Дисплей на поверхности клеток полипептидных изоформ на основе прочитывания терминирующего кодона

Дисплей на поверхности клеток полипептидных изоформ на основе прочитывания терминирующего кодона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу селекции высокопродуктивных клеток-носителей млекопитающих, равно как и к векторам и клеткам-носителям, подходящим для применения в соответствующем способе. Помимо этого настоящее изобретение относится к способу эффективной выработки полипептидов с высокими выходами.

Селекция высокопродуктивных клеточных линий является важным первым шагом в разработке любых биологических процессов и представляет собой одну из серьезнейших проблем в биотехнологии. Одна из проблем состоит в том, что подобные высокопродуктивные клоны редки и могут затрачивать существенную часть своей энергии на выработку полипептидов, вследствие чего характеризуются пониженными скоростями роста. Это приводит к чрезмерному росту и непродуктивным или низкопродуктивным клеткам. Однако для выработки полипептидов желательно получить клеточные линии, вырабатывающие целевой полипептид с высоким выходом. Традиционно, высокопродуктивные клеточные линии выбирают посредством ряда клонирований методом предельных разведений с последующим анализом продуктов. Однако данный традиционный путь имеет несколько недостатков, будучи одновременно трудозатратным и дорогим. Помимо этого процесс в целом связан с большими затратами времени, его завершение может потребовать нескольких месяцев, и даже после этого отсутствуют гарантии того, что клонированная клеточная линия будет стабильной и, таким образом, полезной для промышленной биотехнологии. Более того, селекция наиболее высокопродуктивных клеток может потребовать компромисса с ограничениями практического характера в отношении числа клеток, для которых может осуществляться скрининг, что потенциально снижает эффективность селекции высокопродуктивных клеток с низким содержанием.

В связи с этим, было потрачено много усилий на разработку альтернативных способов селекции высокопродуктивных клонов. Например, проточная цитометрия облегчила мониторинг продуктивности и выделение клеток с определенными характеристиками. Важные преимущества проточной цитометрии включают способность быстро осуществлять скрининг большого числа клеток с возможностью различать клеточные субпопуляции и способность эффективно выбирать клетки с низким содержанием, демонстрирующие искомые характеристики. Большинство из традиционных подходов к селекции высокопродуктивных клеток, задействующих проточную цитометрию, были введены для селекции гибридомных клеток.

Один из подходов основывается на содержании антител на клеточной поверхности гибридомных клеток, демонстрирующих повышенное количество антител на клеточной поверхности, которые могут быть обнаружены и выделены посредством применения флуоресцентно-меченых антител. Однако количественная корреляция пока не получила широкого описания.

Другие подходы были предназначены для селекции клеток на основе секретируемого антитела в качестве альтернативной стратегии, имеющей целью преодоление некоторых ограничений способов селекции клеток на основе поверхностных антител. Один из подходов задействует аффинную матрицу, другие используют гелевые микрокапельные методики. Последний способ основывается на создании искусственной аффинной матрицы, специфичной в отношении рассматриваемого секретируемого продукта. Секретируемые молекулы связываются с аффинной матрицей на поверхности секретирующей клетки, после чего их метят специфическими флуоресцентными реагентами для проточного цитометрического анализа и клеточного сортинга.

Микрокапельная инкапсуляция включает полную инкапсуляцию одиночных клеток в агарозных гранулах. Данные гранулы содержат специфичные антитела захвата и, таким образом, одновременно захватывают секретируемый продукт, предотвращая кроссфидинг продукта между клетками.

Другие способы основываются на коэкспрессии генов-маркеров, детектируемых посредством проточной цитометрии. Недостатками являются слабая связь экспрессии гена-маркера (например, зеленого флуоресцентного белка) с экспрессией рассматриваемого гена. Кроме того, экспрессия гена-маркера требует от клеток дополнительных затрат энергии и может вызвать стресс.

Альтернативный способ основывается на индуцируемой коэкспрессии связанных с мембраной белков захвата. Связанные с мембраной белки захвата прикреплены к клеточной поверхности и захватывают секретируемые полипептиды, как только они высвобождаются из клеток. Эти захваченные молекулы могут быть обнаружены на поверхности клетки. Однако для этого необходимы клетки-хозяева, созданные методами генной инженерии; помимо этого, может происходить кроссфидинг непродуктивных клеток.

Для селекции продуктивных клеток также использовали секретируемые продукты, временно связывающиеся с клеточной мембраной. Однако при этом происходит кроссфидинг непродуктивных клеток; кроме того, данной способ характеризуется довольно высокой фоновой активностью. Более того, было обнаружено, что невозможно осуществить несколько циклов обогащения и селекции.

Таким образом, существует потребность в развитии технологии селекции высокопродуктивных клеток-носителей. В связи с этим, объектом настоящего изобретения является способ обнаружения высокопродуктивных рекомбинантных клеток-носителей среди обширной популяции непродуктивных, низкопродуктивных и/или среднепродуктивных клеток, а также способ получения полипептидов с высоким выходом.

Настоящее изобретение решает данную проблему, предлагая способ обогащения или селекции по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей представляющий интерес полипептид на искомом уровне, включающий:

а) получение набора эукариотических клеток-носителей, содержащих гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую хотя бы одну кассету (Cas-POI), содержащую хотя бы первый полинуклеотид (Pn-POI), кодирующий представляющий интерес полипептид, по меньшей мере один терминирующий кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида, а также второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант;

б) культивирование эукариотических клеток-носителей с целью экспрессии представляющего интерес полипептида таким образом, чтобы хотя бы часть рассматриваемого полипептида экспрессировалась в виде гибридного полипептида, включающего иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, причем указанный гибридный полипептид представлен на клеточной поверхности;

в) селекцию по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяева на основании присутствия или количества гибридного полипептида, представленного на клеточной поверхности.

Термин «гетерологичная нуклеиновая кислота» относится к полинуклеотидной последовательности, введенной в клетку-хозяина с помощью, например, рекомбинантных методик, таких как трансфекция. Клетка-хозяин может содержать или не содержать эндогенный полинуклеотид, соответствующий или идентичный гетерологичному полинуклеотиду. Однако в особенности термин «гетерологичная нуклеиновая кислота» относится к чужеродному полинуклеотиду, введенному в клетку-хозяина. Введение может быть осуществлено в результате, например, трансфекции подходящего вектора, который может встроиться в геном клетки-хозяина (стабильная трансфекция). В случае если гетерологичная нуклеиновая кислота не встраивается в геном, гетерологичная нуклеиновая кислота может быть потеряна на более поздней стадии, например, в процессе митоза (транзиентная трансфекция). Оба варианта являются подходящими, однако, стабильная трансфекция предпочтительна. Подходящие векторы могут также сохраняться в клетке-хозяине без встраивания в геном, например, в результате эписомальной репликации. Однако в соответствующей области ранее были также известны и другие способы внедрения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина, которые тоже описаны более подробно ниже.

Термин «полинуклеотид» означает полимер из нуклеотидов, обычно связанных от одной дезоксирибозы или рибозы к другой, и относится к ДНК, равно как и к РНК, в зависимости от контекста. Термин «полинуклеотид» не подразумевает каких-либо размерных ограничений.

Термин «кассета» описывает группу полинуклеотидных элементов, функционально связанных друг с другом, включающую, например, полинуклеотид (Pn-POI), кодирующий представляющий интерес полипептид, полинуклеотид, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, полинуклеотид, кодирующий маркер, регуляторные элементы и/или другие описанные в контексте нуклеотиды. Термин «кассета», как он употребляется в контексте, включает по крайней мере два полинуклеотидных элемента. Кассета может включать или не включать регуляторные элементы в качестве полинуклеотидов, такие как, например, промотор, энхансер и/или сайт полиаденилирования. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, кассета является «экспрессионной кассетой», подходящей для экспрессии полипептида. Экспрессионная кассета включает по меньшей мере один инициирующий транскрипцию элемент, например, промотор, в качестве регуляторного элемента, функционально связанного с кодирующей областью, например, полинуклеотидом (Pn-POI), кодирующим представляющий интерес полипептид, который, соответственно, находится под транскрипционным контролем упомянутого инициирующего транскрипцию элемента. Экспрессионная кассета может также включать подходящие регуляторные элементы для терминации транскрипции, такие, как, например, сайт полиаденилирования.

Термин «кассета (Cas-POI)» включает по крайней мере первый полинуклеотид (Pn-POI), кодирующий представляющий интерес полипептид, по меньшей мере один терминирующий кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида и второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант. Предпочтительно, кассета (Cas-POI) является экспрессионной кассетой (Ехр-POI).

Термин «экспрессионная кассета (Ехр-POI)» означает экспрессионную кассету, подходящую для экспрессии представляющего интерес полипептида (POI). В качестве экспрессионной кассеты она содержит по меньшей мере один инициирующий транскрипцию элемент. Указанная экспрессионная кассета (Ехр-POI) либо включает полинуклеотид (Pn-POI), кодирующий представляющий интерес полипептид частью своей кодирующей области, либо включает сайт, подходящий для встраивания соответствующего полинуклеотида (Pn-POI), кодирующего представляющий интерес полипептид, - в зависимости от задействуемого варианта осуществления настоящего изобретения, каковые более подробно описаны ниже.

Общая концепция настоящего изобретения состоит в помещении терминирующего кодона между полинуклеотидом (Pn-POI), кодирующим представляющий интерес полипептид, и полинуклеотидом, кодирующим иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, позволяющий полипептиды прикрепляться к клеточной поверхности. Термины «иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен» и «иммуноглобулиновый трансмембранный домен» употребляются в контексте в качестве синонимов. Терминирующий кодон составляет сигнал терминации трансляции или является его частью и может представлять собой естественный терминирующий кодон полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, то есть, таким образом, терминирующий кодон, используемый в естественных условиях для терминации трансляции. Конструирование кассеты (Cas-POI) приводит при экспрессии к выработке двух различных полипептидов, когда первый и второй полинуклеотиды транскрибируются в транскрипт, каковой необязательно подвергается процессингу, а затем транслируется. Согласно одному из вариантов трансляции, трансляция транскрипта прерывается на (хотя бы одном) терминирующем кодон, расположенном между полинуклеотидом (Pn-POI), кодирующим представляющий интерес полипептид, и полинуклеотидом, кодирующим иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант. Терминация трансляции на упомянутом терминирующем кодоне приводит к полипептидному продукту, не содержащему трансмембранный якорный домен. Согласно второму варианту трансляции, при трансляции прочитывается по меньшей мере один терминирующий кодон, что приводит к продукту трансляции, содержащему представляющий интерес полипептид и связанный с ним иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, способный прикреплять гибридный белок к клеточной мембране. Подобный гибридный белок переносится на поверхность клетки и закрепляется на ней входящим в его состав иммуноглобулиновым трансмембранным якорным доменом или его функциональным вариантом. Важной характеристикой настоящего изобретения является то, что при экспрессии кассеты (Cas-POI) терминация трансляции на упомянутом терминирующем кодоне внутри рамки считывания оказывается в некоторой степени «ненадежной», поскольку имеют место случаи трансляционного прочитывания, приводящие к описанному гибридному белку. Поскольку подобное трансляционное прочитывание происходит в определенной доле случаев, на каковую могут также иметь влияние выбор и число терминирующих кодонов и соседствующих с терминирующим кодоном областей, в частности, следующего за терминирующим кодоном нуклеотида, равно как и условия культивирования, уровень связанного с поверхностью гибридного белка непосредственно коррелирует с уровнем экспрессии представляющего интерес полипептида. Количество присутствующего на клеточной поверхности гибридного белка оказывается, таким образом, в некоторой степени пропорциональным общему уровню экспрессии представляющего интерес полипептида соответствующей клеткой, поскольку существует тесная связь между поверхностной экспрессией гибридного полипептида и продуктивностью клетки-хозяина в отношении экспрессии представляющего интерес полипептида. Уровень связанного с поверхностью гибридного белка дает, таким образом, представление об общей продуктивности индивидуальной клетки и позволяет осуществить селекцию по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина на основе присутствия или количества гибридного белка, представленного на клеточной поверхности. Цикл селекции, включающий стадии а), б) и в), предоставляет возможность эффективных и воспроизводимых идентификации и выделения высокопродуктивных эукариотических клеток.

Подходящие способы обнаружения/селекции, такие как иммуноокрашивание, проточная цитометрия, флуоресцентная микроскопия, магнитно-активируемый клеточный сортинг (MACS), аффинные методы, такие как основанные на использовании магнитных гранул и схожих методиках, позволяют осуществлять идентификацию, селекцию и/или обогащение высокопродуктивных клеток на основе присутствия и уровня связанного с поверхностью гибридного белка. Таким образом, настоящее изобретение приводит к существенному снижению трудозатрат на скрининг, позволяя осуществлять селекцию, а также обогащение по меньшей мере одной высокопродуктивной клетки или популяции высокопродуктивных клеток из популяции непродуктивных, малопродуктивных и/или среднепродуктивных клеток. Также оказывается возможным осуществлять несколько циклов селекции и/или обогащения, предпочтительно, два или три. Например, может быть осуществлена селекция эукариотической клетки-хозяина с существенным или высоким уровнем экспрессии или популяции клеток-носителей с помощью соединения для детектирования, такого как, например, антитело или его фрагмент, распознающее связанный с мембраной гибридный белок. Указанное соединение для детектирования может нести метку и, таким образом, быть обнаружимо с помощью общепринятых способов детектирования.

Согласно идея настоящего изобретения, для прикрепления представляющего интерес полипептида к поверхности клетки используется по меньшей мере один фрагмент иммуноглобулинового трансмембранного якорного домена. В том случае, если используется лишь фрагмент вместо целого иммуноглобулинового трансмембранного якорного домена, соответствующий фрагмент должен позволять гибридному полипептиду прикрепляться к поверхности клетки. Иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный фрагмент внедрен в клеточную мембрану и, таким образом, жестко прикреплен к ней. Жесткое прикрепление отличает якоря по настоящему изобретению от, например, гликофосфатидитинозитольного якоря. Иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, используемый согласно настоящему изобретению, обеспечивает очень крепкое и, вследствие этого, устойчивое прикрепление гибридного полипептида к клеточной поверхности, которое к тому же не подвержено или хотя бы менее подвержено протеолитическому выделению в среду. Это подтверждается проведенным после очистки анализом продуктов. При проведении масс-спектрального анализа не было обнаружено никаких фрагментов тяжелых цепей, содержащих иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен (или фрагмент иммуноглобулинового трансмембранного якорного домена). Это является важным преимуществом по сравнению с предшествующими подходами в соответствующей области, поскольку при этом также снижается риск загрязнения рассматриваемого секретируемого растворимого полипептида выделяющимися в среду гибридными полипептидами. Более того, согласно проанализированным характеристикам рассматриваемых экспрессируемых полипептидов, также не было отмечено существенных отличий от вещества из стандартных клонов/экспрессионных систем.

Клетки, получаемые способом по настоящему изобретению, характеризуются более высоким средним уровнем экспрессии по сравнению с клетками, клонированными с помощью метода предельных разведении или сходных способов. Они также характеризуются более высокими средними уровнями экспрессии по сравнению с клетками, клонированными, например, с помощью проточной цитометрии после трансфекции стандартного вектора, не содержащего специфический трансмембранный домен/якорь согласно настоящему изобретению.

Клетки, выявленные в результате процедуры скрининга/селекции по настоящему изобретению, как правило, выделяют, и они могут быть обогащены относительно клеток до селекции из исходной клеточной популяции. Они могут быть выделены и культивированы как индивидуальные клетки. Они также могут быть задействованы в одном или нескольких дополнительных циклах селекции для, необязательно, дополнительного качественного или количественного анализа, или могут быть использованы, например, в разработке линии клеток для выработки белка. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, обогащенная популяция высокопродуктивных клеток, полученная в результате селекции, как это описано выше, непосредственно используется в качестве популяции для выработки представляющего интерес полипептида с высоким выходом.

Преимуществом является то, что наблюдаемые характеристики роста и продуктивности клонов, коэкспрессирующих трансмембранный вариант представляющего интерес полипептида, в частности, антитела, и клонов, производных от классического векторного подхода, не коэкспрессирующих трансмембранный вариант представляющего интерес полипептида, оказываются одинаковы. Более того, также и стабильность клоновой выработки оказывается в равной степени хорошей.

Объектом настоящего изобретения также является способ выработки представляющего интерес полипептида с высоким выходом, каковой способ включает:

а) получение набора эукариотических клеток-носителей, содержащих гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую хотя бы одну кассету (Cas-POI), содержащую хотя бы первый полинуклеотид (Pn-POI), кодирующий представляющий интерес полипептид, по меньшей мере один терминирующий кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида, а также второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант;

б) культивирование эукариотических клеток-носителей с целью экспрессии представляющего интерес полипептида таким образом, чтобы хотя бы часть рассматриваемого полипептида экспрессировалась в виде гибридного полипептида, включающего иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, причем указанный гибридный полипептид представлен на клеточной поверхности;

в) селекцию по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина на основании присутствия или количества гибридного полипептида, представленного на клеточной поверхности;

г) культивирование полученной в результате селекции эукариотической клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию представляющего интерес полипептида.

Экспрессируемый представляющий интерес полипептид может быть получен посредством разрушения клеток-носителей. Полипептиды могут также экспрессироваться, например, секретироваться в культуральную среду и могут быть получены из нее. Также возможны комбинации соответствующих способов. Подобным образом полипептиды могут быть эффективно выработаны и получены/выделены с высоким выходом. Полученные полипептиды могут также быть подвергнуты дальнейшим манипуляциям, таким как, например, стадии очистки и/или модификации, с целью получения представляющего интерес полипептида с требуемым качеством. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, упомянутые клетки-хозяева культивируют в бессывороточных условиях. Как было вкратце оговорено выше, посредством встраивания хотя бы одного терминирующего кодона между полинуклеотидом (Pn-POI), кодирующим представляющий интерес полипептид, и вторым полинуклеотидом, кодирующим иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный фрагмент, возможна селекция клеток-носителей с высоким уровнем экспрессии, обеспечивая таким образом выработку представляющего интерес полипептида с высоким выходом. Стадия селекции/обогащения по настоящему изобретению является, таким образом, неотъемлемым и важным компонентом процесса выработки в целом.

Применение иммуноглобулинового трансмембранного якорного домена или его функционального фрагмента согласно идеям настоящего изобретения имеет особые преимущества при выработке иммуноглобулиновых молекул, поскольку упомянутый иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен естественным образом подходит для закрепления иммуноглобулиновых молекул на поверхности клетки. Как было неожиданно обнаружено, иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен может быть использован при экспрессии иммуноглобулиновых молекул в клетках-хозяина млекопитающих, таких как клетки яичников китайского хомячка (СНО). Это неожиданно по той причине, что в предшествующих работах в соответствующей области принималось, что в упомянутых клетках необходима коэкспрессия рецепторных цепей иммуноглобулина-альфа и иммуноглобулина-бета для обеспечения экспрессии прикрепленных к поверхности и, соответственно, к клеточной мембране, антител в случае применения иммуноглобулинового трансмембранного домена в качестве якоря. Данные корецепторы естественным образом экспрессируются, например, в В-клетках и производных В-клеток, таких как гибридомные или миеломные клетки (например, клетки мышиной миеломы SP2/0), но их экспрессия не ожидалась в случае клеток, не относящихся к В-клеткам, таких как клетки СНО. Было, однако, обнаружено, что, несмотря на отсутствие экспрессии корецепторов, поверхностный дисплей представляющего интерес полипептида и, в частности, иммуноглобулиновых молекул хорошо протекает в клетках, не являющихся производными В-клеток, таких как клетки СНО, при использовании иммуноглобулинового трансмембранного якорного домена. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, используется эукариотическая клетка-хозяина, которая не является В-клеткой или производной от В-клетки. Соответственно, используется эукариотическая клетка-хозяина, предпочтительно, от млекопитающего, которая не экспрессирует в естественных условиях рецепторные цепи иммуноглобулина-альфа и иммуноглобулина-бета. Таким образом, клетка-хозяина предпочтительно является клеткой СНО. Более того, согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, в указанной эукариотической клетке не происходит искусственной коэкспрессии рецепторных цепей иммуноглобулина-альфа и иммуноглобулина-бета.

Всякий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный фрагмент может быть использован согласно идеям настоящего изобретения. В частности, иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен выбран из группы, включающей иммуноглобулиновые трансмембранные якорные домены, производные от иммуноглобулинов IgM, IgA, IgE, IgG и/или IgD или их функциональных вариантов. Предпочтительно, иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен является производным от IgGI, IgG2, IgG3 и/или IgG4. Особенно подходящим является иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен IgG1 или его функциональный вариант. Предпочтительные примеры производных от IgG трансмембранных якорей представлены в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:7.

Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен включает цитоплазматический домен. Применение иммуноглобулинового трансмембранного якорного домена, включающего цитоплазматический домен, является предпочтительным, поскольку оно обеспечивает очень прочную связь между гибридным белком и клеточной поверхностью. В особенности подходящим является применение иммуноглобулинового цитоплазматического домена. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, иммуноглобулиновый цитоплазматический домен является производным от IgG, IgA и IgE или функциональных вариантов вышеперечисленного. Данные иммуноглобулиновые цитоплазматические домены крупнее, чем производные от IgD и IgM. В SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6 представлены подходящие аминокислотные последовательности производных от IgG цитоплазматических доменов, которые могут быть задействованы в качестве цитоплазматического домена. Предпочтительный пример производного от IgG трансмембранного якоря, который включает производный от IgG цитоплазматический домен, представлен в SEQ ID NO:3.

Таким образом, иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен может включать полипептидную последовательность, как она представлена в SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3 или ее функциональные варианты, в частности, ее функциональные фрагменты, которые обеспечивают прикрепление гибридного полипептида к поверхности клетки-хозяина.

Нуклеотидная последовательность секции подходящей кассеты (Cas-POI) представлена как SEQ ID NO:1. Представленные подробности включают терминирующий кодон внутри рамки считывания, подходящий для трансляционного прочитывания и полинуклеотид, кодирующий особенно подходящий иммуноглобулиновый (Ig) трансмембранный домен, который может быть задействован согласно идеям настоящего изобретения. Терминирующий кодон находится внутри рамки считывания по направлению экспрессии относительно полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид и, таким образом, от полинуклеотидной последовательности, подвергаемой транскрипции и процессингу с образованием аминокислотной последовательности. Понятие кодирующей последовательности относится к последовательности, транслируемой в аминокислоты. Таким образом, терминирующий кодон не принадлежит к кодирующей последовательности и, соответственно, к полинуклеотиду, кодирующему представляющий интерес полипептид. Терминирующий кодон может быть естественным терминирующим кодоном полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид. В этом случае присутствие дополнительного терминирующего кодона (кодонов) не требуется, но может иметь место (см. выше).

Второй полинуклеотид кассеты (Cas-POI) может кодировать иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, который включает полипептидную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:3 представляет другой вариант подходящего иммуноглобулинового трансмембранного домена, также включающего цитоплазматический домен (цитоплазматический домен сам по себе также представлен как SEQ ID NO:4), предполагаемые аминокислоты, соответствующие прочитываемому терминирующему кодону и дополнительный кодон (WL) и связующую область (связующая область представлена также как SEQ ID NO:5). Также в положении, соответствующем хотя бы одному терминирующему кодону и соседнему кодону могут присутствовать другие аминокислоты в зависимости от выбранного терминирующего кодона и/или числа терминирующих кодонов, а также задействованного соседнего кодона (кодонов). Поскольку указанные аминокислоты присутствуют лишь в гибридном полипептиде, они не нарушают аминокислотной последовательности представляющего интерес полипептида. В соответствии с этим, в качестве трансмембранного якоря и, как следствие, в описанных способах, равно как и в описанных векторах и клетках-хозяина, могут быть задействованы, согласно идеям настоящего изобретения, иммуноглобулиновый трансмембранный домен, включающий полипептидную последовательность, как она представлена в SEQ ID NO:2 или 3, или его функциональный вариант, в частности, его функциональный фрагмент.

«Функциональный вариант» иммуноглобулинового трансмембранного якорного домена согласно настоящему изобретению включает иммуноглобулиновые трансмембранные якорные домены, содержащие один или несколько отклонений в аминокислотной последовательности (например, пропусков, замен или вставок) по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего естественных иммуноглобулинового трансмембранного домена и функциональных фрагментов выше перечисленного, которые обеспечивают трансмембранное связывание гибридного белка с поверхностью клетки.

В качестве сигнала терминации трансляции и, таким образом, терминирующего кодона может быть задействован любой из трех терминирующих кодонов, опосредующих сигнал терминации синтеза белка (ТАА (УАА), ТАГ (УАГ) и ТГА (УГА) - также в различных тетрануклеотидных контекстах, см. ниже), располагающийся между полинуклеотидом (Pn-POI), кодирующим представляющий интерес полипептид, и полинуклеотидом, кодирующим иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, в зависимости от искомого уровня супрессии (прочитывания). Как было вкратце указано выше, терминирующий кодон может также являться естественным терминирующим кодоном полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид. Предпочтительно, указанный сигнал терминации трансляции характеризуется неполной эффективностью терминации, чтобы способствовать трансляционному прочитыванию. На «ненадежность» терминирующего кодона также оказывает влияние кодон (кодоны), расположенный по соседству и, таким образом, по направлению экспрессии относительно хотя бы одного терминирующего кодона; в частности, на транскрипционное прочитывание может оказывать влияние первый нуклеотид (см. ниже).

Кассету (Cas-POI) необходимо транслировать, чтобы обеспечить экспрессию представляющего интерес полипептида. Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения кассета (Cas-POI) является, таким образом, экспрессионной кассетой. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения, кассета (Cas-POI) встроена в геном клетки-хозяина таким образом, что кассета (Cas-POI) находится под транскрипционным контролем инициирующего транскрипцию элемента клетки-хозяина, такого как промотор.

Транскрипцию нуклеиновой кислоты, содержащейся в кассете (Cas-POI), приводит к транскрипту, включающему, по крайней мере,

- первый полинуклеотид, причем трансляция указанного первого полинуклеотида приводит к представляющему интерес полипептиду;

- по меньшей мере один терминирующий кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно упомянутого первого полинуклеотида;

- второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно упомянутого терминирующего кодона, причем трансляция указанного второго полинуклеотида приводит к иммуноглобулиновому трансмембранному якорному домену или его функциональному варианту.

По крайней мере часть транскрипта транслируется в гибридный полипептид, включающий представляющий интерес полипептид и иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, в результате трансляционного прочитывания хотя бы одного терминирующего кодона. Трансляционное прочитывание может происходить естественным образом вследствие выбора терминирующего кодона/конструкции сигнала терминации трансляции, или же может быть стимулировано подбором условий культивирования, например, посредством применения вещества, подавляющего терминацию (см. ниже).

Кассета (Cas-POI), применяемая в способе по настоящему изобретению, может включать лишь один терминирующий кодон, расположенный против направления экспрессии относительно последовательности, кодирующей иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его фрагмент. Также, однако, возможно использование набора из двух или более терминирующих кодонов, например, двух, или трех, или четырех терминирующих кодонов, которые могут быть одинаковыми или различными. На уровни прочитывания также влияет контекст, в котором находится терминирующий кодон, т.е. трехнуклеотидный терминирующий кодон сам по себе, равно как и нуклеотид (нуклеотиды), расположенные непосредственно по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона. Следует, однако, убедиться в том, что некоторый уровень трансляционного прочитывания все еще имеет место, чтобы обеспечить выработку гибридного полипептида, который может быть получен согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения посредством подбора условий культивирования.

Первичный транскрипт может являться предшественником матричной РНК (пре-мРНК), содержащим интроны. Соответствующая пре-мРНК будет подвергнута процессингу (сплайсированию), приводящему к мРНК. Альтернативно, транскрипция может привести непосредственно к мРНК, В процессе трансляции транскрипта мРНК обычно имеет место прочитывание терминирующего кодона (кодонов) на естественном фоновом уровне, или же соответствующий уровень прочитывания может быть стимулирован посредством подбора условий культивирования. Такой уровень прочитывания обуславливает определенную пропорцию гибридных полипептидов, которая также зависит от числа и природы задействуемых терминирующих кодонов (кодона), терминирующего кодона по направлению экспрессии и, в особенности, тетрануклеотидного контекста терминирующего кодона (кодонов) и условий культивирования. Соответственно, согласно идеям настоящего изобретения, несмотря на присутствие терминирующего кодона, вырабатывается определенная доля гибридного полипептида. Эти гибридные полипептиды включают иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, прочно связывающий гибридный полипептид с поверхностью клетки. Как следствие, гибридные полипептиды оказываются представлены на поверхности клеток-носителей, что позволяет осуществить селекцию клеток, демонстрирующих высокие уровни связанных с мембраной рекомбинантных гибридных полипептидов (указывающих на высокий уровень секретируемого полипептида) посредством, например, проточной цитометрии, в частности, посредством флуоресцентно-активируемого клеточного сортинга (FACS) при введении во взаимоде