый белок фактора D человека (NM_001928, SEQ ID NO:3), термин «фактор D с природной последовательностью», в частности, охватывает существующие в природе формы предшественника фактора D (например, неактивный белок-предшественник, который протеолитически расщепляется с образованием активной формы), существующие в природе вариантные формы (например, альтернативно сплайсированные формы) и существующие в природе аллельные варианты фактора D, а также структурные конформационные варианты молекул фактора D, обладающие той же аминокислотной последовательностью, что и полипептид фактора D, полученный из природных источников. В частности, данное определение охватывает полипептиды фактора D животных, отличных от человека, включая высших приматов и млекопитающих, отличных от человека.

«Вариант фактора D» или «вариант фактора D комплемента» означает полипептид активного фактора D, как определено ниже, имеющий как минимум примерно 80% идентичность аминокислотной последовательности с полипептидом фактора D с природной последовательностью, таким как полипептид человеческого фактора D с природной последовательностью, обладающий SEQ ID NO:3. Как правило, вариант фактора D будет иметь как минимум примерно 80% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 85% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 90% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 95% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 98% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 99% идентичность аминокислотной последовательности со зрелой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 человека. Предпочтительно максимальная степень идентичности последовательности имеет место в активном центре фактора D.

«Активный центр» фактора D определяется His-57, Asp-102 и Ser-195 (химотрипсиногенная нумерация) в последовательности человеческого фактора D. В факторе D Asp 189 (химотрипсиновая нумерация) находится на дне кармана первичной специфичности и расщепляет пептидную связь Arg. Каталитическая триада состоит из His-57, Asp-102 и Ser-195. Asp-102 и His57 обладают нетипичными конформациями по сравнению с другими сериновыми протеазами (Narayana et al., J. Mol. Biol. 235 (1994), 695-708). Уникальный солевой мост наблюдается между Asp 189 и Arg 218 на дне кармана S1, который поднимает петлю 214-218 и создает глубокий и узкий карман S1 (Jing et al., J. Mol. Biol. 282 (1998) 1061-1081). Эта петля и несколько других остатков вокруг активного центра, как показано с помощью мутационного анализа, являются ключевыми структурными детерминантами эстеролитической активности фактора D (Kim et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 24399-24405). На основании данных результатов предположили, что фактор D может претерпевать конформационное изменение при связывании связанного с C3b фактора B, что приводит к проявлению протеолитической активности (Volanakis and Narayana, Protein Sci. 5 (1996) 553-564).

«Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в контрольной последовательности фактора D после выравнивания последовательностей и внесения разрывов, если необходимо, чтобы достигнуть максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая никакие консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно выполнять различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, используя общедоступные компьютерные программы, такие как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей. Затем идентичность последовательностей рассчитывают относительно более длинной последовательности, то есть, если даже более короткая последовательность демонстрирует 100% идентичность последовательности с частью более длинной последовательности, общая идентичность последовательностей будет составлять менее 100%.

«Процент (%) идентичности нуклеотидной последовательности» определяют как процентное содержание нуклеотидов в последовательности-кандидате, которые являются идентичными с нуклеотидами в контрольной последовательности, кодирующей фактор D, после выравнивания последовательностей и вставки разрывов, если необходимо, чтобы достигнуть максимального процента идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности нуклеотидных последовательностей можно выполнять различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, используя общедоступные компьютерные программы, такие как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей. Затем идентичность последовательностей рассчитывают относительно более длинной последовательности, то есть, если даже более короткая последовательность демонстрирует 100% идентичность последовательности с частью более длинной последовательности, общая идентичность последовательностей будет составлять менее 100%.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена, как минимум, от одной примесной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты находится в иной форме или окружении, чем те, в которых она встречается в природе. Вследствие этого выделенные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют кодируемый полипептид, если, например, молекула нуклеиновой кислоты имеет хромосомную локализацию, отличную от локализации в природных клетках.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора D, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена, как минимум, от одной примесной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор D. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора D, находится в иной форме или окружении, чем те, в которых она встречается в природе. Вследствие этого выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора D, отличаются от молекулы (молекул) кодирующей нуклеиновой кислоты, существующей в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор D, включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор D, содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют фактор D, если, например, молекула нуклеиновой кислоты имеет хромосомную локализацию, отличную от локализации в природных клетках.

Термин «антагонист» используется в самом широком смысле и включает любую молекулу, которая способна нейтрализовать, блокировать, частично или полностью ингибировать, отменять, снижать или препятствовать биологической активности фактора D. Антагонисты фактора D включают, без ограничений, антитела против фактора D и их антигенсвязывающие фрагменты, другие связывающие полипептиды, пептиды и малые молекулы непептидной природы, которые связываются с фактором D и способны нейтрализовать, блокировать, частично или полностью ингибировать, отменять, снижать или препятствовать биологической активности фактора D, такой как способность фактора D вносить вклад в патологию состояния глаз, вызванного комплементом.

«Малую молекулу» определяют в данном документе как имеющую молекулярную массу ниже примерно 600, предпочтительно ниже примерно 1000 дальтон.

Термины «активный», или «активность», или «биологическая активность» в контексте антагониста фактора D по настоящему изобретению относятся к способности противодействовать (частично или полностью ингибировать) биологической активности фактора D. Предпочтительной биологической активностью антагониста фактора D является способность приводить к ощутимому улучшению состояния, например патологических признаков, вызванного фактором D заболевания или состояния, например, такого как патологическое состояние глаз, вызванное комплементом. Активность можно определять в тестах in vitro или in vivo, включая анализы связывания, использование соответствующей модели на животных или клинические испытания на людях.

Термин «патологическое состояние глаз, вызванное комплементом» используется в самом широком смысле и включает все состояния глаз, патология которых обусловлена комплементом, включая классический и альтернативный пути активации, в частности, альтернативный путь активации комплемента. Патологические состояния глаз, вызванные комплементом, включают, без ограничения, дегенеративные заболевания макулы, такие как все стадии возрастной дегенерации макулы (AMD), включая сухую и влажную (неэкссудативную и экссудативную) формы, хороидальную неоваскуляризацию (CNV), увеит, диабетическую и другие вызванные ишемией ретинопатии, а также другие внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как диабетический макулярный отек, патологическая миопия, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, окклюзия центральной ретинальной вены (CRVO), неоваскуляризация роговицы и неоваскуляризация сетчатки. Предпочтительная группа патологических состояний глаз, вызванных комплементом, включает возрастную дегенерацию макулы (AMD), включая неэкссудативную (влажную) и экссудативную (сухую или атрофическую) AMD, хороидальную неоваскуляризацию (CNV), диабетическую ретинопатию (DR) и эндофтальмит.

«Лечение» представляет собой вмешательство, произведенное с целью предотвращения развития или изменения патологии заболевания. Соответственно, термин «лечение» относится как к терапевтическому воздействию, так и к профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет заболевание, а также тех, у которых заболевание должно быть предотвращено. При лечении заболевания, связанного с иммунной системой, терапевтическое средство может напрямую изменять силу ответной реакции компонента иммунного ответа или делать заболевание более восприимчивым к лечению другими терапевтическими средствами, например антибиотиками, противогрибковыми препаратами, противовоспалительными средствами, химиотерапевтическими средствами и так далее.

Термин «патология» заболевания, такого как патологическое состояние глаз, вызванное комплементом, включает все симптомы, которые нарушают нормальное течение жизни пациента. Он включает, без ограничения, ненормальный или неконтролируемый рост клеток (нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, лимфоцитов), продукцию антител, продукцию аутоантител, продукцию комплемента, препятствие нормальному функционированию соседних клеток, высвобождение цитокинов или других секреторных продуктов в аномальных количествах, подавление или ухудшение любой воспалительной или иммунологической ответной реакции, инфильтрацию воспалительных клеток (нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, лимфоцитов) в клеточное пространство и так далее.

Термин «млекопитающее», как используют в данном документе, относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая, без ограничений, людей, высших приматов, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных в зоопарке, животных для занятий спортом или домашних любимцев, таких как лошади, свиньи, крупный рогатый скот, собаки, кошки и хорьки и так далее. В предпочтительном варианте осуществления млекопитающее является человеком.

Введение «в сочетании с» одним или большим количеством дополнительных терапевтических средств охватывает одновременное (совместное) или последовательное введение в любом порядке.

«Терапевтически эффективное количество» представляет собой количество «антагониста фактора D», которое необходимо для достижения заметного улучшения состояния, например патологии намеченного заболевания или состояния, например, такого как патологическое состояние глаз, вызванное комплементом.

Термин «контрольные последовательности» означает последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контрольные последовательности, подходящие для прокариот, например, включают промотор, необязательно, операторную последовательность и центр связывания рибосомы. Известно, что в эукариотических клетках используются промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», если она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде белка-предшественника, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает влияние на транскрипцию последовательности; или центр связывания рибосомы оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что это облегчает трансляцию. Как правило, «функционально связанные» означает, что последовательности ДНК, которые связаны, являются смежными и в случае секреторной лидерной последовательности смежными и в фазе считывания. Однако энхансеры необязательно должны быть расположены рядом. Связывание осуществляется за счет лигирования по подходящим сайтам рестрикции. Если такие сайты не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

«Строгость условий» реакций гибридизации может легко определять рядовой специалист в данной области, и она, как правило, представляет собой эмпирический расчет, основанный на длине зонда, температуре отмывки и концентрации соли. Как правило, для более длинных зондов необходимы более высокие температуры для правильного отжига, тогда как для более коротких зондов нужны более низкие температуры. Обычно гибридизация зависит от способности денатурированной ДНК повторно ренатурировать, когда комплементарные нити присутствуют в среде при температуре ниже их температуры плавления. Чем выше степень желательной гомологии между зондом и гибридизуемой последовательностью, тем выше относительная температура, которую можно использовать. Из этого следует, что более высокие относительные температуры имеют тенденцию делать условия реакции более строгими, тогда как более низкие температуры делают их менее строгими. Для дополнительных подробностей и объяснения строгости условий реакций гибридизации смотрите Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

«Строгие условия» или «очень строгие условия», как определено в данном документе, можно определить как условия, при которых: (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру для отмывки, например, смесь 0,015 M хлорид натрия/0,0015 M цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°C; (2) используют во время гибридизации денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (v/v) формамид со смесью 0,1% бычий сывороточный альбумин/0,1% фиколл/0,1% поливинилпирролидон/50 мМ натриево-фосфатный буфер при pH 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42°C; или (3) используют 50% формамид, 5×SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5×раствор Денхардта, фрагментированную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42°C, с отмывками при 42°C в 0,2×SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°C, с последующей отмывкой в очень строгих условиях, заключающихся в использовании 0,1×SSC, содержащей EDTA, при 55°C.

«Умеренно строгие условия» можно определить как условия, описанные в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, заключающиеся в использовании промывающего раствора и условий гибридизации (например, температуры, ионной силы и %SDS) менее строгих, чем описанные выше. Примером умеренно строгих условий является инкубация в течение ночи при 37°C в растворе, содержащем: 20% формамид, 5×SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатриевый цитрат), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5×раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующим промыванием фильтров в 1×SSC примерно при 37-50°C. Квалифицированный специалист знает, как следует регулировать температуру, ионную силу и так далее, чтобы привести их в соответствие с такими факторами, как длина зонда и тому подобное.

Термин «маркированный эпитопом», как используют в данном документе, означает химерный полипептид, представляющий собой полипептид по изобретению, слитый с «маркировочным полипептидом». Маркировочный полипептид содержит достаточно остатков для образования эпитопа, против которого можно получать антитело, но является достаточно коротким, чтобы не мешать проявлению активности полипептида, с которым он слит. Предпочтительно маркировочный полипептид также является совершенно уникальным, так что антитело существенно не реагирует перекрестно с другими эпитопами. Подходящие маркировочные полипептиды, как правило, содержат как минимум шесть аминокислотных остатков и обычно содержат примерно от 8 до 50 аминокислотных остатков (предпочтительно примерно от 10 до 20 аминокислотных остатков).

Термин «антитело» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает, без ограничений, простые моноклональные антитела против фактора D (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела), а также композиции антитела против фактора D с полиэпитопной специфичностью. Термин «моноклональное антитело», как используют в данном документе, означает антитело, полученное из популяции в основном гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, если не считать возможных естественных мутаций, которые могут встречаться в незначительных количествах.

Термин «моноклональное антитело», как используют в данном документе, означает антитело, полученное из популяции в основном гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, если не считать возможных естественных мутаций, которые могут встречаться в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направлены против одного антигенного участка. Кроме того, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые, как правило, содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. Определение «моноклональное» указывает на характер антитела, как полученного из гомогенной, в основном, популяции антител, и его не следует истолковывать, как необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые по настоящему изобретению, можно получать методом гибридом, впервые описанным Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, или можно получать методами рекомбинантных ДНК (смотрите, например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» можно также выделять из фаговых библиотек антител при помощи методов, описанных, например, в Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 и Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597.

В данном документе моноклональные антитела, в частности, включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся цепь(пи) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов, или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они обладают желаемой биологической активностью (патент США № 4816567 и Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

«Гуманизированные» формы антител, отличных от человеческих (например, мышиных), представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, отличного от человеческого. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области видов, отличных от человека (донорское антитело), таких как мышь, крыса, кролик или нечеловекообразные приматы, имеющими нужную специфичность, аффинность и потенциал. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, отличными от человеческих. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в реципиентном антителе или в донорском антителе. Такие модификации осуществляют с целью дальнейшего усовершенствования функции антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит в основном все, как минимум, из одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или в основном все из гипервариабельных петель соответствуют петлям из иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все или в основном все из FR-областей являются областями последовательности иммуноглобулина человека. Также гуманизированное антитело, необязательно, содержит, как минимум, часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно таковую из человеческого иммуноглобулина. Для дополнительных деталей смотрите Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525, Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-329 и Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596.

«Видоспецифичное антитело» представляет собой антитело, которое обладает более сильной аффинностью связывания в отношении антигена из первого вида млекопитающих, чем оно обладает в отношении гомолога данного антигена из второго вида млекопитающих. Как правило, видоспецифичное антитело «связывает специфически» антиген человека (то есть обладает величиной аффинности связывания (K_d) не более примерно 1×10^-7 M, предпочтительно не более примерно 1×10^-8 M и наиболее предпочтительно не более примерно 1×10^-9 M), но обладает аффинностью связывания в отношении гомолога данного антигена из второго вида млекопитающих, отличного от человека, которая как минимум примерно в 50 раз, или как минимум примерно в 500 раз, или как минимум примерно в 1000 раз слабее, чем его аффинность связывания в отношении человеческого антигена. Видоспецифичное антитело может относиться к любому из различных типов антител, как определено выше, но предпочтительно представляет собой гуманизированное или человеческое антитело.

Как используют в данном документе, «мутантное антитело» или «вариант антитела» означает вариант аминокислотной последовательности видоспецифичного антитела, где один или более аминокислотных остатков видоспецифичного антитела модифицированы. Такие мутанты неизбежно имеют менее 100% идентичности или сходства последовательностей с видоспецифичным антителом. В предпочтительном варианте осуществления мутантное антитело будет обладать аминокислотной последовательностью, имеющей как минимум 75% идентичности или сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельного домена либо тяжелой, либо легкой цепи видоспецифичного антитела, более предпочтительно как минимум 80%, более предпочтительно как минимум 85%, более предпо