Модифицированная константная область антитела

Модифицированная константная область антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к константным областям антител, имеющим улучшенные физико-химические свойства (стабильность и гомогенность), иммуногенность (антигенность) и безопасность, и/или время полужизни в плазме, и антителам, включающим указанные константные области.

Предпосылки создания изобретения

В качестве лекарственных средств антитела привлекают к себе внимание, поскольку они в высокой степени стабильны в плазме (крови) и имеют немногочисленные неблагоприятные эффекты. Из них в продаже имеется ряд лекарственных средств - антител типа IgG, и множество антител - лекарственных средств - разрабатывается в настоящее время (непатентный документ 1 и 2).

Почти все имеющиеся в настоящее время в продаже антитела - лекарственные средства - являются антителами подкласса IgG1. Предполагается, что антитела типа IgG1 полезны в качестве противораковых лекарственных средств - антител, поскольку они связываются с рецептором Fcγ и вызывают активность ADCC (антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность). Однако связывание Fc-домена с рецептором Fcγ, которое является важным для такой эффекторной функции, как ADCC, может вызывать ненужные неблагоприятные эффекты, и поэтому из антител - лекарственных средств, предназначенных для нейтрализации биологической активности, предпочтительно исключить такую активность связывания (непатентный документ 3). Кроме того, поскольку рецептор Fcγ экспрессируется в антигенпрезентирующих клетках, связывающиеся с рецептором Fcγ молекулы проявляют тенденцию к представленности в качестве антигенов. Сообщалось, что иммуногенность усиливается и может усиливаться при связывании белка или пептида с Fc-доменом IgG1 (непатентный документ 4 и патентный документ 1). Полагают, что взаимодействие между Fc-доменом антитела и рецептором Fcγ является причиной серьезных неблагоприятных эффектов, с которыми столкнулись в клинических испытаниях фазы I TGN1412 (непатентный документ 5). Следовательно, в антителах - лекарственных средствах, предназначенных для нейтрализации биологической активности антигена, связывание с рецептором Fcγ считается вредным ввиду неблагоприятного эффекта и иммуногенности.

Способом ослабления связывания с рецептором Fcγ является смена подтипа антитела IgG с IgG1 на IgG2 или IgG4; однако этот способ не способен полностью ингибировать связывание (непатентный документ 6). Одним из опубликованных способов полного ингибирования связывания с рецептором Fcγ является искусственное изменение Fc-домена. Например, следствием эффекторных функций антител против CD3 и антител против CD4 являются неблагоприятные эффекты. Поэтому в связывающийся с рецептором Fcγ Fc-домен были введены аминокислоты, которые не присутствуют в последовательности дикого типа (WT) (непатентные документы 3 и 7), и в настоящее время проводятся клинические испытания для оценки антител против CD3, которые не связываются с рецептором Fcγ, и антител против CD4, которые имеют мутированный Fc-домен (непатентные документы 5 и 8). В альтернативном случае не связывающиеся с рецептором Fcγ (FcγR) антитела можно приготовить путем смены связывающегося с FcγR домена IgG1 (в положениях 233, 234, 235, 236, 327, 330 и 331 в Европейской системе нумерации) на последовательность домена IgG2 или IgG4 (непатентный документ 9 и патентный документ 2). Однако эти молекулы содержат новые неприродные пептидные последовательности из девяти-двенадцати аминокислот, которые могут быть пептидным Т-клеточным эпитопом и, следовательно, создавать угрозу возникновения иммуногенности. Нет предшествующего сообщения о не связывающихся с рецептором Fcγ антителах, для которых преодолены эти проблемы.

Между тем физико-химические свойства белков - антител, в частности гомогенность и стабильность, очень важны при разработке антител - лекарственных средств. Для подтипа IgG2 сообщалось о гетерогенности, возникшей в результате дисульфидных связей в шарнирной области (непатентный документ 10 и патентный документ 3). Нелегко произвести их в качестве лекарственного средства в крупном масштабе, пока между производствами сохраняется связанная с целевыми веществами/родственными веществами гетерогенность. Поэтому для молекул антител, разрабатываемых в качестве лекарственных средств, желательны, насколько возможно, единые вещества.

IgG2 и IgG4 являются неустойчивыми в кислотных условиях. Антитела типа IgG, как правило, подвергаются воздействию кислотных условий в процессе очистки с использованием белка A и в процессе инактивации вируса. Поэтому требуется внимание в отношении стабильности IgG2 и IgG4 во время этих процессов, и предпочтительно, когда молекулы антител, разработанные в качестве лекарственных средств, являются также устойчивыми в кислотных условиях. Такие проблемы свойственны природным IgG2 и IgG4 и не связывающимся с рецептором Fcγ антителам, происходящим из IgG2 или IgG4 (непатентные документы 6 и 7 и патентный документ 2). При разработке антител в лекарственные средства желательным является разрешение этих проблем.

Антитела типа IgG1 относительно устойчивы в кислотных условиях, и в этом типе антител также низка степень гетерогенности, возникшей в результате дисульфидных связей в шарнирной области. Однако имеется сообщение, что в шарнирной области антител типа IgG1 пептидные связи подвергаются неферментативному расщеплению в растворах при хранении этих антител в виде композиций, и в результате в качестве примесей образуются Fab-фрагменты (непатентный документ 11). При разработке антител в лекарственные средства желательным является ослабление образования примеси.

Кроме того, сообщалось (непатентный документ 12) о делеции C-концевого остатка аминокислоты лизина и подавлении амидирования C-концевой аминогруппы вследствие делетирования обеих из двух C-концевых аминокислот, глицина и лизина, для исключения гетерогенности C-концевой последовательности антитела. При разработке антител в лекарственные средства исключение такой гетерогенности является предпочтительным.

Предпочтительно константная область антитела - лекарственного средства, направленного на нейтрализацию антигена, имеет последовательность, которая преодолевает все описанные выше проблемы. Однако о константной области, удовлетворяющей всем указанным требованиям, еще не сообщалось.

Полагают, что предпочтительной формой введения антитела - лекарственного средства - является подкожное введение композиции при хронических аутоиммунных заболеваниях и подобных. Недорогие, подходящие антитела - лекарственные средства, которые можно вводить подкожно с более длительными интервалами, можно обеспечить путем увеличения времени полужизни антитела в плазме для пролонгирования его терапевтического эффекта и тем самым уменьшения вводимого количества белка, и путем придания антителу высокой стабильности, так что можно приготовить композиции с высокими концентрациями.

Как правило, необходимо, чтобы подкожные композиции были композициями с высокими концентрациями. В плане стабильности или подобного, как правило, считают, что концентрационный предел композиций антител типа IgG составляет приблизительно 100 мг/мл (непатентный документ 13). Следовательно, обеспечение стабильности при высокой концентрации является проблемой. Однако не опубликовано сообщение о повышении стабильности IgG при высоких концентрациях путем введения замен аминокислот в его константную область. Сообщалось о способе увеличения времени полужизни антитела в плазме, и в этом способе замещаются аминокислоты в константной области (непатентные документы 14 и 15); однако введение не встречающихся в природе последовательностей в константную область не является предпочтительным ввиду угрозы возникновения иммуногенности.

Как описано выше, когда антитело - лекарственное средство - предназначено для нейтрализации антигена, предпочтительно, когда преодолены все описанные выше проблемы в отношении последовательности константной области. Однако о константной области, удовлетворяющей всем указанным требованиям, еще не сообщалось. Таким образом, существуют потребности в константных областях антител, в отношении которых преодолены описанные выше проблемы.

Ниже приведены документы известного уровня техники, соответствующего настоящему изобретению.

[Непатентный документ 1] Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz. Monoclonal antibody successes in the clinic. Nature Biotechnology (2005) 23, 1073-1078

[Непатентный документ 2] Pavlou AK, Belsey MJ. The therapeutic antibodies market to 2008. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2005 Apr; 59(3): 389-96

[Непатентный документ 3] Reddy MP, Kinney CA, Chaikin MA, Payne A, Fishman-Lobell J, Tsui P, Dal Monte PR, Doyle ML, Brigham-Burke MR, Anderson D, Reff M, Newman R, Hanna N, Sweet RW, Truneh A. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J. Immunol. 2000 Feb 15; 164(4): 1925-33

[Непатентный документ 4] Guyre PM, Graziano RF, Goldstein J, Wallace PK, Morganelli PM, Wardwell K, Howell AL. Increased potency of Fc-receptor-targeted antigens. Cancer Immunol. Immunother. 1997 Nov-Dec; 45(3-4): 146-8

[Непатентный документ 5] Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned, future directions. Nat. Rev. Drug Discov. 2007 Jan; 6(1):75-92

[Непатентный документ 6] Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann. Hematol. 1998 Jun; 76(6): 231-48

[Непатентный документ 7] Cole MS, Anasetti C, Tso JY. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells. J. Immunol. 1997 Oct 1; 159(7): 3613-21

[Непатентный документ 8] Chau LA, Tso JY, Melrose J, Madrenas J. HuM291 (Nuvion), a humanized Fc receptor-nonbinding antibody against CD3, anergizes peripheral blood T cells as partial agonist of the T cell receptor. Transplantation 2001 Apr 15; 71(7): 941-50

[Непатентный документ 9] Armour KL, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur. J. Immunol. 1999 Aug; 29(8): 2613-24

[Непатентный документ 10] Chu GC, Chelius D, Xiao G, Khor HK, Coulibaly S, Bondarenko PV. Accumulation of Succinimide in a Recombinant Monoclonal Antibody in Mildly Acidic Buffers Under Elevated Temperatures. Pharm. Res. 2007 Mar 24; 24(6): 1145-56

[Непатентный документ 11] AJ Cordoba, BJ Shyong, D Breen, RJ Harris. Nonenzymatic hinge region fragmentation of antibodies in solution. J. Chromatogr. B. Anal. Technol. Biomed. Life Sci. (2005) 818, 115-121

[Непатентный документ 12] Johnson KA, Paisley-Flango K, Tangarone BS, Porter TJ, Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal. Biochem. 2007 Jan 1; 360(1): 75-83

[Непатентный документ 13] Shire SJ, Shahrokh Z, Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J. Pharm. Sci. 2004 Jun; 93(6): 1390-402

[Непатентный документ 14] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N. An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life. J. Immunol. 2006 Jan 1; 176(1): 346-56

[Непатентный документ 15] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES. Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis. Nat. Biotechnol. 1997 Jul; 15(7): 637-40

[Патентный документ 1] US 20050261229A1

[Патентный документ 2] WO 99/58572

[Патентный документ 3] US 2006/0194280

Описание изобретения

Проблемы, решаемые настоящим изобретением

Настоящее изобретение было успешно создано ввиду указанных выше фактов. Целью настоящего изобретения является предоставление константных областей антител, которые имеют улучшенные физико-химические свойства (стабильность и гомогенность), иммуногенность, безопасность и фармакокинетику (сохранение в плазме (крови)) с помощью изменения аминокислот.

Способ разрешения проблем

Авторы настоящего изобретения провели специальные исследования для создания константных областей антител, которые улучшены благодаря изменению их аминокислотных последовательностей и имеют улучшенные физико-химические свойства (стабильность и гомогенность), иммуногенность, безопасность и фармакокинетику. В результате авторы настоящего изобретения с успехом улучшили константную область антитела так, что она имела повышенную устойчивость в кислотных условиях, сниженную гетерогенность, возникающую в результате дисульфидных связей в шарнирной области, сниженную гетерогенность, возникающую из С-конца тяжелой цепи, и повышенную стабильность при высоких концентрациях, а также обнаружили новые последовательности константных областей, имеющие ослабленную активность связывания с рецептором Fcγ, при минимизации создания новых пептидных T-клеточных эпитопов.

Настоящее изобретение относится к константным областям антител, которые лучше по показателям безопасности, угрозы возникновения иммуногенности, физико-химических свойств (стабильности и гомогенности) и фармакокинетики благодаря улучшению с помощью изменения аминокислот; антителам, включающим такую константную область антитела; фармацевтическим композициям, включающим такое антитело; и способам их получения. Конкретнее, настоящим изобретением предоставляются:

[1] константная область антитела человека, выбираемая из:

(a) константной области антитела человека, которая включает как делецию Gly в положении 329 (положении 446 в Европейской системе нумерации, смотри последовательности представляющих иммунологический интерес белков, публикацию NIH № 91-3242), так и делецию Lys в положении 330 (положении 447 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1;

(b) константной области антитела человека, которая включает как делецию Gly в положении 325 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 326 (положении 447 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и

(c) константной области антитела человека, которая включает как делецию Gly в положении 326 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 327 (положении 447 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3;

[2] константная область IgG2, в которой аминокислоты в положениях 209 (положении 330 в Европейской системе нумерации), 210 (положении 331 в Европейской системе нумерации) и 218 (положении 339 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[3] константная область IgG2, в которой аминокислота в положении 276 (положении 397 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменена другой аминокислотой;

[4] константная область IgG2, в которой аминокислоты в положениях 14 (положении 131 в Европейской системе нумерации), 102 (положении 219 в Европейской системе нумерации) и/или 16 (положении 133 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[5] константная область IgG2 в соответствии с [4], в которой аминокислоты в положениях 20 (положении 137 в Европейской системе нумерации) и 21 (положении 138 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[6] константная область IgG2, в которой His в положении 147 (положении 268 в Европейской системе нумерации), Arg в положении 234 (положении 355 в Европейской системе нумерации) и/или Gln в положении 298 (положении 419 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[7] константная область IgG2, в которой аминокислоты в положениях 209 (положении 330 в Европейской системе нумерации), 210 (положении 331 в Европейской системе нумерации), 218 (положении 339 в Европейской системе нумерации), 276 (положении 397 в Европейской системе нумерации), 14 (положении 131 в Европейской системе нумерации), 16 (положении 133 в Европейской системе нумерации), 102 (положении 219 в Европейской системе нумерации), 20 (положении 137 в Европейской системе нумерации), и 21 (положении 138 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[8] константная область IgG2 в соответствии с [7], которая дополнительно включает как делецию Gly в положении 325 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 326 (положении 447 в Европейской системе нумерации);

[9] константная область IgG2, в которой аминокислоты в положениях 276 (положении 397 в Европейской системе нумерации), 14 (положении 131 в Европейской системе нумерации), 16 (положении 133 в Европейской системе нумерации), 102 (положении 219 в Европейской системе нумерации), 20 (положении 137 в Европейской системе нумерации) и 21 (положении 138 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[10] константная область IgG2 в соответствии с [9], которая дополнительно включает как делецию Gly в положении 325 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 326 (положении 447 в Европейской системе нумерации);

[11] константная область IgG2, в которой Cys в положении 14 (положении 131 в Европейской системе нумерации), Arg в положении 16 (положении 133 в Европейской системе нумерации), Cys в положении 102 (положении 219 в Европейской системе нумерации), Glu в положении 20 (положении 137 в Европейской системе нумерации), Ser в положении 21 (положении 138 в Европейской системе нумерации), His в положении 147 (положении 268 в Европейской системе нумерации), Arg в положении 234 (положении 355 в Европейской системе нумерации) и Gln в положении 298 (положении 419 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[12] константная область IgG2 в соответствии с [11], которая дополнительно включает как делецию Gly в положении 325 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 326 (положении 447 в Европейской системе нумерации);

[13] константная область IgG2, в которой Cys в положении 14 (положении 131 в Европейской системе нумерации), Arg в положении 16 (положении 133 в Европейской системе нумерации), Cys в положении 102 (положении 219 в Европейской системе нумерации), Glu в положении 20 (положении 137 в Европейской системе нумерации), Ser в положении 21 (положении 138 в Европейской системе нумерации), His в положении 147 (положении 268 в Европейской системе нумерации), Arg в положении 234 (положении 355 в Европейской системе нумерации), Gln в положении 298 (положении 419 в Европейской системе нумерации) и Asn в положении 313 (положении 434 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[14] константная область IgG2 в соответствии с [13], которая дополнительно включает как делецию Gly в положении 325 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 326 (положении 447 в Европейской системе нумерации);

[15] константная область IgG4, в которой аминокислота в положении 289 (положении 409 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 заменена другой аминокислотой;

[16] константная область IgG4, в которой аминокислоты в положении 289 (положении 409 в Европейской системе нумерации), положениях 14, 16, 20, 21, 97, 100, 102, 103, 104 и 105 (положениях 131, 133, 137, 138, 214, 217, 219, 220, 221 и 222 в Европейской системе нумерации соответственно) и положениях 113, 114 и 115 (положениях 233, 234 и 235 в Европейской системе нумерации соответственно) заменены другими аминокислотами, а аминокислота в положении 116 (положении 236 в Европейской системе нумерации) делетирована из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3;

[17] константная область IgG4 в соответствии с [16], которая дополнительно включает как делецию Gly в положении 326 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 327 (положении 447 в Европейской системе нумерации);

[18] константная область IgG1, в которой Asn в положении 317 (положении 434 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменен другой аминокислотой;

[19] константная область IgG1 в соответствии с [18], которая дополнительно включает как делецию Gly в положении 329 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 330 (положении 447 в Европейской системе нумерации);

[20] константная область IgG2, в которой Ala в положении 209 (положении 330 в Европейской системе нумерации), Pro в положении 210 (положении 331 в Европейской системе нумерации), Thr в положении 218 (положении 339 в Европейской системе нумерации), Cys в положении 14 (положении 131 в Европейской системе нумерации), Arg в положении 16 (положении 133 в Европейской системе нумерации), Cys в положении 102 (положении 219 в Европейской системе нумерации), Glu в положении 20 (положении 137 в Европейской системе нумерации) и Ser в положении 21 (положении 138 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[21] константная область IgG2 в соответствии с [20], которая дополнительно включает как делецию Gly в положении 325 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 326 (положении 447 в Европейской системе нумерации);

[22] константная область IgG2, в которой Cys в положении 14 (положении 131 в Европейской системе нумерации), Arg в положении 16 (положении 133 в Европейской системе нумерации), Cys в положении 102 (положении 219 в Европейской системе нумерации), Glu в положении 20 (положении 137 в Европейской системе нумерации) и Ser в положении 21 (положении 138 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами;

[23] константная область IgG2 в соответствии с [22], которая дополнительно включает как делецию Gly в положении 325 (положении 446 в Европейской системе нумерации), так и делецию Lys в положении 326 (положении 447 в Европейской системе нумерации);

[24] константная область антитела человека, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;

[25] константная область антитела человека, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7;

[26] константная область антитела человека, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;

[27] константная область антитела человека, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35;

[28] константная область антитела человека, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36;

[29] константная область антитела человека, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37;

[30] константная область антитела человека, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43;

[31] константная область антитела человека, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 (M40ΔGK);

[32] константная область антитела человека, включающая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55 (M86ΔGK);

[33] антитело, включающее константную область в соответствии с любым из [1]-[32];

[34] антитело против рецептора IL-6, включающее константную область в соответствии с любым из [1]-[32]; и

[35] фармацевтическая композиция, включающая константную область в соответствии с любым из [1]-[32].

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется результат использования гель-фильтрации для анализа процента агрегатов в WT-IgG1, WT-IgG2, WT-IgG4, IgG2-M397V и IgG4-R409K, очищенных с помощью элюции соляной кислотой.

Фиг.2 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется результат анализа с помощью катионообменной хроматографии (IEC) WT-IgG1, WT-IgG2 и WT-IgG4.

Фиг.3 представляет собой схему, на которой демонстрируется предсказанное образование дисульфидных связей в шарнирной области WT-IgG2.

Фиг.4 представляет собой схему, на которой демонстрируется предсказанное образование дисульфидных связей в шарнирной области IgG2-SKSC.

Фиг.5 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется результат анализа с помощью катионообменной хроматографии (IEC) WT-IgG2 и IgG2-SKSC.

Фиг.6 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется результат анализа с помощью катионообменной хроматографии (IEC) гуманизированного антитела PM-1, антитела с C-концевой ΔK в Н-цепи и антитела с C-концевой ΔGK в Н-цепи.

На фиг.7 демонстрируется сравнение количеств WT-IgG1, WT-IgG2, WT-IgG4, WT-M14ΔGK, WT-M17ΔGK и WT-M11ΔGK, связывающихся с FcγRI.

Фиг.8 представляет собой графическое представление, демонстрирующее сравнение количеств WT-IgG1, WT-IgG2, WT-IgG4, WT-M14ΔGK, WT-M17ΔGK и WT-M11ΔGK, связывающихся с FcγRIIa.

Фиг.9 представляет собой графическое представление, демонстрирующее сравнение количеств WT-IgG1, WT-IgG2, WT-IgG4, WT-M14ΔGK, WT-M17ΔGK и WT-M11ΔGK, связывающихся с FcγRIIb.

Фиг.10 представляет собой графическое представление, демонстрирующее сравнение количеств WT-IgG1, WT-IgG2, WT-IgG4, WT-M14ΔGK, WT-M17ΔGK и WT-M11ΔGK связывающихся с FcγRIIIa (Val).

Фиг.11 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется увеличение агрегирования при анализе стабильности WT-IgG1, WT-M14ΔGK, WT-M17ΔGK и WT-M11ΔGK при высоких концентрациях.

Фиг.12 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется увеличение Fab-фрагментов при анализе стабильности WT-IgG1, WT-M14ΔGK, WT-M17ΔGK и WT-M11ΔGK при высоких концентрациях.

Фиг.13 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется результат анализа с помощью катионообменной хроматографии (IEC) WT-IgG2, WT-M14ΔGK и WT-M31ΔGK.

Фиг.14 представляет собой график зависимости от времени концентраций в плазме WT-IgG1 и WT-M14 после внутривенного введения трансгенным по FcRn человека мышам.

Фиг.15 представляет собой график зависимости от времени концентраций в плазме WT-IgG1, WT-M44, WT-M58 и WT-M73 после внутривенного введения трансгенным по FcRn человека мышам.

Фиг.16 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется оценка на основе катионообменной хроматографии эффекта на гетерогенность, оказываемого константной областью антител WT и F2H/L39 против рецептора IL-6, антитела H0L0 против рецептора IL-31 и антитела H0L0 против RANKL.

Фиг.17 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется оценка на основе катионообменной хроматографии эффекта на гетерогенность, оказываемого цистеином в СН1-домене антител WT и F2H/L39 против рецептора IL-6.

Фиг.18 представляет собой диаграмму, на которой демонстрируется оценка на основе DSC эффекта на пик денатурации, оказываемого цистеином в СН1-домене антител WT и F2H/L39 против рецептора IL-6.

Фиг.19 представляет собой график, на котором демонстрируются нейтрализующие BaF/g130 активности тоцилизумаба, контроля и Fv5-M83.

Фиг.20 представляет собой график, на котором демонстрируются нейтрализующие BaF/g130 активности тоцилизумаба, Fv3-M73 и Fv4-M73.

Фиг.21 представляет собой график зависимости от времени концентрации в плазме яванских макак тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73, и Fv5-M83 после внутривенного введения.

Фиг.22 представляет собой график зависимости от времени концентрации CRP у яванских макак после внутривенного введения тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73 или Fv5-M83.

Фиг.23 представляет собой график зависимости от времени концентрации несвязанного растворимого рецептора IL-6 у яванских макак после внутривенного введения тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73 или Fv5-M83.

Фиг.24 представляет собой график зависимости от времени концентраций в плазме WT-IgG1, WT-M14 и WT-M58 после внутривенного введения трансгенным по FcRn человека мышам.

Вариант осуществления изобретения

Настоящим изобретением предоставляются константные области антител, физико-химические свойства (стабильность и гомогенность), иммуногенность, безопасность и/или фармакокинетика которых улучшены с помощью изменения аминокислотной последовательности константной области антитела; антитела, включающие такую константную область; фармацевтические композиции, включающие такое антитело; и способы их получения.

Здесь константная область относится к константной области Ig типа IgG1, IgG2 или IgG4. Предпочтительно константной областью антитела является константная область антитела человека. Известны аминокислотные последовательности константных областей IgG1, IgG2 и IgG4 человека (константной области IgG1 человека, SEQ ID NO: 1; константной области IgG2 человека, SEQ ID NO: 2; и константной области IgG4 человека, SEQ ID NO: 3). Содержащие аминокислотные замены константные области антител настоящего изобретения могут включать другие замены или модификации аминокислот при условии, что они включают замены аминокислот настоящего изобретения. Следовательно, константные области IgG2, включающие замены аминокислот настоящего изобретения в константной области IgG2, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, включают константные области IgG2, которые включают одну или несколько замен и/или модификаций аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и, кроме того, включают замены аминокислот настоящего изобретения, а также константные области IgG2, которые включают замены аминокислот настоящего изобретения и, кроме того, включают одну или несколько замен и/или модификаций аминокислот. Это же распространяется на константные области IgG1, включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и константные области IgG4, включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. Последовательность константной области IgG4 была изменена для повышения стабильности шарнирной области (Mol. Immunol. 1993 Jan; 30(1):105-8). Кроме того, сахарная цепочка в положении 297 в Европейской системе нумерации может быть сахарной цепочкой любой структуры (например, она может быть продуцирована с использованием E. coli), или может не быть какой-либо сахарной цепочки, связанной в этом сайте.

<IgG2, имеющий измененные аминокислоты>

Настоящим изобретением предоставляются константные области IgG2 с повышенной устойчивостью в кислотных условиях.

Конкретнее, настоящим изобретением предоставляются константные области IgG2, в которых Met в положении 276 (положении 397 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменен другой аминокислотой. Тип аминокислоты после замены особенно не ограничен; однако предпочтительной является замена на Val. Устойчивость антитела в кислотных условиях можно повысить с помощью замены Met в положении 276 (положении 397 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 другой аминокислотой.

Предоставляемые настоящим изобретением константные области IgG2, которые имеют повышенную устойчивость в кислотных условиях, могут также иметь другие замены, делеции, добавления и/или вставки аминокислот при условии, что они имеют по крайней мере описанную выше замену аминокислоты.

Настоящим изобретением предоставляются константные области IgG2 со сниженной гетерогенностью шарнирной области.

Конкретнее, настоящим изобретением предоставляются константные области IgG2, в которых Cys в положении 14 (положении 131 в Европейской системе нумерации), Arg в положении 16 (положении 133 в Европейской системе нумерации), и/или Cys в положении 102 (положении 219 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами. Тип аминокислоты после замены особенно не ограничен; однако предпочтительными являются замены Cys в положении 14 (положении 131 в Европейской системе нумерации) на Ser, Arg в положении 16 (положении 133 в Европейской системе нумерации) на Lys и Cys в положении 102 (положении 219 в Европейской системе нумерации) на Ser IgG2-SKSC).

Эти замены могут снизить гетерогенность, возникающую из шарнирной области IgG2. Константные области IgG2 настоящего изобретения, включающие аминокислотные замены, включают константные области IgG2, включающие по крайней мере один из трех типов аминокислотных замен, описанных выше; однако предпочтительно константные области IgG2 включают замены Cys в положении 14 и Cys в положении 102 другими аминокислотами или все три типа аминокислотных замен, описанных выше.

Предоставляемые настоящим изобретением константные области IgG2, которые имеют сниженную гетерогенность, могут также иметь другие замены, делеции, добавления и/или вставки аминокислот при условии, что они имеют по крайней мере описанные выше замены аминокислот.

Например, мутированием Cys в положении 14 и Arg в положении 16 в константной области IgG2, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, можно создать не встречающиеся в природе, новые пептидные последовательности из девяти-двенадцати аминокислот, которые могут стать пептидными T-клеточными эпитопами, и, следовательно, вызвать угрозу иммуногенности. Даже при введении описанных выше аминокислотных замен можно избежать образования не встречающихся в природе T-клеточных эпитопов с помощью замены Glu в положении 20 (положении 137 в Европейской системе нумерации) и Ser в положении 21 (положении 138 в Европейской (EU) системе нумерации) другими аминокислотами. Тип аминокислоты после замены особенно не ограничен; однако предпочтительными являются замены Glu в положении 20 на Gly и Ser в положении 21 на Gly.

Настоящим изобретением также предоставляются константные области IgG2 с ослабленной активностью связывания с рецептором Fcγ.

Конкретнее, настоящим изобретением также предоставляются константные области IgG2, включающие аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 209 (EU330), Pro в положении 210 (EU331) и/или Thr в положении 218 (EU339) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 замены Ser, Ser и Ala соответственно. Уже сообщалось, что замены Ala в положении 209 (EU330) и Pro в положении 210 (EU331) способствуют ослаблению связывания с рецептором Fcγ (Eur. J. Immunol. 1999 Aug; 29(8): 2613-24). Ввиду угрозы возникновения иммуногенности, эти изменения, однако, не являются предпочтительными, поскольку они приводят к созданию происходящих не из человека пептидов, которые могут стать T-клеточными эпитопами. Однако связывание IgG2 с рецептором Fcγ можно ослабить с помощью замены Thr в положении 218 (EU339) на Ala в то же самое время, а пептиды из 9-12 аминокислот, которые могут стать T-клеточными эпитопами, происходят только из человека.

Константные области IgG2 настоящего изобретения, включающие замены аминокислот, включают по крайней мере один из трех типов аминокислотных замен, описанных выше; однако предпочтительно константные области IgG2 включают все три типа описанных выше аминокислотных замен. В предпочтительном варианте осуществления константные области IgG2 настоящего изобретения, включающие аминокислотные замены, включают константные области IgG2, включающие аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 209 (EU330), Pro в положении 210 (EU331) и Thr в положении 218 (EU339) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены Ser, Ser и Ala соответственно.

Предоставляемые настоящим изобретением константные области IgG2, которые имеют ослабленную активность связывания с рецептором Fcγ, могут также иметь другие замены, делеции, добавления и/или вставки аминокислот при условии, что они имеют по крайней мере описанные выше замены аминокислот.

Настоящим изобретением предоставляются константные области IgG2 со сниженной C-концевой гетерогенностью.

Конкретнее, настоящим изобретением предоставляются константные области IgG2, включающие аминокислотную последовательность, в которой Gly в положении 325 (положении 446 в Европейской системе нумерации) и Lys в положении 326 (положении 447 в Европейской системе нумерации) делетированы из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Гетерогенность, возникающую из C-конца Н-цепи антитела, можно снизить только в случае делетирования обеих указанных аминокислот.

Предоставляемые настоящим изобретением константные области IgG2, которые имеют сниженную C-концевую гетерогенностью, могут также иметь другие замены, делеции, добавления и/или вставки аминокислот при условии, что они имеют по крайней мере описанные выше делеции аминокислот.

Настоящим изобретением, кроме того, предоставляются константные области IgG2 с улучшенной фармакокинетикой.

Конкретнее, настоящим изобретением предоставляются константные области IgG2, в которых His в положении 147 (положении 268 в Европейской системе нумерации), Arg в положении 234 (положении 355 в Европейской системе нумерации) и Gln в положении 298 (положении 419 в Европейской системе нумерации) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами. Эти замены аминокислот способствуют улучшению фармакокинетики антител. Тип аминокислоты после замены особенно не ограничен; однако предпочтительными являются замены His в положении 147 (положении 268 в Европейской системе нумерации) на Gln, Arg в положении 234 (положении 355 в Европейской системе нумерации) на Gln и Gln в положении 298 (положении 419 в Европейской системе нумерации) на Glu. Константные области IgG2 с заменами аминокислот настоящего изобретения включают константные области IgG2, включающие по крайней мере один из трех типов аминокислотных замен, описанных выше; однако предпочтительно константные области IgG2 включают все три типа аминокислотных замен, описанных выше.

Ниже представлен предпочтительный вариант IgG2 настоящего изобретения, который имеет повышенную устойчивость в кислотных условиях, сниженную гетерогенность в шарнирной области и/или ослабленную активность связывания с рецептором Fcγ.

Предоставляются антитела, включающие константную область IgG2, включающую аминокислотную последовательность, в которой Ala в положении 209, Pro в положении 210, Thr в положении 218, Met в положении 276, Cys в положении 14, Arg в положении 16, Cys в положении 102, Glu в положении 20 и Ser в положении 21 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменены другими аминокислотами.

Тип аминокислоты после замены особенно