Конструкции и способы для продуцирования и секреции ферментов, расщепляющих клеточную стенку

Конструкции и способы для продуцирования и секреции ферментов, расщепляющих клеточную стенку

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной заявке описаны молекулы, конструкции и способы продуцирования и секреции полипептидов, представляющих интерес, бактериальными клетками-хозяевами. В частности, настоящее изобретение относится к полинуклеиновым кислотам, кодирующим слитый белок, и к их применениям для секреции гетерологичного или гомологичного полипептида, представляющего интерес, бактериальной клеткой-хозяином. Далее изобретение относится к слитым белкам или к их участкам, кодируемым такой полинуклеиновой кислотой, и к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим эту полинуклеиновую кислоту. Далее настоящее изобретение относится к способам продуцирования и секреции гетерологичных или гомологичных полипептидов интересующих белков бактериальными клетками-хозяевами с использованием таких полинуклеиновых кислот и слитых белков.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Секреция гетерологичных белков является широко используемым методом в промышленности. Клетку можно трансформировать нуклеиновой кислотой, кодирующей интересующий гетерологичный белок, чтобы секретировать и посредством этого получить большие количества желаемых белков. Этот метод можно использовать для продуцирования огромного количества белка по сравнению с тем, которое продуцировалось бы естественным путем. Интересующими белками являются белки с широким разнообразием промышленных применений, включая терапевтические и сельскохозяйственные применения, а также применение в продуктах питания, косметике, моющих композициях, кормах для животных и т.д. Таким образом, повышение секреции белков, продуцируемых микроорганизмом, представляет общий интерес.

Достижения в клеточной и молекулярной биологии дали возможность в определенных случаях идентифицировать ген, кодирующий желаемый белок, выделить этот ген, встроить этот ген в клетку-хозяина и экспрессировать встроенный ген в клетке-хозяине для продуцирования желаемого белка. Бактерии интенсивно исследованы в качестве клеток-хозяев. Когда бактерии используют в качестве клеток-хозяев для экспрессии этого гетерологичного гена, часто встречающаяся проблема, однако, состоит в том, что большинство бактериальных экспрессионных систем продуцирует белки внутриклеточно и обычно необходимо разрушать клетки, чтобы обеспечить выделение продуктов.

Эта проблема может быть преодолена за счет того, чтобы бактерии секретировали желаемый белок в ростовую среду. Одним из особенно хорошо документально описанных способов направления секреции белков является использование секреторной сигнальной последовательности. Когда сигнальный пептид сливают с амино-концом гетерологичного белка, он направляет этот гетерологичный белок в секреторный аппарат на клеточной мембране. Затем гетерологичный белок перемещается через мембрану. Необязательно специфичная протеаза, иногда называемая "сигнальной пептидазой" или "лидерной пептидазой", удаляет сигнальный пептид и высвобождает гетерологичный белок.

Перемещение белков в периплазматическое пространство или секреция в их культуральную среду характеризуется рядом параметров. Типично векторы для секреции интересующего белка конструируют таким образом, чтобы расположить ДНК, кодирующую секреторную сигнальную последовательность, в 5'-положении к ДНК, кодирующей интересующий белок. Для повышения секреции можно следовать нескольким подходам: испытание нескольких различных сигнальных последовательностей, мутирование сигнальной последовательности или изменение секреторного биохимического пути внутри хозяина. Однако во многих случаях количество секретируемого гетерологичного белка при использовании только сигнального пептида для обеспечения секреции обычно очень мало и значительное количество гетерологичного белка часто деградирует после того, как он секретирован.

Clostridium является родом грамположительных бактерий, который представлен широким разнообразием штаммов. Бактерии Clostridium являются спорообразующими анаэробными бактериями. Этот род включает сольвентогенные Clostridia, такие как С.acetobutylicum, которые способны преобразовывать различные сахара и полисахариды в кислоты и растворители, и целлюлолитические Clostridia, такие как Clostridium cellulolyticum, которые способны эффективно расщеплять целлюлозу и родственные полисахариды клеточной стенки растений. Более конкретно, Clostridium cellulolyticum продуцирует и секретирует большие целлюлолитические комплексы, называемые целлюлосомами, которые эффективно расщепляют целлюлозу и родственные полисахариды клеточной стенки растений. Эти комплексы содержат различные ферменты, которые тесно связаны с большим белком, у которого отсутствует ферментативная активность, называемым "скаффолдин". Связывание ферментов на скаффолдине происходит посредством взаимодействия между когезионными модулями на скаффолдине и комплементарными докериновыми доменами на ферментах. Это высокоаффинное взаимодействие между докеринами и скаффолдинами предложено для биотехнологических применений, например очистки рекомбинантного белка (Craig et al. 2005, J. Biotechnol. 121:165-173).

Напротив, С.acetobutylicum, хотя она содержит в своем геноме большой кластер генов, кодирующих целлюлолитические ферменты и скаффолдин, неспособна расти на кристаллической целлюлозе.

Одной из стратегий объединения активности расщепления целлюлозы с продуцированием растворителей в одном организме стало введение генов, кодирующих целлюлосому С.cellulolyticum, в С.acetobutylicum. Mingardon et al. продемонстрировали продуцирование, сборку и секрецию миницеллюлосомы Clostridium acetobutylicum путем совместной экспрессии в ней гена маннаназы Мап5К из Clostridium cellulolyticum с геном cipd, кодирующим укороченный скаффолдин, также из С.cellulolyticum (Mingardon et al. Applied Environm. Microbiol. 2005, vol 71(3): 1215-1222).

Несколько групп исследователей изучило возможность повышения или улучшения целлюлолитической активности целлюлосомных комплексов путем действий с различными модулями, присутствующими в них, и комбинирования различных типов целлюлаз в так называемых "сконструированных целлюлосомах". Было продемонстрировано, что бифункциональные и трифункциональные сконструированные целлюлосомы, которые включают химерный скаффолдин с двумя или тремя когезинами различной специфичности и двумя или тремя целлюлазами, каждая из которых несет докерин, комплементарный одному из когезинов, образуют мультипротеиновый комплекс с усиленной синергической активностью на трудноразлагаемых субстратах, таких как солома (Fierobe et al. 2002, J. Biol. Chem. 277, 49621-19630; Fierobe et al. 2005, J. Biol. Chem. 280(16): 16325-16334). Кроме того, было обнаружено, что такие целлюлосомы могут включать комбинации ферментов бактерий и грибов (Mingardon et al. 2007, Appl. Environm. Microbiol. 73(12):3822-3832). В этих экспериментах целлюлосомы либо продуцировали путем совместной экспрессии векторов, кодирующих различные части целлюлосомы в Clostridium cellulolyticum, которая в природе секретирует эти белки, либо путем смешивания продуцированных рекомбинантным путем и очищенных скаффолдинов и ферментов in vitro.

Mingardon et al. описывают продуцирование "ковалентной целлюлосомы", которая включает в единой полипептидной цепи СВМ вместе с семейством 48 и семейством 9 каталитического модуля. Этот белок был выделен из E. соli, в котором осуществлялась его гиперэкспрессия, путем разрушения клеток в Френч-прессе и очистки рекомбинантного белка с использованием С-концевой His метки. Было обнаружено, что ковалентная целлюлосома значительно менее активна на субстрате Avicel, чем соответствующие гибридные целлюлосомы (Mingardon et al. 2007, Appl. Environm. Microbiol. 73(22): 7138-7149).

Клонирование гетерологичных или гомологичных генов, кодирующих секретируемые белки, и (сверх)продуцирование и секреция таких гетерологичных или гомологичных белков бактериальными клетками, такими как виды рода Clostridium, иные чем С.cellulolyticum, до сих пор не являются широко описанными, вероятно, в результате проблем, встречающихся при обеспечении секреции рекомбинантных белков этими хозяевами.

В свете вышеизложенного понятно, что в данной области техники существует необходимость в улучшении секреции белков бактериальными клетками.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является разработка подхода к продуцированию и секреции интересующих гетерологичных полипептидов бактериальной клеткой, более конкретно грамположительной бактериальной клеткой, и/или улучшения продуцирования и секреции интересующих гомологичных полипептидов грамположительной бактериальной клеткой, и, в частности, в бактерии Clostridium. В данной заявке также предложены новые молекулы и конструкции, полезные в способах секреции белка, предложенных в данной заявке, и способы получения таких молекул и конструкций.

Настоящая заявка по меньшей мере частично основана на открытии нового способа продуцирования и экспорта интересующего полипептида микроорганизмом, который позволяет избежать по меньшей мере некоторых проблем, связанных с секрецией, которые перечислены выше. Молекулы, конструкции и способы в соответствии с данным изобретением дают возможность (сверх)продуцировать и секретировать интересующие полипептиды бактериальной клеткой. В частности, в настоящем изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, который имеет домен-носитель, который обладает функциональным эффектом на секрецию интересующего слитого полипептида. Более конкретно авторы изобретения показали функциональный эффект домена-носителя слитого белка, то есть способность к контролю (индукции и/или улучшению) (внеклеточной) секреции интересующего гомологичного или гетерологичного полипептида рекомбинантной клеткой-хозяином, продуцирующей этот слитый белок. Этот домен-носитель включает углевод-связывающий модуль (СВМ, carbohydrate binding module) и гидрофильный модуль (модуль X) типично поддерживающего белка и более конкретно в комбинации с сигнальным пептидом секреции, который обеспечивает (улучшенную) секрецию интересующего полипептида. Таким образом, в самом настоящем изобретении предпочтительно также предложено применение по меньшей мере части поддерживающего белка и, в частности, по меньшей мере модулей, включающих СВМ, его гидрофильный модуль, в частности, в комбинации с сигнальным пептидом для контроля секреции в клетке-хозяине интересующего гомологичного или гетерологичного полипептида, слитого с указанной частью поддерживающего белка.

Таким образом, в первом аспекте в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает в данном конкретном порядке:

- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним гидрофильным доменом целлюлосомного поддерживающего белка;

- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом, и

- по меньшей мере один интересующий полипептид.

В конкретной форме осуществления изобретения полинуклеиновая кислота дополнительно включает в рамке считывания нуклеиново-кислотную последовательность для секреции кодируемого слитого белка, и предпочтительно эта нуклеиново-кислотная последовательность кодирует сигнальный пептид целлюлосомного поддерживающего белка.

Соответственно, в изобретении предложены полинуклеиновые кислоты, кодирующие слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает, и более конкретно в данном порядке:

- по меньшей мере один подходящий сигнальный пептид;

- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним Х модулем целлюлосомного поддерживающего белка;

- по меньшей мере один интересующий полипептид, и

- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом.

В конкретных формах осуществления изобретения пептидный линкер содержит сайт расщепления протеазы для отщепления интересующего полипептида от остальной части слитого белка.

В следующих конкретных формах осуществления полипептидная последовательность включает два или более чем два Х модуля, более конкретно два Х модуля.

В другом аспекте изобретение направлено на применение домена-носителя, как определено в данной заявке, более конкретно в комбинации с сигнальным пептидом, для контроля секреции интересующего полипептида, предпочтительно полипептида, как определено в данной заявке, клеткой-хозяином.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением. Предпочтительно предложен вектор, где полинуклеиновая кислота находится под контролем регуляторных последовательностей для экспрессии нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке.

Еще в одном другом аспекте в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая полинуклеиновую кислоту или вектор согласно изобретению.

Соответственно, конкретные формы осуществления изобретения относятся к рекомбинантным микроорганизмам, содержащим полинуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает, более конкретно в данном порядке: (1) по меньшей мере один сигнальный пептид; (2) домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) типа СВМ целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним Х модулем целлюлосомного поддерживающего белка; (3) по меньшей мере один интересующий полипептид и (4) по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом. Микроорганизмы по изобретению характеризуются тем, что они секретируют интересующий полипептид.

В следующих конкретных формах осуществления предложены микроорганизмы, где полинуклеиновая кислота кодирует полипептидную последовательность, которая включает два или более чем два модуля X.

В конкретных формах осуществления предложены микроорганизмы, где полипептидная последовательность включает сигнальный пептид, который представляет собой сигнальный пептид целлюлосомного поддерживающего белка. Наиболее конкретно этот сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum или сигнальный пептид поддерживающего белка CipA С.acetobutylicum.

В конкретных формах осуществления предложены микроорганизмы, где полипептидная последовательность включает по меньшей мере один углерод-связывающий модуль, который представляет собой углерод-связывающий модуль типа 3а (СВМ3а).

В конкретных формах осуществления предложены микроорганизмы, где полипептидная последовательность включает по меньшей мере один модуль X, который представляет собой модуль Х2 поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum или модуль Х2 поддерживающего белка CipA С.acetobutylicum.

Более конкретно клетки-хозяева, предложенные в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой грамположительные бактерии, более конкретно члены класса Clostridia. В следующих конкретных формах осуществления микроорганизмы в соответствии с изобретением представляют собой микроорганизмы из штамма Clostridium, выбранного из группы, включающей С.acetobutylicum и С.beijerinckii.

Микроорганизмы в соответствии с изобретением могут содержать одну или более чем одну нуклеиновую кислоту, где каждая нуклеиновая кислота содержит последовательность, кодирующую один или более чем один интересующий полипептид.

Еще в одном другом аспекте в изобретении предложен слитый белок, кодируемый полинуклеиновой кислотой по изобретению. Кроме того, в изобретении также предложен слитый белок, который слит с сигнальным пептидом, как определено в данной заявке.

Далее настоящее изобретение относится к способу редуцирования и секреции клеткой-хозяином, более конкретно бактериальной клеткой-хозяином, еще более конкретно клеткой-хозяином Clostridium, наиболее конкретно клеткой-хозяином нецеллюлолитических Clostridium, по меньшей мере одного интересующего гетерологичного или гомологичного полипептида в биологически активной форме, включающему введение в клетку-хозяина полинуклеиновой кислоты или вектора в соответствии с изобретением в условиях, эффективных, чтобы вызвать экспрессию кодируемого слитого белка, где кодируемый слитый белок секретируется клеткой-хозяином в окружающую среду этой клетки-хозяина. Во время секреции сигнальный пептид необязательно отщепляется от слитого белка. Интересующий полипептид необязательно одновременно или дополнительно отщепляется от домена-носителя.

Соответственно, в конкретных формах осуществления в изобретении предложены способы продуцирования и секреции рекомбинантным микроорганизмом по меньшей мере одного интересующего гетерологичного или гомологичного полипептида, включающие введение в микроорганизм полинуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает, более конкретно в данной порядке (1), по меньшей мере один сигнальный пептид; (2) домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) типа СВМ целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним Х модулем целлюлосомного поддерживающего белка; (3) по меньшей мере один интересующий полипептид и (4) по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом в условиях, эффективных, чтобы вызвать экспрессию кодируемого слитого белка, где кодируемый слитый белок секретируется рекомбинантным микроорганизмом в окружающую среду этого рекомбинантного микроорганизма.

Следующий аспект изобретения включает применение полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для продуцирования и секреции интересующего полипептида в биологически активной форме.

В конкретных формах осуществления различных аспектов изобретения интересующие полипептиды включают фермент, такой как фермент, расщепляющий клеточную стенку растений, и предпочтительно целлюлазу. Наиболее конкретно фермент представляет собой целлюлазу С.cellulolyticum, такую как Cel48F или Cel9G. Дополнительно или альтернативно интересующий полипептид включает целлюлазу CelH S. degradans штамма 2-40.

В другой форме осуществления интересующие полипептиды в соответствии с изобретением могут включать терапевтический белок. Такой терапевтический белок может представлять собой, но не ограничен им, белок, выбранный из группы, включающей терапевтические ферменты, цитокины и антитела и предпочтительно цитокины, такие как IL-2 или TNFα.

Еще в одном другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей одно из полинуклеиновой кислоты, слитого белка, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Более конкретно фармацевтическая композиция содержит клетку-хозяина, более конкретно клетку-хозяина Clostridium, экспрессирующую полинуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением.

Далее изобретение относится к полинуклеиновой кислоте, слитому белку, вектору или клетке-хозяину в соответствии с изобретением для применения в качестве лекарства.

Кроме того, изобретение направлено на полинуклеиновую кислоту, слитый белок, вектор или клетку-хозяина в соответствии с изобретением для лечения рака.

В следующем аспекте в изобретении предложены способы лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение этому субъекту полинуклеиновой кислоты, слитого белка, вектора или клетки-хозяина либо фармацевтической композиции в соответствии с изобретением и предпочтительно включающие инъекцию полинуклеиновой кислоты, слитого белка, вектора или клетки-хозяина либо фармацевтической композиции в сайт опухоли этого субъекта. Более конкретно в изобретении предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение этому субъекту клетки-хозяина, экспрессирующей полинуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, необязательно эту клетку-хозяина инъецируют в сайт опухоли субъекта.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения будут очевидны в свете подробного описания, которое следует далее.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 представляет собой схематическое представление различных конструкций в соответствии с конкретными формами осуществления изобретения. Эти конструкции включают интересующий полипептид (целлюлазу Cel48F или Cel9G), слитый с доменом-носителем и сигнальным пептидом. Домен-носитель включает углевод-связывающий модуль (СВМ3а) из целлюлосомного поддерживающего белка, слитый с одним или с двумя гидрофильными доменами (Хc или Ха), имеющими происхождение из того же или другого целлюлосомного поддерживающего белка (белков). На фиг.1 дополнительно показана секреция этих конструкций С.acetobutylicum.

Фиг.2 представляет собой схематическое представление различных конструкций в соответствии с конкретными формами осуществления изобретения. Эти конструкции включают интересующий полипептид (целлюлазу "Сеl5Н"), слитый с доменом-носителем и сигнальной последовательностью. Домен-носитель включает углевод-связывающий модуль (СВМ3а) из целлюлосомного поддерживающего белка, слитый с одним или с двумя модулями Х (Ха). Целлюлаза Сеl5Н содержит домен семейства 5 гликозидгидролазы ("5"), полисериновый линкер ("sss"), домен углевод-связывающего модуля семейства 6 ("б"), участок, обогащенный глутаминовой кислотой - пролином ("eppv"), и С-концевой домен, идентифицированный авторами настоящего изобретения как предполагаемый углевод-связывающий модуль ("DZ").

На фиг.3 продемонстрирована секреция Се15Н дикого типа и Сеl5Н, слитой с доменом-носителем, по сравнению с контрольным штаммом. Домен-носитель включает углевод-связывающий модуль (СВМ3а) из целлюлосомного поддерживающего белка, слитый с двумя гидрофильными доменами (Ха). Активность надосадочной жидкости культуры измеряли на растворимом субстрате пара-нитрофенилцеллобиозе.

На фиг.4 продемонстрирована активность различных белков, включающих слитые белки в соответствии с конкретными формами осуществления изобретения, на целлюлозе: активность белков, включающих CelQG, на кристаллической целлюлозе Avicel по сравнению с Cel9G дикого типа. Подписи являются такими же, как на фиг.1.

На фиг.5 продемонстрирована активность различных белков, включающих слитые белки в соответствии с конкретными формами осуществления изобретения, на различных субстратах, представляющих собой целлюлозные полимеры; (а) активность белков, включающих Сеl5Н, на растворимом субстрате пара-нитрофенилцеллобиозе; Сеl5Н дикого типа (сплошная линия), слитый белок с одним модулем Х (СВМ-Ха-5Н; точечная линия), слитый белок с двумя модулями Х (СВМ-Ха-Ха-5Н, пунктирная линия); (б) активность белков, включающих Се15Н, на кристаллической целлюлозе Avicel.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Общие определения

Как используют в данной заявке, формы единственного числа включают объекты как единственного, так и множественного числа, если контекст явно не требует иного. Например, "клетка" относится к одной или более чем одной клетке.

Термины "содержащий", "содержит" и "состоящий из", как используют в данной заявке, являются синонимами "включающий", "включает" или "входящий", "входит" и являются включающими или не исчерпывающими и не исключающими дополнительные не указанные члены, элементы или стадии способа.

Термин "примерно", как используют в данной заявке при ссылке на измеримую величину, такую как параметр, количество, продолжительность времени и тому подобное, подразумевают как включающий вариации ±20% или менее, предпочтительно ±10% или менее, более предпочтительно ±5% или менее, даже более предпочтительно ±1% или менее и еще более предпочтительно ±0,1% или менее от указанной величины, если такие вариации пригодны для осуществления в раскрытом изобретении.

Указание численных интервалов конечными точками включает все числа и дроби, включенные в этот интервал, а также указанные конечные точки.

Все документы, цитируемые в настоящем описании, полностью включены в данную заявку посредством ссылки. В частности, положения всех документов в данной заявке конкретно относятся к включенным посредством ссылки.

Настоящее изобретение в целом направлено на полинуклеиновые кислоты, конструкции, молекулы и способы продуцирования и секреции полипептидов клетками-хозяевами.

В данном контексте термин "секреция" относится к внеклеточной доставке интересующего полипептида, то есть к доставке вне клетки-хозяина. В частности, это означает, что интересующий полипептид высвобождается или накапливается вне клетки-хозяина и, например, в "окружающей среде", где растет или находится эта клетка-хозяин. В том же контексте перемещение относится к доставке интересующего полипептида в периплазматическое пространство.

Термины "полипептид" и "белок" в данной заявке используют взаимозаменяемо и в целом относят к полимеру аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, и не ограничивают минимальной длиной продукта. Таким образом, пептиды, олигопептиды, полипептиды, димеры (гетеро- и гомо-), мультимеры (гетеро- и гомо-) и тому подобное включены в это определение. Этим определением охвачены как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Эти термины также включают модификации полипептида после экспрессии, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.д. Кроме того, для целей настоящего изобретения эти термины также относят к модификациям, которые включают делеции, добавления и замены (например, консервативные по природе), в последовательности нативного белка или полипептида.

Термин "пептид", как используют в данной заявке, предпочтительно относится к полипептиду, как используют в данной заявке, состоящему по существу из ≤50 аминокислот, например ≤45 аминокислот, предпочтительно ≤40 аминокислот, например ≤35 аминокислот, более предпочтительно ≤30 последовательных аминокислот, например ≤25, ≤20, ≤15, ≤10 или ≤5 аминокислот.

Как используют в данной заявке, термин "гетерологичный полипептид" относится к полипептиду, который в природе не встречается в клетке-хозяине. Термин "гомологичный полипептид" относится к полипептиду, нативному или встречающемуся в природе в клетке-хозяине. В одной форме осуществления изобретение включает клетки-хозяева, продуцирующие гомологичный полипептид посредством технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантный белок относится к любому белку, кодируемому полинуклеиновой кислотой, которая введена в хозяина.

Термины "полинуклеиновая кислота" и "нуклеиновая кислота" в данной заявке используют взаимозаменяемо и в целом относят к полимеру любой длины, состоящему по существу из нуклеотидов, например дезоксирибонуклеотидов и/или рибонуклеотидов. Нуклеиновые кислоты могут содержать пуриновые и/или пиримидиновые основания, и/или другие природные, химически или биохимически модифицированные (например, метилированные), неприродные или производные нуклеотидные основания. Структура нуклеиновых кислот может включать сахара и фосфатные группы, которые можно типично обнаружить в ДНК или РНК, и/или один или более чем один модифицированный или замещенный (такой, как 2'-O-алкилированный, например 2'-O-метилированный или 2'-О-этилированный; либо 2'-O,4'-С-алкинилированный, например, 2'-O,4'-С-этилированный) сахар или одну или более чем одну модифицированную или замещенную фосфатную группу. Например, структурные аналоги нуклеиновых кислот могут включать фосфодиэфирные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, метилфосфонатные, фосфорамидатные, алкилфосфотриэфирные, сульфаматные, 3'-тиоацеталевые, метиленовые (метилимино), 3'-N-карбаматные, морфолинокарбаматные и пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК).

Термин "полинуклеиновая кислота" более конкретно включает ДНК, РНК и гибридные молекулы ДНК/РНК, конкретно включающие ПпРНК, пре-мРНК, мРНК, кДНК, геномную ДНК, ген, продукты амплификации, олигонуклеотиды и синтетические (например, химически синтезированные) ДНК, РНК или гибриды ДНК/РНК. Термины "рибонуклеиновая кислота" и "РНК", как используют в данной заявке, означают полимер любой длины, состоящий из рибонуклеотидов. Термины "дезоксирибонуклеиновая кислота" и "ДНК", как используют в данной заявке, означают полимер любой длины, состоящий из дезоксирибонуклеотидов. Термин "гибрид ДНК/РНК", как используют в данной заявке, означают полимер любой длины, состоящий из одного или более чем одного из дезоксирибонуклеотидов и одного или более чем одного из рибонуклеотидов.

Нуклеиновая кислота может быть встречающейся в природе, например присутствующей или выделенной из природы, может быть рекомбинантной, то есть полученной посредством технологии рекомбинантных ДНК, и/или может быть частично или полностью химически или биохимически синтезированной. Нуклеиновая кислота может быть двунитевой, частично двунитевой или однонитевой. Где нуклеиновая кислота является однонитевой, она может представлять собой смысловую нить или антисмысловую нить. Кроме того, нуклеиновая кислота может быть кольцевой или линейной.

Термин "олигонуклеотид", как используют в данной заявке, обозначает однонитевые нуклеиновые кислоты (нуклеотидные мультимеры) более чем 2 нуклеотида в длину и предпочтительно вплоть до 200 нуклеотидов в длину, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 100 нуклеотидов в длину, даже более предпочтительно от примерно 12 до примерно 50 нуклеотидов в длину. Олигонуклеотиды могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники, например путем химического или биохимического синтеза, например твердофазного фосфорамидитного химического синтеза, либо путем экспрессии in vitro или in vivo с рекомбинантных молекул нуклеиновой кислоты, например бактериальных или ретровирусных векторов.

Как используют в данной заявке, "рекомбинантная нуклеиновая кислота" представляет собой молекулу, где молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует интересующий полипептид, модифицирована in vitro, так что ее последовательность не является встречающейся в природе или соответствует встречающимся в природе последовательностям, которые не расположены так, как были бы расположены в геноме, который не модифицирован.

Термин "сигнальная последовательность", или "секреторная сигнальная последовательность", или "секреторный сигнальный пептид" или "сигнальный пептид" означает полипептид, который в виде компонента полипептида большего размера направляет этот полипептид большего размера через секреторный биохимический путь клетки-хозяина, в которой он синтезируется. Полипептид большего размера обычно расщепляется с удалением секреторного сигнального пептида в процессе прохождения через секреторный биохимический путь. Таким образом, когда сигнальный пептид слит с амино-концом гетерологичного белка, он направляет этот белок в секреторный аппарат клетки-хозяина. Затем гетерологичный белок перемещается через мембрану, и специфичная протеаза, иногда называемая "сигнальной пептидазой", удаляет сигнальный пептид и высвобождает белок, в настоящем случае слитый белок в соответствии с изобретением.

Термин "целлюлосомный поддерживающий белок" или "скаффолдин", как используют в данной заявке, следует относить к поддерживающему белку, содержащемуся в целлюлосоме. "Целлюлосомы" представляют собой внеклеточные мультиферментные комплексы, которые присутствуют у некоторых целлюлолитических микроорганизмов и содержат множественные копии ферментов, требуемых для расщепления углеводов. В частности, целлюлосомы состоят из поддерживающего белка, который присоединен к различным целлюлазам, гемицеллюлазам и пектиназам, которые действуют синергически по расщеплению комплексных молекул клеточной стенки, этот комплекс дает возможность организмам очень эффективно расщеплять клеточные стенки растений. Эти поддерживающие белки приводят в контакт различные другие белки в биохимическом пути передачи сигнала и дают возможность их взаимодействия.

Термин "сайт расщепления протеазы" или "последовательность-мишень протеазы", которая содержится внутри последовательности полипептидного линкера, как определено в данной заявке, относится к аминокислотной последовательности, которая может распознаваться специфичными протеазами. Расщепление в этом сайте приводит в результате к высвобождению интересующего полипептида. Следует отметить, что линкерный полипептид может представлять собой любой синтетический полипептид, содержащий сайт расщепления протеазы, если расщепление в этом сайте приводит в результате к удалению оставшихся доменов из интересующего полипептида. Подходящие последовательности-мишени протеазы, которые можно использовать в полинуклеиновых кислотах, кодирующих слитые белки, как описано в данной заявке, включают, но не ограничены ими, последовательности, которые могут распознаваться сериновыми протеазами, такими как плазмин, тромбин, фактор Ха или трипсин.

Как используют в данной заявке, термин "домен-носитель" или "модуль-носитель" следует относить к полипептидной последовательности, с которой может быть слит функциональный домен в соответствии с настоящим изобретением. Термин "функциональный домен" или "функциональный модуль" используют в данной заявке для отнесения к полипептидной последовательности, содержащей интересующий полипептид, который должен продуцироваться и секретироваться в соответствии с настоящим изобретением. Слияние между этим доменом-носителем и функциональным доменом можно осуществить посредством линкерного модуля.

Выражение "по меньшей мере один" в контексте настоящего изобретения означает по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть и т.д. и вплоть до по меньшей мере десяти, а также включает один.

2. Нуклеотидные последовательности

В первом аспекте изобретение относится к полинуклеиновой кислоте, кодирующей слитый белок для облегчения продуцирования и секреции интересующего полипептида клеткой-хозяином, предпочтительно бактериальной клеткой-хозяином, а также к ее различным применениям. Конкретно обнаружено, что полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, как определено в данной заявке, дает возможность эффективного продуцирования полипептидов клеткой-хозяином и их внеклеточной доставки.

В конкретных формах осуществления в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает:

- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним модулем Х или гидрофильным модулем целлюлосомного поддерживающего белка;

- по меньшей мере один интересующий полипептид, и

- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом.

В следующих конкретных формах осуществления в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает:

- подходящий секреторный сигнальный пептид;

- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним модулем Х или гидрофильным модулем целлюлосомного поддерживающего белка;

- по меньшей мере один интересующий полипептид, и

- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом.

В конкретных формах осуществления в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает:

i) по меньшей мере один подходящий секреторный сигнальный пептид,

ii) по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка,

iii) по меньшей мере один модуль Х или гидрофильный модуль целлюлосомного поддерживающего белка, который слит с СВМ (ii),

iv) по меньшей мере один интересующий полипептид