Способы, относящиеся к модифицированным гликанам

Способы, относящиеся к модифицированным гликанам

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/139224, поданной 19 декабря 2008, полное раскрытие которой включено сюда с помощью ссылки.

Предпосылки изобретения

Модификации на гликоконъюгате (например, гликопротеине) до гликанов часто значительно воздействуют на функцию гликоконъюгата. Например, гликановые модификации могут воздействовать на способность гликопротеина правильно сворачиваться, на стабильность (например, устойчивость к протеолитическому и/или другому распаду), каталитическую активность, фармакодинамические и/или фармакокинетические свойства и/или взаимодействие с другими молекулами. Гликановые модификации гликопротеина могут воздействовать на транспорт и направленность гликопротеина. Например, гликановые модификации гликопротеина могут воздействовать на то, остается ли гликопротеин внутриклеточным (включая, например, правильную направленность гликопротеина в правильный субклеточный компартмент или компартменты), будет ли гликопротеин мембраносвязанным и/или будет ли гликопротеин секретироваться клеткой.

Краткое описание изобретения

Гликаны зачастую модифицируют с помощью сиалирования, то есть путем присоединения сиаловой кислоты. Необычные модификации до гликанов, такие как сульфатация, фосфорилирование и полиацетилированное сиалирование (например, диацетилированное сиалирование), часто не выявляют при анализе гликопротеинов. Такие модификации могут быть не выявлены, по меньшей мере, частично из-за сложности их анализа и нестабильности таких модификаций. Данное раскрытие включает подтверждение того, что необычные модификации являются, тем не менее, биологически значимыми и что способы их определения и количественной оценки являются необходимыми.

Среди прочего, данное раскрытие обеспечивает способы обогащения, определения, обнаружения и/или количественной оценки необычно модифицированных гликанов. Во многих вариантах осуществления способы включают обеспечение препарата гликана, из которого были выделены сиаловые кислоты (например, обработанный сиалидазой препарат гликана). Этот препарат включает гликаны (т.е., устойчивые к сиалидазе гликаны), которые не отщепились под действием обработки, выделяющей сиаловые кислоты. Предложенные способы типично включают подвергание предоставленного препарата гликана методу разделения, который отделяет гликаны, имеющие первый заряд, от незаряженных гликанов и/или гликанов, имеющих второй заряд, и/или который отделяет гликаны на основании их отношения заряда к массе; и необязательно количественную оценку разделенных гликанов. Во многих вариантах осуществления количественная оценка включает применение, по меньшей мере, одного стандарта количественной оценки.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1 показывает структуру иллюстративного N-связанного гликана.

Фигура 2 показывает неограничивающие примеры модифицированных остатков в гликанах: манноза-6-фосфат (M6P) и 6-сульфо-N-ацетилглюкозамин (6-сульфо-GlcNAc). Структура обычной сиаловой кислоты, N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac), показана без дополнительных модификаций для ясности. Ацетилирование обычно присутствует в 5 положении (показано); дополнительное ацетилирование может иметь место в положениях 7, 8 и 9. Как используется здесь, “полиацетилированная” по отношению к сиаловой кислоте касается дополнительного ацетилирования в двух или более из 7, 8 и 9 положений. “Диацетилированная” используется по отношению к сиаловой кислоте для обозначения дополнительного ацетилирования в двух из 7, 8 и 9 положений.

Фигура 3 показывает профиль анионообменной хроматографии-высокоэффективной жидкостной хроматографии (AEX-HPLC) необычно модифицированных видов, полученных из терапевтического гликопротеина эритропоэтина с биологической активностью, полученного из Китайского научного центра, после обработки сиалидазой. Вставка показывает калибровочную кривую с использованием 2-аминобензамид-хитобиозы в качестве внешнего стандарта. Пики, определенные здесь как необычно модифицированные виды, были дополнительно определены как фосфорилированные N-гликаны и сульфатированные гликаны.

Фигура 4 показывает профиль анионообменной хроматографии-высокоэффективной жидкостной хроматографии (AEX-HPLC) необычно модифицированных видов, полученных из второго гликопротеина, представляющего интерес, с биологической активностью, с 97% идентичностью аминокислотной последовательности с терапевтическим гликопротеином эритропоэтина, описанным на Фигуре 3, после обработки сиалидазой. Пики, определенные здесь как необычно модифицированные виды, были дополнительно определены как фосфорилированные N-гликаны и сульфатированные гликаны.

Фигура 5 показывает результаты хроматографического анализа сульфатированных гликанов, полученных из моноклонального анти-EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) антитела, полученного у мыши. Композицию гликанов в пределах пика определяли с помощью масс-спектрометрии. В условных обозначениях, используемых на панели B, например, “5,4,1,0,0+SO3” соответствует HexNAc5, Hex4, Fuc1, NeuAc0, NeuGc0 + один сульфату.

Фигура 6 показывает результаты хроматографического анализа сульфатированных и диацетилированных сиалированных гликанов, полученных из CTLA4-IgG из одного клона (клон 1). Композицию гликанов в пределах пика определяли с помощью масс-спектрометрии.

Фигура 7 показывает результаты хроматографического анализа сульфатированных и диацетилированных сиалированных гликанов, полученных из CTLA4-IgG из двух различных отдельных клонов (клон 2, верхняя панель; клон 3, нижняя панель).

Определения

Ацетил: Как используется здесь, термин “ацетил” (также известный как “этаноил” и часто обозначается как “Ac”) используется здесь для обозначения функциональной группы с химической формулой -COCH₃.

Ацетилированный: Как используется здесь, термин “ацетилированный” означает модифицированный с помощью ковалентного присоединения ацетильной группы. Например, ацетилированный гликан - это гликан, который модифицирован путем ковалентного присоединения одной или более ацетильных групп. Ацетилированный гликан может иметь или не иметь дополнительных модификаций.

Ацетилирование: Как используется здесь, термин “ацетилирование” (также известное в IUPAC номенклатуре как “этаноилирование”) относится к процессу ковалентного присоединения одной или более ацетильных групп к молекуле (например, к гликану).

Приблизительно, около, приближенно: Как используется здесь, термины “приблизительно”, “около” или “приближенно”, как применяется к одному или более значениям, представляющим интерес, относятся к значению, которое сходно с установленным эталонным значением. В определенных вариантах осуществления термины “приблизительно”, “около” или “приближенно” относятся к диапазону значений, который попадает в пределы 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее установленного эталонного значения.

Биологический образец: Термин “биологический образец”, как используется здесь, относится к любому твердому или жидкому образцу, полученному из экскретируемому или из секретируемому любой живой клеткой или организмом, включая, но не ограничиваясь следующим: тканевая культура, образец из биореактора, ткань человека или животного, растения, фрукты, овощи, одноклеточные микроорганизмы (такие как бактерии и дрожжи) и многоклеточные организмы. Например, биологический образец может быть биологической жидкостью, полученной из, например, крови, плазмы, сыворотки, мочи, желчи, семенной жидкости, цереброспинальной жидкости, водянистой влаги или стекловидного тела, или любого секрета тела, транссудата, экссудата (например, жидкости, полученной из места абсцесса или любого другого места инфекции или воспаления), или жидкости, полученной из сустава (например, нормального сустава или сустава, пораженного заболеванием, таким как ревматоидный артрит, остеоартрит, подагра или септический артрит). Биологический образец может также быть, например, образцом, полученным из любого органа или ткани (включая препарат для биопсии или аутопсии), может содержать клетки (либо первичные клетки, либо культивированные клетки), среду, кондиционированную любой клеткой, тканью или органом, клеточную культуру.

Гликопротеин клеточной поверхности: Как используется здесь, термин “гликопротеин клеточной поверхности” относится к гликопротеину, по меньшей мере, часть которого присутствует на внешней поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления гликопротеин клеточной поверхности представляет собой белок, который расположен на клеточной поверхности так, чтобы, по меньшей мере, одна из гликановых структур присутствовала на внешней поверхности клетки.

Гликан клеточной поверхности: “Гликан клеточной поверхности” представляет собой гликан, который присутствует на внешней поверхности клетки. Во многих вариантах осуществления данного раскрытия гликан клеточной поверхности ковалентно связан с полипептидом как часть гликопротеина клеточной поверхности. Гликан клеточной поверхности может также быть связанным с липидом клеточной мембраны.

Нахождение в соответствии: Термин “нахождение в соответствии”, как используется здесь, относится к установлению предсказуемой взаимосвязи между двумя вещами. В вариантах осуществления, описанных здесь, паттерн гликозилирования (или его характеристика) на поверхности клетки коррелирует с паттерном гликозилирования (или его характеристикой) целевого гликоконъюгата (например, гликопротеина), продуцируемого клеткой. Нет необходимости, чтобы коррелированные паттерны (или характеристики) были идентичными друг другу, поскольку один может быть предсказан из другого. Как только корреляция установлена, она может быть записана, например, в письменном протоколе или может быть другим образом зафиксирована на носителе или источнике с памятью (например, машиночитаемом носителе или компьютерном банке памяти или диске). Обнаружение коррелированного паттерна гликозилирования (или его характеристики) может затем включать ссылку на письменную или зафиксированную запись, или на эксперимент сравнения, подтверждающий корреляцию и т.д. Такой эксперимент сравнения может быть проведен одновременно с оценкой паттерна гликозилирования (или его характеристики), или может быть предыдущим или последующим экспериментом.

Диацетилирование: Как используется здесь, термин “диацетилирование” относится к ацетилированию в двух положениях на молекуле, где ацетилирование обычно не обнаруживают. При использовании в отношении модификаций молекул сиаловой кислоты “диацетилирование” относится к ацетилированию в двух положениях в дополнение к ацетилированию в положении 5, которое является типично ацетилированным в сиаловых кислотах. В некоторых вариантах осуществления диацетилирование молекул сиаловой кислоты включает ацетилирование двух из положений 7, 8 и 9 (см. Фигуру 2.)

Гликан: Как известно из уровня техники и используется здесь, “гликаны” представляют собой сахара. Гликаны могут быть мономерами или полимерами остатков сахара, но типично содержат, по меньшей мере, три сахара, и могут быть линейными или разветвленными. Гликан может включать остатки природных сахаров (например, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилнейраминовой кислоты, галактозы, маннозы, фукозы, гексозы, арабинозы, рибозы, ксилозы и т.д.) и/или модифицированных сахаров (например, 2'-фторрибозы, 2'-дезоксирибозы, фосфоманнозы, 6'-сульфо-N-ацетилглюкозамина и т.д.). Термин “гликан” включает гомо- и гетерополимеры остатков сахара. Термин “гликан” также включает гликановый компонент гликоконъюгата (например, гликопротеина, гликолипида, протеогликана и т.д.). Термин также включает свободные гликаны, включая гликаны, которые были отщеплены или выделены другим образом из гликоконъюгата.

Препарат гликана: Термин “препарат гликана”, как используется здесь, относится к набору гликанов, полученных согласно конкретному способу получения. В некоторых вариантах осуществления “препарат гликана” относится к набору гликанов, полученных из препарата гликопротеина (см. определение препарата гликопротеина ниже). В определенных вариантах осуществления препараты гликана содержат устойчивые к сиалидазе гликаны.

Гликоконъюгат: Термин “гликоконъюгат”, как используется здесь, включает все молекулы, в которых, по меньшей мере, одна часть сахара ковалентно связана, по меньшей мере, с одной другой частью. Термин особенно включает все биомолекулы с ковалентно присоединенными частями сахара, включая, например, N-связанные гликопротеины, O-связанные гликопротеины, гликолипиды, протеогликаны и т.д.

Гликоформа: Термин “гликоформа” используется здесь для обозначения конкретной формы гликоконъюгата. То есть, когда одинаковая часть скелета (например, полипептид, липид и т.д.), которая является частью гликоконъюгата, имеет возможность быть связанной с различными гликанами или набором гликанов, то каждый отличающийся вариант гликоконъюгата (т.е., где скелет связан с конкретным набором гликанов) называют “гликоформа”.

Гликолипид: Термин “гликолипид”, как используется здесь, относится к липиду, который содержит одну или более ковалентно связанных частей сахара (т.е. гликанов). Часть(и) сахара может быть в форме моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов и/или полисахаридов. Часть(и) сахара может содержать одну неразветвленную цепь остатков сахара или может состоять из одной или более разветвленных цепей. В определенных вариантах осуществления части сахара могут включать сульфатные и/или фосфатные группы. В определенных вариантах осуществления гликопротеины содержат O-связанные части сахара; в определенных вариантах осуществления гликопротеины содержат N-связанные части сахара.

Гликопротеин: Как используется здесь, термин “гликопротеин” относится к белку, который содержит пептидный скелет, ковалентно связанный с одной или более частями сахара (т.е., гликанами). Как понятно специалистам в данной области техники, пептидный скелет типично содержит линейную цепь аминокислотных остатков. В определенных вариантах осуществления пептидный скелет пересекает клеточную мембрану так, что он содержит трансмембранную часть и внеклеточную часть. В определенных вариантах осуществления пептидный скелет гликопротеина, который пересекает клеточную мембрану, содержит внутриклеточную часть, трансмембранную часть и внеклеточную часть. В определенных вариантах осуществления способы данного раскрытия содержат отщепление гликопротеина клеточной поверхности с помощью протеазы для выделения внеклеточной части гликопротеина или ее части, где такое воздействие по существу не разрушает клеточную мембрану. Часть(и) сахара может быть в форме моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов и/или полисахаридов. Часть(и) сахара может содержать одну неразветвленную цепь остатков сахара или может содержать одну или более разветвленных цепей. В определенных вариантах осуществления части сахара могут включать сульфатные и/или фосфатные группы. Альтернативно или дополнительно, части сахара могут включать ацетил-, гликолил-, пропил- или другие алкил-модификации. Альтернативно или дополнительно, части сахара могут быть модифицированы диацетилированием. В определенных вариантах осуществления гликопротеины содержат O-связанные части сахара; в определенных вариантах осуществления гликопротеины содержат N-связанные части сахара. В определенных вариантах осуществления способы, раскрытые здесь, содержат стадию анализа любого или всех гликопротеинов клеточной поверхности, выделенных фрагментов (например, гликопептидов) гликопротеинов клеточной поверхности, гликанов клеточной поверхности, присоединенных к гликопротеинам клеточной поверхности, пептидных скелетов гликопротеинов клеточной поверхности, фрагментов таких гликопротеинов, гликанов и/или пептидных скелетов и их комбинаций.

Препарат гликопротеина: “Препарат гликопротеина”, как этот термин используется здесь, относится к набору отдельных молекул гликопротеина, который содержит полипептид, имеющий конкретную аминокислотную последовательность (где аминокислотная последовательность включает, по меньшей мере, один сайт гликозилирования) и, по меньшей мере, один гликан, ковалентно присоединенный к, по меньшей мере, одному сайту гликозилирования. Отдельные молекулы конкретного гликопротеина в препарате гликопротеина типично имеют идентичные аминокислотные последовательности, но могут отличаться по занятости, по меньшей мере, одного из сайтов гликозилирования и/или в идентичности гликанов, связанных с, по меньшей мере, одним из сайтов гликозилирования. То есть, препарат гликопротеина может содержать только одну гликоформу конкретного гликопротеина, но более типично содержит множество гликоформ. Различные препараты одного гликопротеина могут отличаться по идентичности присутствующих гликоформ (например, гликоформа, которая присутствует в одном препарате, может отсутствовать в другом) и/или по относительным количествам различных гликоформ. В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы и реагенты для анализа различных препаратов одного гликопротеина (т.е. имеющих идентичную аминокислотную последовательность). В некоторых вариантах осуществления данное изобретение обеспечивает способы и реагенты для анализа препаратов двух (или более) гликопротеинов, чьи аминокислотные последовательности показывают, по меньшей мере, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности или больше.

Гликозидаза: Термин “гликозидаза”, как используется здесь, относится к средству, которое расщепляет ковалентную связь между последовательными сахарами в гликане или между сахаром и частью скелета (например, между сахаром и пептидным скелетом гликопротеина). В некоторых вариантах осуществления гликозидаза представляет собой фермент. В определенных вариантах осуществления гликозидаза представляет собой белок (например, белковый фермент), содержащий одну или более полипептидных цепей. В определенных вариантах осуществления гликозидаза представляет собой химическое средство отщепления.

Паттерн гликозилирования: Как используется здесь, термин “паттерн гликозилирования” относится к набору гликановых структур, присутствующих на конкретном образце. Например, конкретный гликоконъюгат (например, гликопротеин) или набор гликоконъюгатов (например, набор гликопротеинов) будет иметь паттерн гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления говорят о паттерне гликозилирования гликанов клеточной поверхности, или “поверхностном паттерне гликозилирования.” Как используется здесь, “поверхностный паттерн гликозилирования” может относиться к паттерну гликанов (или “паттерну гликозилирования”), который существует на внеклеточном домене одного гликопротеина клеточной поверхности и/или гликолипида клеточной поверхности, представляющих интерес. Дополнительно или альтернативно, “поверхностный паттерн гликозилирования” может относиться к паттерну гликанов (или “паттерну гликозилирования”), который существует на внеклеточном домене множества гликопротеинов клеточной поверхности и/или гликолипидов клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления “поверхностный паттерн гликозилирования” описывает паттерн гликанов (или “паттерн гликозилирования”), который существует на полном комплементе гликопротеинов клеточной поверхности и/или гликолипидов клеточной поверхности. Основываясь на контексте, специалисты в данной области техники смогут без труда понять, относится ли “поверхностный паттерн гликозилирования” к паттерну гликозилирования множества гликопротеинов клеточной поверхности и/или гликолипидов клеточной поверхности. Паттерн гликозилирования может характеризоваться, например, идентичностями гликанов, количествами (абсолютными или относительными) отдельных гликанов или гликанов конкретных типов, степенью занятости сайтов гликозилирования, модификациями гликанов (например, сиалирование, полиацетилированное сиалирование, фосфорилирование, сульфатация, и т.д.) и т.д., или комбинациями таких параметров.

Полиацетилирование: Как используется здесь, термин “полиацетилирование” относится к ацетилированию в двух или более положениях на молекуле, где ацетилирование обычно не обнаруживают. При использовании в отношении модификаций молекул сиаловой кислоты “полиацетилирование” относится к ацетилированию в двух или более положениях в дополнение к ацетилированию в положении 5, которое является типично ацетилированным в сиаловых кислотах. В некоторых вариантах осуществления полиацетилирование молекул сиаловой кислоты включает ацетилирование двух или более из положений 7, 8 и 9 (см. Фигуру 2.)

N-гликан: Термин “N-гликан”, как используется здесь, относится к полимеру сахаров, который был выделен из гликоконъюгата, но ранее был связан с гликоконъюгатом посредством азотного мостика (см. определение N-связанного гликана ниже).

N-связанный гликан: Термин “N-связанный гликан”, как используется здесь, относится к гликану, который связан с гликоконъюгатом посредством азотного мостика. Существует разнообразный набор N-связанных гликанов, но типично он основан на общем коровом пентасахариде (Man)₃(GlcNAc)(GlcNAc).

O-гликан: Термин “O-гликан”, как используется здесь, относится к полимеру сахаров, который был выделен из гликоконъюгата, но ранее был связан с гликоконъюгатом посредством кислородного мостика (см. определение O-связанного гликана ниже).

O-связанный гликан: Термин “O-связанные гликаны”, как используется здесь, относится к гликану, который связан с гликоконъюгатом посредством кислородного мостика. O-связанные гликаны типично присоединены к гликопротеинам посредством N-ацетил-D-галактозамина (GalNAc) или посредством N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc) к гидроксильной группе L-серина (Ser) или L-треонина (Thr). Некоторые O-связанные гликаны также имеют модификации, такие как ацетилирование и сульфатация. В некоторых случаях O-связанные гликаны присоединены к гликопротеинам посредством фукозы или маннозы к гидроксильной группе L-серина (Ser) или L-треонина (Thr).

Фосфат: Как используется здесь, термин “фосфат” используется здесь для обозначения PO₄ ^- группы (в свободном растворе) или PO₃ группы (как часть соединения). В виде части химического названия термин “фосфат” относится к химическому соединению, модифицированному путем добавления фосфатной группы.

Фосфорилированный: Как используется здесь, термин “фосфорилированный” означает модифицированный с помощью ковалентного присоединения фосфатной группы. Например, фосфорилированный гликан - это гликан, который модифицирован путем ковалентного присоединения одной или более фосфорилированных групп. Фосфорилированный гликан может иметь или может не иметь дополнительные модификации.

Фосфорилирование: Как используется здесь, термин “фосфорилирование” относится к способу ковалентного добавления одной или более фосфатных групп к молекуле (например, к гликану).

Протеаза: Термин “протеаза”, как используется здесь, относится к средству, которое расщепляет пептидную связь между последовательными аминокислотами в полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой фермент (т.е., протеолитический фермент). В определенных вариантах осуществления протеаза представляет собой белок (например, белковый фермент), содержащий одну или более полипептидных цепей. В определенных вариантах осуществления протеаза представляет собой химическое средство отщепления.

Белок: В общем, “белок” представляет собой полипептид (т.е., нить, по меньшей мере, из двух аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями). Белки могут включать части, отличные от аминокислот (например, могут быть гликопротеинами) и/или могут быть обработаны или модифицированы другим образом. Специалистам в данной области техники понятно, что “белок” может быть полной полипептидной цепью, такой, которая продуцируется клеткой (с или без сигнальной последовательности), или может быть ее функциональной частью. Специалистам в данной области техники также понятно, что белок может иногда включать более одной полипептидной цепи, например, связанной одной или более дисульфидными связями или ассоциированными другими способами.

Сиаловая кислота: Термин “сиаловая кислота”, как используется здесь, представляет собой общий термин для N- или O-замещенных производных нейраминовой кислоты, девятиуглеводного моносахарида. Аминогруппа нейраминовой кислоты типично несет либо группу ацетила, либо группу гликолила в сиаловой кислоте. Гидроксильные заместители, присутствующие на сиаловой кислоте, могут быть модифицированы с помощью ацетилирования, метилирования, сульфатации и фосфорилирования. Преобладающая сиаловая кислота представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту (Neu5Ac). Сиаловые кислоты придают отрицательный заряд гликанам, так как карбоксильная группа имеет тенденцию диссоциировать протон при физиологическом pH. Иллюстративные депротонированные сиаловые кислоты представлены ниже:

Сиалидаза: Как используется здесь, термин “сиалидаза” относится к средству, которое отщепляет остатки сиаловой кислоты от гликанов. В некоторых вариантах осуществления сиалидаза представляет собой фермент. В определенных вариантах осуществления сиалидаза представляет собой белок (например, белковый фермент), содержащий одну или более полипептидных цепей. В определенных вариантах осуществления сиалидаза представляет собой химическое средство отщепления; в некоторых таких вариантах осуществления сиалидаза представляет собой слабую кислоту.

Устойчивый к сиалидазе: Как используется здесь, термин “устойчивый к сиалидазе”, при использовании в отношении гликанов, описывает характеристику, по существу, устойчивости к отщеплению с помощью обработки сиалидазой, как определено здесь. Например, гликаны, которые являются устойчивыми к сиалидазе, могут не содержать сиалидазных модификаций. Дополнительно или альтернативно, устойчивые к сиалидазе гликаны могут содержать модификации, которые не могут быть, по существу, отщеплены с помощью обработки сиалидазой. Примеры таких модификаций включают сульфатацию, фосфорилирование и/или полиацетилированное сиалирование. Как используется здесь, “устойчивые к сиалидазе” гликаны включают гликаны, которые содержат как модификации сиаловой кислоты, так и другие модификации, которые не могут быть, по существу, отщеплены с помощью обработки сиалидазой. Например, молекула гликана как с модификациями сиаловой кислоты, так и фосфорилированием, является устойчивой к сиалидазе.

Обработка сиалидазой: Как используется здесь, “обработка сиалидазой” относится к обработке средством при приемлемых условиях, чтобы обеспечить расщепление существенной части связей остатков сиаловой кислоты. В некоторых вариантах осуществления обработка сиалидазой приводит к выделению сиаловых кислот из молекул, таких как гликаны. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой полипептид фермента, такой как полипептид сиалидаза. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой химическое средство, такое как слабая кислота или комбинация слабых кислот. В некоторых вариантах осуществления комбинация средств, которые имеют сиалидазную активность, используется в обработке сиалидазой. Соответственно, “обработанный сиалидазой” образец, такой как, например, обработанный сиалидазой препарат гликана, подвергался обработке средством при таких условиях, чтобы обеспечить расщепление существенной части связей остатков сиаловой кислоты.

По существу: Как используется здесь, термин “по существу” относится к качественному условию проявления полной или почти полной величины или степени характеристики или свойства, представляющего интерес. Специалист в биологической области техники поймет, что биологические и химические явления редко, если вообще, идут до завершения и/или продолжаются до завершенности или достигают или избегают абсолютного результата. Термин “по существу”, таким образом, используется здесь для отражения потенциального отсутствия завершенности, присущей многим биологическим и химическим явлениям. Чтобы предоставить один конкретный пример, когда говорят, что обработка “по существу” не разрушила клеточные мембраны, то это означает, что все или почти все клеточные мембраны остались интактными в ходе и после обработки, например, так что внутриклеточные гликопротеины или гликопептиды, таким образом, не высвободились из клеток. В определенных вариантах осуществления термин “по существу”, как применяется к неразрушенным клеточным мембранам, относится к условию, где 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее клеток, подвергшихся конкретной обработке, демонстрируют заметно разрушенные клеточные мембраны. В определенных вариантах осуществления термин “по существу”, как применяется к не разрушенным клеточным мембранам, относится к условию, где ни одна из клеток, подвергшихся конкретной обработке, не демонстрирует заметно разрушенные клеточные мембраны.

Сульфат: Как используется здесь, термин “сульфат” используется здесь для обозначения SO₄ ^- группы (в свободном растворе) или SO₃ группы (как часть соединения). Как часть химического названия термин “сульфат” относится к химическому соединению, модифицированному путем добавления сульфатной группы.

Сульфатированный: Как используется здесь, термин “сульфатированный” означает модифицированный с помощью ковалентного присоединения сульфатной группы. Например, сульфатированный гликан представляет собой гликан, который модифицирован путем ковалентного присоединения одной или более сульфатных групп. Сульфатированный гликан может иметь или не иметь дополнительные модификации.

Сульфатация: Как используется здесь, термин “сульфатация” относится к способу ковалентного добавления одной или более сульфатных групп к молекуле (например, к гликану).

Необычные модификации: Как используется здесь, термин “необычные модификации”, когда используются в отношении модификаций гликанов, относятся к модификациям, отличным от сиалирования без модификаций сиаловых кислот, отличным от ацетилирования в 5 положении. Неограничивающие примеры необычных модификаций включают фосфорилирование, сульфатацию и полиацетилированное сиалирование. Например, остатки маннозы могут быть фосфорилированы в C-6 положении, остатки N-ацетилглюкозамина могут быть сульфатированы в C-6 положении, остатки сиаловой кислоты могу быть ацетилированы в двух из 7, 8 и 9 положений в дополнение к тому, что они ацетилированы в обычном 5 положении и т.д.

Подробное описание определенных предпочтительных вариантов осуществления

Как описывается здесь, данное раскрытие относится к способам обогащения, определения, обнаружения и/или количественной оценки необычно модифицированных гликанов в смеси. В общем, необычно модифицированные гликаны содержат модификации, отличные от сиалирования, которые обеспечивают заряд на гликанах. В некоторых вариантах осуществления заряд представляет собой отрицательный заряд. Примеры необычных модификаций включают фосфорилирование, сульфатацию, полиацетилированное сиалирование или их комбинацию. Во многих вариантах осуществления способы содержат стадии, на которых обеспечивают препарат гликана, из которого были выделены сиаловые кислоты; подвергают препарат гликана методу разделения, который разделяет гликаны на основе отношения заряда к массе; и проводят количественную оценку, по меньшей мере, одного разделенного гликана. Во многих вариантах осуществления такая количественная оценка включает использование, по меньшей мере, одного стандарта количественной оценки.

I. Препараты гликана, из которых были выделены сиаловые кислоты

В общем, препараты гликана обеспечивают путем получения материала из источника гликанов и обработки материала. Термин “препарат гликана”, как используется здесь, типично относится к материалу, содержащему гликаны после того, как материал подвергся обработке для выделения гликанов. Во многих вариантах осуществления препараты гликана также подвергаются обработке и/или способу для выделения сиаловых кислот из препарата. В некоторых вариантах осуществления обработка для выделения сиаловых кислот содержит обработку сиалидазой, как описывается здесь. Препараты гликана, которые также подверглись обработке сиалидазой, здесь называют “обработанные сиалидазой препараты гликана”. Термин “обработанный сиалидазой препарат гликана”, как используется здесь, включает материал, который подвергся обработке в дополнение к описанной обработке.

Гликаны могут быть получены из различных источников, как обсуждается ниже. Для того чтобы облегчить лучшее понимание предложенных способов, предлагается описание гликанов и гликоконъюгатов.

A. Гликаны и гликоконъюгаты

В общем, гликан относится к углеводной части, которая в некоторых вариантах осуществления ковалентно прикреплена к гликопротеину. Углеводные части (например, олигосахаридные цепи) связаны с гликопротеинами в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи посредством либо N-мостиков, либо O-мостиков. Данное раскрытие включает распознавание, которое является благоприятным для определения необычных модификаций (таких, как фосфорилирование) гликанов (например, гликанов, которые конъюгированы с полипептидами в гликопротеинах). Способы, описанные здесь, могут быть использованы для анализа необычных модификаций (например, количества в препарате гликана, химической природы модификации и т.д.) любого гликана. Способы могут альтернативно или дополнительно быть использованы для обогащения необычно модифицированными видами гликанов.

1. N-связанные гликаны

Типично, N-связанные олигосахаридные цепи присоединяются к гликопротеинам в просвете эндоплазматического ретикулума (см. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 1994, включенную сюда с помощью ссылки). Углеводные части присоединяются к аминогруппе на боковой цепи аспарагинового остатка, который содержится в целевой консенсусной последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина. Начальная олигосахаридная цепь обычно обрезается специфическими ферментами гликозидазами в эндоплазматическом ретикулуме, давая в результате короткий, разветвленный коровый олигосахарид, состоящий из двух остатков N-ацетилглюкозамина и трех остатков маннозы.

N-связанные гликаны и N-гликаны могут быть подразделены на три отдельные группы, имеющие названия “тип с высоким содержанием маннозы”, “гибридный тип” и “сложный тип” с общим пентасахаридным кором (Manp(α1,6)-(Manp(α1,3))-Manp(β1,4)-GlcpNAc(β1,4)- GlcpNAc(β1,N)-Asn), наблюдающимся во всех трех группах. Модификации кора включают, например, дополнительное гликозилирование, обеспечивающее деление пополам GlcNAc, прикрепление фукозильного остатка к наиболее глубокому GlcNAc и кэппирование остатками сиаловой кислоты (Neu). Иллюстративная структура N-связанного гликана изображена на Фигуре 1. Как показано на Фигуре 1, структурный вариант N-связанных гликанов главным образом находится относительно (до) 4 антенн на левой стороне N-связанных гликанов, изображенных на Фигуре 1. N-связанные гликаны, главным образом, обнаруживают как компоненты пептидов (т.е., гликопептида) и белков (т.е., гликопротеина).

После начального процессинга в эндоплазматическом ретикулуме гликопротеины затем транспортируются на аппарат Гольджи, где может иметь место дополнительный процессинг. Обрезанные N-связанные олигосахаридные це