Средство для лечения ревматоидного артрита

Средство для лечения ревматоидного артрита

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Техническая область

Настоящее изобретение относится к лекарственным средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые содержат антитело к рецептору IL-6 в качестве активного ингредиента.

Предпосылки изобретения

IL-6 представляет собой цитокин с различными функциями и продуцируется различными видами клеток, такими, как Т-клетки, В-клетки, моноциты, фибробласты, остеобласты, кератиноциты, эндотелиальные клетки, мезангиальные клетки и синовиальные клетки (Непатентные документы 1 и 2). IL-6 связывается с IL-6-рецептором, и затем сигнал передается в клетки после связывания комплекса IL-6/рецептор IL-6 с gp130 (Непатентный документ 3). Существует два типа рецепторов IL-6: мембранного типа и растворимая форма. Растворимая форма рецептора IL-6 также может образовывать комплекс IL-6/рецептор IL-6 и, таким образом, способна обеспечивать передачу сигнала через связывание с gp130.

Ревматоидный артрит (РА) представляет собой системное воспалительное заболевание неизвестной причины, и его основными симптомами являются частые артриты и прогрессирующее разрушение суставов. Внесуставные симптомы включают распространение патологических изменений в легкие, почки и подкожные ткани. Отличительным признаком РА является устойчивый синовит, несмотря на то, что существуют различные системные симптомы. Патологической функциональной особенностью этого заболевания является разрушение хрящей, синовит, который вызывает эрозию костей и последующую функциональную потерю сустава. При РА происходит увеличение кровеносных сосудов в суставах, и лейкоциты, такие как лимфоциты и макрофаги, мигрируют из кровеносных сосудов в суставные синовиальные ткани. В суставе происходит местный иммунный ответ, где воспалительная реакция индуцируется действием цитокинов, произведенных из лимфоцитов и макрофагов. В результате, деструкция хрящей/костей прогрессирует.

При РА наблюдается следующее: увеличивается скорость осаждения эритроцитов, возрастает уровень СРБ (C-реактивного белка), увеличивается число тромбоцитов, увеличивается уровень поликлональных иммуноглобулинов и присутствует ревматоидный фактор. Возникло предложение, что IL-6 вовлечен в эти изменения. Как сообщалось, уровень IL-6 повышен в сыворотке и суставной жидкости больных РА, и, таким образом, существует корреляция между уровнем IL-6 и степенью активности заболевания РА (Непатентные документы от 4 до 6). Также было показано, что у пациентов с РА продуцирование IL-6 в синовиальной ткани увеличено (Непатентный документ 7). Кроме того, сообщалось, что IL-6 вовлечен в резорбцию кости путем активирования дифференциации клеток-предшественников остеокластов в остеокласты в присутствии растворимого рецептора IL-6 (Непатентный документ 8). Эти обнаружения позволяют предположить, что IL-6 и растворимый рецептор IL-6 принимают участие в разрушении сустава. Действительно, в суставной жидкости больных РА уровень растворимого рецептора IL-6 повышен. Концентрации растворимого рецептора IL-6 и IL-6 являются достаточно высокими и сравнимы с уровнями, которые дают возможность индуцировать остеокласты in vitro (Непатентный документ 9). Таким образом, предполагается, что IL-6 вовлечен в различные процессы, такие как образование антител, инфильтрация лимфоцитов, образование паннуса, разрушение суставов, острофазовая реакция и анемия в патогенезе РА (Непатентный документ 10). Результаты недавних клинических исследований РА продемонстрировали отличный эффект гуманизированного антитела против IL-6R (TOCILIZUMAB), которое может связываться как с рецептором IL-6R мембранного типа, так и растворимым рецептором IL-6 и, тем самым, ингибировать IL-6-сигнал. Это говорит о том, что ингибирование рецептора IL-6 является высокоэффективным терапевтическим способом лечения РА (Непатентный документ 10).

Также известно, что, в дополнение к РА, TOCILIZUMAB является эффективным при лечении хронического артрита у детей и болезни Кастлемена.

Прототипные документы рассматриваемой области, связанные с настоящим изобретением, представлены ниже.

Прототипные документы рассматриваемой области

[Непатентные документы]

[Непатентный документ 1] Kishimoto T. The biology of interleukin-6. Blood 1989; 74: 1-10.

[Непатентный документ 2] Guerne PA, Zuraw BL, Vaughan JH, Carson DA, Lцtz M. Synovium 20 as a source of interleukin 6 in vitro. Contribution to local and systemic manifestations of arthritis. J Clin Invest 1989; 83: 585-92.

[Непатентный документ 3] Nishimoto N, Kishimoto T. Interleukin 6: from bench to bedside. Nature Clinical Practice Rheumatology 2006; 11: 19-26.

[Непатентный документ 4] Hirano T, Matsuda T, Turner M, Miyasaka N, Buchan G, Tang B, 25 Sato K, Shimizu M, Maini R, Feldmann M, Kishimoto T: Excessive production of interleukin 6/B cell stimulatory factor-2 in rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology 1988; 18: 1797-1801.

[Непатентный документ 5] Houssiau FA, Devogelaer JP, Van Damme J, De Deuxchaisnes CN, Van Snick J: Interleukin-6 in synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis and 30 other inflammatory arthritides. Arthritis & Rheumatism. 1988; 31: 784-788.

[Непатентный документ 6] Madhok R, Crilly A, Watson J, Capell HA. Serum interleukin 6 levels in rheumatoid arthritis: correlations with clinical and laboratory indices of disease activity. Ann Rheum Dis 1993; 52:232-4.

[Непатентный документ 7] Sack U, Kinne RW, Marx T, Heppt P, Bender S, Emmrich F: 35 Interleukin-6 in synovial fluid is closely associated with chronic synovitis in rheumatoid arthritis. Rheumatolology International 1993; 13: 45-51.

[Непатентный документ 8] Tamura T, Udagawa N, Takahashi N, Miyaura C, Tanaka S, Yamada Y, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kumaki K, Taga T, Kishimoto T, Suda T: Soluble interleukin-6 receptor triggers osteoclast formation by interleukin 6. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA 1993; 90: 11924-11928.

[Непатентный документ 9] Kotake S, Sato K, Kim KJ, Takahashi N, Udagawa N, Nakamura I, Yamaguchi A, Kishimoto T, Suda T, Kashiwazaki S: Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors in the synovial fluids from rheumatoid arthritis patients are responsible for osteoclast- like cell formation. Journal of Bone & Mineral Research 1996; 11: 88-95.

[Непатентный документ 10] Inhibiting interleukin-6 in rheumatoid arthritis. Choy E. Curr 10 Rheumatol Rep. 2008 Oct; 10(5): 413-7.

Раскрытие изобретения

[Проблемы, разрешаемые путем изобретения]

Настоящее изобретение было осуществлено в свете вышеуказанных обстоятельств. Целью данного изобретения является предоставление лекарственных средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело к рецептору IL-6. Конкретнее, настоящее изобретение представляет лекарственные средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело против рецептора IL-6 с улучшенными антиген-нейтрализующей способностью, фармакокинетикой (сохранение в плазме), иммуногенностью, безопасностью и физико-химическими свойствами, благодаря замененным аминокислотам в Tocilizumab, которое применялось в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.

[Средства для решения данных проблем]

Авторы настоящего изобретения создали антитела против рецептора IL-6 с улучшенной антиген-нейтрализующей способностью, фармакокинетикой (сохранение в плазме), иммуногенностью, безопасностью и физико-химическими свойствами, благодаря замененным аминокислотам в Tocilizumab, которое применялось в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена. Затем авторы настоящего изобретения показали, что фармацевтические вещества, включающие в качестве активного ингредиента описанное выше антитело против рецептора IL-6, полезны при лечении ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.

Конкретнее, настоящее изобретение представляет следующие [1]-[3]:

[1] средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое включает в себя в качестве активного ингредиента описанное ниже антитело:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1 (гипервариабельный участок 1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),

и легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3);

[2] средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое включает в качестве активного ингредиента описанное ниже антитело:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); и

[3] средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое включает в качестве активного ингредиента описанное ниже антитело:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3).

Настоящее изобретение также предоставляет следующее:

[4] способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения описанного ниже антитела:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),

и легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3);

[5] способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения описанного ниже антитела:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3);

[6] способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения описанного ниже антитела:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3);

[7] применение описанного ниже антитела:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),

и легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3),

при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена;

[8] применение описанного ниже антитела:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3),

при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена;

[9] использование описанного ниже антитела:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3)

при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена;

[10] описанное ниже антитело для применения в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),

и легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3);

[11] описанное ниже антитело для применения в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); и

[12] описанное ниже антитело для применения в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3).

[Эффекты изобретения]

Средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело к рецептору IL-6, производимое при помощи настоящего изобретения, обладающее улучшенными антиген-нейтрализующей способностью, фармакокинетикой (поддержание в плазме), иммуногенностью, безопасностью и физико-химическими свойствами. Поэтому можно уменьшать частоту введения, и они могут оказывать пролонгированный терапевтический эффект.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой график, демонстрирующий временную зависимость концентрации антитела в плазме после введения TOCILIZUMAB или Fv4-M73 в количестве 1 мг/кг яванским макакам.

Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий временную зависимость концентрации СРБ в плазме после введения TOCILIZUMAB или Fv4-M73 в количестве 1 мг/кг яванским макакам.

Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий временную зависимость соотношения несвязанного растворимого рецептора IL-6 в плазме после введения TOCILIZUMAB или Fv4-M73 в количестве 1 мг/кг яванским макакам.

Фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий ингибирующий эффект TOCILIZUMAB и Fv4-M73 на продуцирование MCP-1 синовиальными клетками, полученными из человеческих пациентов с РА.

Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий ингибирующий эффект TOCILIZUMAB и Fv4-M73 на продуцирование VEGF синовиальными клетками, полученными из человеческих пациентов с РА.

Способ воплощения изобретения

Настоящее изобретение относится к средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело, перечисленное ниже:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),

и легкую цепь, включающую:

CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),

CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и

CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).

Настоящее изобретение также относится к средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело, перечисленное ниже:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую в вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3).

Настоящее изобретение также относится к средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело, перечисленное ниже:

(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);

(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или

(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3).

Настоящее изобретение также предоставляет антитела, содержащие аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот (как правило, 30 аминокислот или менее, предпочтительно 10 аминокислот или менее, более предпочтительно пять аминокислот или менее, и еще более предпочтительно, три аминокислоты или менее) изменены (заменены, удалены, добавлены, и/или встроены) или модифицированы в антителе по настоящему изобретению, содержащем описанную выше аминокислотную последовательность. Такие антитела, содержащие изменения или модификации аминокислотной последовательности, предпочтительно обладают активностью (антиген-связывающей активностью, антиген-нейтрализующей активностью и др.), эквивалентной таковой исходного антитела.

Кроме того, антитела, используемые в качестве антител по настоящему изобретению, могут представлять собой биспецифические антитела. Биспецифическое антитело относится к антителу, которое имеет вариабельные области в одной и той же молекуле антитела, которые узнают разные эпитопы. Биспецифическое антитело по настоящему изобретению может представлять собой биспецифическое антитело, которое узнает разные эпитопы на молекуле рецептора IL-6, или биспецифическое антитело, в котором один из антиген-связывающих участков узнает рецептор IL-6, а другой антиген-связывающий участок узнает другое вещество. Примеры антигенов, которые связываются с другим антиген-связывающим участком биспецифического антитела, которое сконструировано из рецептор IL-6-узнающего антитела по настоящему изобретению, включают IL-6, TNFα, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, лимфотоксин α, лимфотоксин β, лиганд LIGHT, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN- α, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL и APRILR.

Каркасные области FRs, используемые для антител по настоящему изобретению, не являются особенно ограниченными и могут быть соответствующим образом отобраны специалистами в рассматриваемой области. Никаких особых ограничений не существует, однако, предпочтительнее использовать каркасные области, полученные от людей. Каркасные области FRs могут представлять собой каркасные области, имеющие изменение аминокислот в природной последовательности.

Константные области, использованные для антител по настоящему изобретению, не являются особенно ограниченными и могут быть соответствующим образом отобраны специалистами в рассматриваемой области. Никаких особых ограничений не существует, однако, предпочтительнее использовать константные области, полученные от людей. Константные области могут представлять собой константные области, имеющие изменение аминокислот в природной последовательности.

Описанные выше антитела по настоящему изобретению представляют собой антитела против рецептора IL-6, которые являются превосходящими по антиген-нейтрализующей способности, фармакокинетике (поддержание в плазме), иммуногенности, безопасности и/или физико-химическим свойствам. Антитела являются особенно полезными в качестве средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.

Антитела по настоящему изобретению можно производить способами, известными специалистам в рассматриваемой области.

Антитела по настоящему изобретению можно производить, например, при помощи следующей генно-инженерной методологии. Ген, кодирующий антитело по настоящему изобретению, конструируют и вставляют в соответствующий вектор; а затем вектор вводят в хозяина для продуцирования антитела (смотри, например, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).

Таким образом, настоящее изобретение представляет способы продуцирования антитела по настоящему изобретению, которые включают стадию культивирования клетки-хозяина, содержащей вектор, в который введен ген, кодирующий антитело по настоящему изобретению.

Конкретнее, настоящее изобретение представляет способы продуцирования антитела по настоящему изобретению, которые включают стадии:

(a) культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, в который введен ген, кодирующий антитело по настоящему изобретению; и

(b) получение антитела, кодируемого геном.

В частности, когда антитело производится с использованием клеток млекопитающих, ген такого антитела можно экспрессировать с использованием ДНК, в которой функционально соединены общеизвестный подходящий промотор, ген экспрессируемого антитела и сигнал полиаденилирования, расположенный ниже по течению от гена с 3'-стороны, или с использованием вектора, несущего ДНК. Примером промотора/энхансера является быстрый ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека.

Кроме того, в качестве промотора/энхансера, который можно использовать для экспрессии антитела по настоящему изобретению, можно использовать вирусные промоторы/энхансеры ретровирусов, вирусов полиомы, аденовирусов, вакуолизирующий обезьяний вирус 40 (SV-40) или подобные, или промоторы/энхансеры, полученные из клеток млекопитающих, такие как промотор/энхансер фактора элонгации 1α (HEF1α) человека или подобные.

Экспрессию антитела можно легко осуществлять при помощи, например, способа Mulligan et al. (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277: 108-114) c использованием промотора/энхансера SV40, или способа Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322) c использованием промотора/энхансера HEF1α.

В случае, когда антитело производится с использованием E. coli, антитело можно экспрессировать при помощи функционально связанного общераспространенного подходящего промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и гена антитела, который следует экспрессировать. Примеры промоторов включают промотор lacZ и промотор araB. Промотор lacZ можно использовать в соответствии со способом Ward et al. (Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341: 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6: 2422-2427), а промотор araB можно использовать в соответствии со способом Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240: 1041-1043).

В случае, когда продуцирование антитела осуществляется в периплазму E. coli, в качестве сигнальной последовательности для секреции антитела можно использовать сигнальную последовательность pelB (Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. (1987) 169: 4379-4383). После отделения антител, продуцированных в периплазму, структуру антитела подвергают повторному сворачиванию и затем используют (смотри, например, WO 96/30394).

Участок начала репликации можно получить из SV-40, вирусов полиомы, аденовирусов, вируса папилломы крупного рогатого скота (BPV) и подобных. Кроме того, для увеличения числа копий гена в клетке-хозяине экспрессионный вектор может содержать, в качестве селективного маркера, ген аминогликозид фосфотрансферазы (APH), ген тимидинкиназы (TK), ген ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Ecogpt) E. Coli, ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) и подобное.

Для получения антител по настоящему изобретению можно использовать любую систему продуцирования.

Системы продуцирования in vitro и in vivo пригодны в качестве систем для продуцирования антител. Системы продуцирования, в которых используются эукариотические клетки и прокариотические клетки, являются примерами систем продуцирования in vitro.

Системы продуцирования, которые используют клетки животных, клетки растений или клетки грибков, являются доступными при использовании эукариотических клеток. Известные клетки животных включают (1) клетки млекопитающих, например, CHO, COS, миеломы, почек детеныша хомячка (ВНК), HeLa, Vero и подобные, (2) клетки земноводных, такие как ооциты Xenopus laevis, и (3) клетки насекомых, такие как sf9, sf21, Tn5 и подобные. Известные клетки растений включают клетки, полученные из Nicotiana tabacum, и эти клетки можно культивировать в качестве каллюсов. Известные клетки грибков включают дрожжи, например, рода Saccharomyces, как, например, Saccharomyces cerevisiae, и мицелиальные грибы, например, рода Aspergillus, такие как Aspergillus niger.

Системы продуцирования, которые используют бактериальные клетки, являются доступными при использовании прокариотических клеток. Примеры бактериальных клеток включают E. coli и Bacillus subtilis.

Антитела можно получать путем введения представляющего интерес гена антитела в эти клетки при помощи трансформации, а затем культивирования этих трансформантов in vitro. Трансформанты можно культивировать с использованием известных способов. Например, в качестве питательной среды можно использовать DMEM, МЭМ, RPMI 1640 или IMDM, и это можно применять с добавлением сывороток, таких как фетальная телячья сыворотка (ФТС). Кроме того, антитела можно продуцировать in vivo путем передачи клеток с введенным геном антитела в брюшную полость или подобное у животных.

С другой стороны, системы продуцирования in vivo включают системы продуцирования с использованием животных и системы продуцирования с использованием растений. Млекопитающие, насекомые и т.п. используются в системах продуцирования с использованием животных.

Можно использовать млекопитающих, таких как коза, свинья, овца, мышь и крупный рогатый скот (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Альтернативно можно использовать насекомых, таких как шелковичный червь. При использовании растений можно использовать, например, табак.

Гены антител вводят в такие животные или растения, после чего антитела продуцируют в организме животных или растений, а затем извлекают. Например, ген антитела подготавливают в качестве слитого гена путем встраивания гена антитела в ген, кодирующий белок, который специфически производится в молоке, такой как ген β-казеина коз. Фрагменты ДНК, содержащие слитый ген, в которой был встроен ген антитела, затем инъецируют в эмбрионы козы, которые затем вводят в коз. Нужное антитело затем можно получать из молока, произведенного трансгенными козами, которые рождены козами, получившими эмбрионы, или их потомством. Для увеличения производства молока, содержащего представляющее интерес антитело, в трансгенных коз можно надлежащим образом вводить гормоны (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702).

В случае использования шелковичного червя, для инфицирования шелковичных червей применяют бакуловирусы, несущие ген представляющего интерес антитела, после чего представляющее интерес антитело получают из жидкостей организма (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315: 592-594). В случае использования табака, ген представляющего интерес антитела встраивают в экспрессионный вектор растений, например, pMON 530, и вектор затем можно вводить в бактерию, как, например, Agrobacterium tumefaciens. Бактерии затем используют для инфицирования табака, как, например, Nicotiana tabacum, после чего из листьев этого табака получают нужные антитела (Julian К.-С. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-138).

При продуцировании антитела с использованием системы продуцирования in vitro или in vivo, как описано выше, каждую ДНК, кодирующую тяжелую цепь (H-цепь) или легкую цепь (L-цепь) антитела, можно по отдельности включать в экспрессионный вектор для одновременной трансформации клетки-хозяина, или альтернативно ДНК, кодирующие H-цепь и L-цепь, можно встраивать в один экспрессионный вектор, для трансформации клетки-хозяина (смотри Международную патентную заявку No. WO 94/11523).

Антитела, продуцируемые и экспрессируемые, как описано выше, можно выделять из внутреннего содержания клеток или из клеточного окружения или из организмов-хозяев, и затем очищать до гомогенности. Антитела, используемые в настоящем изобретении, можно выделять/очищать с помощью аффинной хроматографии. Колонки, используемые в аффинной хроматографии, включают, например, протеин-А колонки и протеин-G колонки. Носители, используемые для аффинной хроматографии, включают, например, HyperD, POROS и Sepharose F.F. Кроме того, возможно использование других традиционных способов выделения и/или очистки белков. Такие способы не являются особенно ограниченными.

Например, антитела по настоящему изобретению можно выделять/очищать с помощью соответствующим образом выбранных/скомбинированных хроматографий, фильтров, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.д., в дополнение к описанной выше аффинной хроматографии. Такие хроматографии включают, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и гель-фильтрацию, и могут применяться для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Кроме того, возможно использование обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Концентрацию антитела, подготовленного, как описано выше, можно определить путем измерения оптической плотности, иммуноферментным анализом (ИФА) или т.д. В частности, в случае измерения оптической плотности раствор антитела разводят PBS(-) и измеряют оптическую плотность при длине волны 280 нм. Концентрацию рассчитывают по оптической плотности (1,35 OD=1 мг/мл). Альтернативно, в случае использования ИФА химический анализ может проводиться по следующей методике. А именно, 100 мкл антител козла к IgG человека (TAG) в разведении 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонатном буфере (pH 9,6) добавляют к 96-луночному планшету (Nunc) и инкубируют в течение ночи при 4°C для иммобилизации антител. После блокирования к планшету добавляют соответствующим образом разведенное антитело по настоящему изобретению, соответствующим образом разведенный образец, содержащий антитело, или IgG (CAPPEL) человека в качестве стандарта (100 мкл), затем планшет выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре.

После промывки добавляют 100 мкл разведенных в 5000 раз антител к IgG человека, меченных щелочной фосфатазой (BIO SOURCE), и инкубируют один час при комнатной температуре. После промывки добавляют раствор субстрата и инкубируют, и оптическую плотность измеряют при 405 нм, используя ридер для микропланшетов Model 3550 (Bio-Rad), для расчета концентрации представляющего интерес антитела.

Активность антитела, используемого в настоящем изобретении, по ингибированию IL-6-обусловленной передачи сигнала можно оценить с помощью традиционных способов, известных специалистам в рассматриваемой области. Например, IL-6 добавляют к культурам IL-6-зависимых миеломных клеточных линий человека (S6B45 и KPMM2), T-клеточной линии лимфомы Леннерта человека KT3 или IL-6-зависимой клеточной линии MH60.BSF2; и накопление ³H-тимидина IL-6-зависимыми клетками определяют в присутствии ингибитора IL-6. Альтернативно, культивируют экспрессирующие рецептор IL-6 клетки U266, и к культуре одновреме