Способ генерирования заквасочной культуры, заквасочная культура и способ ферментации с ее использованием

Способ генерирования заквасочной культуры, заквасочная культура и способ ферментации с ее использованием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, связанным с модуляцией устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям и способам для применения одного или нескольких генов или белков cas для модулирования устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам и композициям, которые находят применение при разработке и использовании комбинаций штаммов и ротаций заквасочных культур. В дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам мечения и/или идентификации бактерий. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам применения локусов CRISPR для определения потенциальной вирулентности фага против клетки и применения CRISPR-cas для модулирования генетической последовательности фага для повышенного уровня вирулентности. В еще одних вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к средствам и композициям для разработки и применения фагов в качестве агентов биологического контроля.

Уровень техники

Культуры и, в частности, заквасочные культуры широко используются в пищевой промышленности при изготовлении подвергнутых брожению продуктов, включая молочные продукты (например, йогурт, пахта и сыр), мясные продукты, хлебобулочные продукты, вино и растительные продукты. Получение культур трудоемко, занимает большое пространство и оборудование, и при нем существует значительный риск загрязнения вызывающими порчу бактериями и/или фагами во время стадий размножения. Несостоятельность бактериальных культур вследствие инфекции и размножения бактериофагов (фагов) представляет собой большую проблему при промышленном использовании бактериальных культур. Существует много различных типов фагов, и продолжают появляться новые штаммы. Кроме того, имеется потребность в способах и композициях для прослеживания бактерий, используемых в таких культурах. Действительно, несмотря на достижения в разработке культур, сохраняется потребность в усовершенствовании культур для применения в промышленности.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, связанным с модуляцией устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям и способам для применения одного или нескольких генов или белков cas для модулирования устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам и композициям, которые находят применение при разработке и использовании комбинаций штаммов и ротаций заквасочных культур. В дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам мечения и/или идентификации бактерий. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам применения локусов CRISPR для определения потенциальной вирулентности фага против клетки и применению CRISPR-cas для модулирования генетической последовательности фага для повышенного уровня вирулентности. В еще одних вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к средствам и композициям для разработки и применения фагов в качестве агентов биологического контроля.

Настоящее изобретение относится к способам для генерирования, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, содержащим стадии: (а) воздействия на материнский бактериальный штамм, содержащий, по меньшей мере, от части локуса CRISPR, по меньшей мере, до одной последовательности нуклеиновой кислоты для получения смеси бактерий, содержащей, по меньшей мере, один устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR; (b) выбора устойчивого к бактериофагам вариантного штамма из смеси бактерий; (с) выбора устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов, содержащих дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR из устойчивых к бактериофагам штаммов, выбранных на стадии (b); и (d) выделения, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, где штамм содержит дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, способы, кроме того, включают стадию сравнения локуса CRISPR или его части материнского бактериального штамма и модифицированного локуса CRISPR устойчивого к бактериофагам вариантного штамма для идентификации устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов, содержащих, по меньшей мере, один дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR, который отсутствует в локусе CRISPR материнского бактериального штамма. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, способы, кроме того, включают стадию выбора устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов, содержащих дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR. В некоторых вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм подвергается воздействию двух или более последовательностей нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм подвергается одновременному воздействию двух или более последовательностей нуклеиновых кислот, тогда как в некоторых альтернативных вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм последовательно подвергается воздействию двух или более последовательностей нуклеиновых кислот. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм подвергается воздействию последовательности нуклеиновых кислот посредством инфекции, по меньшей мере, одним бактериофагом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере, один бактериофаг выбран из группы семейств вирусов, состоящей из: Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae и Tectiviridae. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере, один бактериофаг представляет собой естественно встречающийся бактериофаг, тогда как в некоторых других предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере, один бактериофаг представляет собой мутированный бактериофаг, полученный посредством селективного давления с использованием устойчивого к бактериофагам бактериального штамма. В еще одних предпочтительных вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм подвергается воздействию нуклеиновой кислоты посредством естественного механизма захвата нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления, естественный механизм захвата нуклеиновых кислот включает естественную компетентность. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, естественный механизм захвата нуклеиновых кислот материнского бактериального штамма осуществляется конъюгацией или трансформацией. В еще одних вариантах осуществления, устойчивый к бактериофагам штамм представляет собой нечувствительный к бактериофагам мутант. В еще одних дополнительных вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм представляет собой нечувствительный к бактериофагам мутант. В некоторых других вариантах осуществления, конец 5' и/или конец 3' локуса CRISPR материнского бактериального штамма сравнивается с модифицированным локусом CRISPR устойчивого к бактериофагам вариантного штамма. В некоторых других вариантах осуществления, конец 5' и/или конец 3', по меньшей мере, первого повтора CRISPR или, по меньшей мере, первого спейсера CRISPR локуса CRISPR материнского бактериального штамма сравнивается с модифицированным локусом CRISPR устойчивого к бактериофагам вариантного штамма. В еще одних вариантах осуществления, устойчивый к бактериофагам вариантный штамм содержит, по меньшей мере, один дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере, часть локуса CRISPR материнского бактериального штамма и, по меньшей мере, часть модифицированного локуса CRISPR устойчивого к бактериофагам вариантного штамма сравниваются амплификацией, по меньшей мере, части локуса CRISPR и, по меньшей мере, части модифицированного локуса CRISPR, для получения амплифицированной последовательности локуса CRISPR и амплифицированной последовательности модифицированного локуса CRISPR. В еще одних вариантах осуществления, амплификация проводится с использованием PCR (полимеразной цепьевой реакции). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере, часть локуса CRISPR материнского бактериального штамма и, по меньшей мере, часть модифицированного локуса CRISPR устойчивого к бактериофагам вариантного штамма сравниваются секвенированием, по меньшей мере, части локуса CRISPR и, по меньшей мере, части модифицированного локуса CRISPR. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, способы, кроме того, включают стадию секвенирования амплифицированной последовательности локуса CRISPR и амплифицированной последовательности модифицированного локуса CRISPR. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR представляет собой дополнительный элемент повтора-спейсера. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, дополнительный элемент повтора-спейсера содержит, по меньшей мере, 44 нуклеотида. В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления, дополнительный элемент повтора-спейсера содержит от примерно 44 до примерно 119 нуклеотидов. Однако не предполагается, что настоящее изобретение должно ограничиваться этими определенными диапазонами размера, поскольку другие размеры могут использоваться в настоящем изобретении, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления, дополнительный элемент повтора-спейсера содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 95% идентичность с повтором CRISPR в локусе CRISPR материнского бактериального штамма. В некоторых других вариантах осуществления, дополнительный элемент повтора-спейсера содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 95% идентичность с нуклеотидной последовательностью в геноме, по меньшей мере, одного бактериофага. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм представляет собой промышленно применимый штамм. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм восприимчив к инфекции, по меньшей мере, одним бактериофагом. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм содержит культуру, выбранную из заквасочных культур, пробиотических культур и культур пищевых добавок. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм содержит штамм, полученный из культуры. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, культура представляет собой заквасочную культуру, пробиотическую культуру и/или культуру пищевой добавки. В еще одних дополнительных вариантах осуществления, материнский бактериальный штамм выбран из Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella, Campylobacter, Klebsiella, Frankia, Bartonella, Rickettsia, Shewanella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Providencia, Brochothrix, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc и Oenococcus

Настоящее изобретение также относится, по меньшей мере, к одному устойчивому к бактериофагам вариантному штамму, полученному с использованием представленных в настоящем описании способов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к устойчивым к бактериофагам вариантным штаммам, где устойчивый к бактериофагам вариантный штамм представляет собой промышленно применимый штамм, который представляет собой, по меньшей мере, один компонент заквасочной культуры, пробиотической культуры, культуры пищевой добавки и/других полезных культур.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, полученный с использованием представленных в настоящем описании способов. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим, по меньшей мере, два устойчивых к бактериофагам вариантных штамма, полученных с использованием представленных в настоящем описании способов. Настоящее изобретение также относится к пищевым продуктам и/или кормам, содержащим, по меньшей мере, одну из этих композиций. Настоящее изобретение также относится к способам получения пищевых продуктов и/или кормов, включающим добавление, по меньшей мере, одной из этих композиций к пище или корму. Настоящее изобретение также относится к заквасочным культурам, пробиотическим культурам, культурам пищевых добавок и другим полезным культурам, которые содержат, по меньшей мере, одну из этих композиций. Настоящее изобретение также относится к способам ферментации, включающим добавление, по меньшей мере, одной из этих композиций к заквасочной культуре. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение также относится к способам ферментации, включающим добавление, по меньшей мере, одной из этих композиций к среде ферментации в условиях, при которых происходит брожение компонентов среды ферментации. В некоторых вариантах осуществления, на брожение не воздействует присутствие бактериофагов. В некоторых вариантах осуществления, среда ферментации представляет собой пищевой продукт. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, пищевой продукт представляет собой диетический продукт. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, диетический продукт представляет собой молоко. В некоторых других вариантах осуществления, по меньшей мере, две различные композиции, содержащие два или более устойчивых к бактериофагам вариантных штамма, последовательно подвергаются воздействию среды ферментации.

Настоящее изобретение также относится к способам уменьшения вредной популяции бактериофагов в среде ферментации, включающим воздействие на среду ферментации, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, полученного с использованием представленных в настоящем описании способов в условиях, при которых уменьшается популяция бактериофагов.

Настоящее изобретение также относится к способам генерирования, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, включающим стадии: (а) воздействия на материнский бактериальный штамм, содержащий, по меньшей мере, от части локуса CRISPR, по меньшей мере, до одной последовательности нуклеиновой кислоты для получения смеси бактерий, содержащей, по меньшей мере, один устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR; (b) выбора устойчивого к бактериофагам вариантного штамма из смеси бактерий; (с) сравнения локуса CRISPR или его части материнского бактериального штамма и модифицированного локуса CRISPR устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, содержащего, по меньшей мере, один дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR, который отсутствует в локусе CRISPR материнского бактериального штамма; (d) выбора устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов, содержащих дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR; (е) анализа, по меньшей мере, одного дополнительного фрагмента нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR для идентификации, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма; и (f) выделения, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма.

Настоящее изобретение также относится к способам генерирования мутантов фагов, избегающих CRISPR, включающим: (а) получение, по меньшей мере, одного материнского фага и устойчивого к фагам бактериального штамма, содержащего, по меньшей мере, один локус CRISPR, где локус CRISPR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, примерно на 95% идентична, по меньшей мере, одной протоспейсерной последовательности в геноме, по меньшей мере, одного материнского фага; (b) воздействие, по меньшей мере, на один материнский фаг устойчивого к фагам бактериального штамма в таких условиях, чтобы был получен, по меньшей мере, один вариант фага; и (с) отбор, по меньшей мере, одного варианта фага, где, по меньшей мере, один вариант фага проявляет способность инфицировать устойчивый к фагам бактериальный штамм и представляет собой мутант фага, избегающий CRISPR. В некоторых вариантах осуществления, устойчивый к фагам бактериальный штамм представляет собой устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, полученный с использованием представленных в настоящем описании способов. В некоторых вариантах осуществления, способы, кроме того, включают стадию сравнения, по меньшей мере, части, по меньшей мере, одной протоспейсерной последовательности и мотива CRISPR, расположенного около, по меньшей мере, одной протоспейсерной последовательности в варианте фага, по меньшей мере, с одной протоспейсерной последовательностью и мотивом CRISPR материнского фага. В еще одних дополнительных вариантах осуществления, способы, кроме того, включают стадию выбора вариантных фагов, которые инфицируют устойчивый к фагам бактериальный штамм, где вариантные фаги содержат мутанты фагов, избегающих CRISPR, и где фаги, избегающие CRISPR, содержат, по меньшей мере, одну мутацию, по меньшей мере, в одной протоспейсерной последовательности и/или в мотиве CRISPR мутантов фагов, избегающих CRISPR. В еще одних дополнительных вариантах осуществления, способы постоянно повторяются один или несколько раз с использованием мутантов фагов, избегающих CRISPR и другого устойчивого к фагам CRISPR бактериального штамма, содержащего, по меньшей мере, один локус CRISPR, где локус CRISPR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 95% идентична, по меньшей мере, одной протоспейсерной последовательности мутантов фагов, избегающих CRISPR. В еще одних дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере, один бактериофаг выбран из группы семейств вирусов, состоящей из Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae и Tectiviridae. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, устойчивый к фагам бактериальный штамм выбран из Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Enterococcus, Clostridium, Camplyobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella, Klebsiella, Frankia, Bartonella, Rickettsia, Shewanella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Providencia, Brochothrix, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus и Oenococcus.

Настоящее изобретение также относится к мутантам фагов, избегающих CRISPR, полученным с использованием представленных в настоящем описании способов. В некоторых вариантах осуществления, мутанты фагов, избегающих CRISPR, содержат две или более мутации, присутствующие, по меньшей мере, в двух протоспейсерных последовательностях и/или в мотиве CRISPR.

Настоящее изобретение также относится к мутантам фагов, избегающих CRISPR, где геном мутантов фагов, избегающих CRISPR, в целом создан методом генной инженерии для включения мутаций, по меньшей мере, в одном протоспейсере и/или мотиве CRISPR. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один мотив CRISPR мутирован в мутантах фагов, избегающих CRISPR, тогда как в некоторых альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере, один мотив CRISPR подвергнут делеции в мутантах фагов, избегающих CRISPR. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим, по меньшей мере, один мутант фага, избегающий CRISPR.

Настоящее изобретение также относится к способам регулирования бактериальных популяций в продукте, включающим воздействие на композиции, содержащие, по меньшей мере, один мутант фага, избегающий CRISPR, среды ферментации, где среда ферментации содержит, по меньшей мере, одну популяцию нежелательных бактерий, в таких условиях, что популяция нежелательных бактерий уменьшается, и среда ферментации используется для генерирования продукта. В некоторых вариантах осуществления, продукт выбран из пищевых продуктов, кормов, косметических изделий, продуктов для личного ухода, гигиенических продуктов, ветеринарных продуктов и пищевых добавок. В еще одних некоторых вариантах осуществления, способы повторяются, по меньшей мере, однократно, и другие композиции и/или композиции, содержащие другие мутанты фагов, избегающих CRISPR, используются при ротации.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам и композициям для применения одного или нескольких генов или белков cas для модулирования устойчивости в клетке против нуклеиновой кислоты-мишени или продукта ее транскрипции. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям и способам применения последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один ген cas, и, по меньшей мере, два повтора CRISPR вместе, по меньшей мере, с одним спейсером CRISPR, где, по меньшей мере, один спейсер CRISPR является гетерологичным, по меньшей мере, к одному гену cas, и/или, по меньшей мере, к двум повторам CRISPR, для модулирования устойчивости к нуклеиновой кислоте-мишени или продукты ее транскрипции. В еще одних дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится, по меньшей мере, к одной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один ген cas.

В еще одних вариантах осуществления, настоящее изобретение относится, по меньшей мере, к одной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один ген cas и, по меньшей мере, два повтора CRISPR. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один ген cas и, по меньшей мере, один спейсер CRISPR. В еще одних вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один ген cas и, по меньшей мере, один спейсер CRISPR и, по меньшей мере, два повтора CRISPR. В еще одних вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один ген cas и, по меньшей мере, два повтора CRISPR вместе, по меньшей мере, с одним спейсером CRISPR, где спейсер CRISPR является гетерологичным, по меньшей мере, к одному гену cas, и/или, по меньшей мере, к двум повторам CRISPR.

Настоящее изобретение также относится к конструктам, содержащим одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в настоящей заявке. В еще одних дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к векторам, содержащим одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот или один или несколько конструктов, описанных в настоящей заявке. В еще одних вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к клеткам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты или конструкт, или вектор, описанные в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к способам модулирования (например, придания или увеличения) устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, включающим стадии: (i) идентификации последовательности (например, консервативной последовательности) в организме (в некоторых вариантах осуществления, это последовательность, которая существенна для функции или выживания организма); (ii) получения спейсера CRISPR, который гомологичен идентифицированной последовательности; (iii) получения нуклеиновой кислоты (например, рекомбинантной нуклеиновой кислоты), содержащей, по меньшей мере, один ген cas, и, по меньшей мере, два повтора CRISPR вместе со спейсером; CRISPR; и (iv) введения нуклеиновой кислоты в клетку, таким образом, для придания клетке устойчивости к нуклеиновой кислоте-мишени или к продукту ее транскрипции.

Настоящее изобретение также относится к способам модулирования (например, придания или увеличения) устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, включающим стадии: (i) идентификации одного или нескольких спейсеров CRISPR или псевдо-спейсеров CRISPR в организме, устойчивом к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции; (ii) получения рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один ген или белок cas, и, по меньшей мере, два повтора CRISPR вместе с идентифицированными одним или несколькими спейсерами; и (iii) введения рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетку, таким образом, для придания клетке устойчивости к нуклеиновой кислоте-мишени или к продукту ее транскрипции.

Настоящее изобретение также относится к способам модулирования (например, придания или увеличения) устойчивости клетки, содержащей, по меньшей мере, один или несколько генов или белков cas и два или более повтора CRISPR к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, включающим стадии: (i) идентификации одного или нескольких спейсеров CRISPR в организме, устойчивом к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции; и (ii) модификации последовательности одного или нескольких спейсера(ов) CRISPR в клетке так, чтобы спейсер(ы) CRISPR имел гомологию спейсеру(ам) CRISPR в организме.

Настоящее изобретение также относится к способам модулирования (например, придания или увеличения) устойчивости клетки, содержащей, по меньшей мере, один или несколько генов или белков cas и два или более повтора CRISPR к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, включающим стадии: (i) идентификации одного или нескольких спейсеров CRISPR в организме, который по существу устойчив к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции; и (ii) модификации последовательности, по меньшей мере, одного или нескольких спейсера(ов) CRISPR в клетке так, чтобы спейсер(ы) CRISPR имел сниженную степень гомологии спейсеру(ам) CRISPR в организме.

Настоящее изобретение также относится к способам модулирования (например, придания или увеличения) устойчивости клетки, содержащей, по меньшей мере, один или несколько генов или белков cas и два или более повтора CRISPR к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, включающим модификацию одного или нескольких генов или белков cas и/или двух или более повторов CRISPR в клетке.

Настоящее изобретение также относится к способам идентификации спейсера CRISPR или псевдо-спейсера CRISPR для применения при модулировании устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, включающим стадии: (i) получения клетки, содержащей, по меньшей мере, два повтора CRISPR, и, по меньшей мере, один ген или белок cas; (ii) идентификации спейсера CRISPR или псевдо-спейсера CRISPR в организме, который по существу устойчив к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции; (iii) идентификации последовательности спейсера CRISPR в клетке с тем, чтобы спейсер имел гомологию со спейсером CRISPR организма; и (iv) определения того, модулирует ли клетка устойчивость к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, где модулирование устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции указывает на то, что спейсер CRISPR модулирует устойчивость клетки.

Настоящее изобретение также относится к способам идентификации гена cas для применения при модулировании устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, включающим стадии: (i) получения клетки, содержащей, по меньшей мере, один спейсер CRISPR и, по меньшей мере, два повтора CRISPR, (ii) генной инженерии клетки с тем, чтобы она содержала, по меньшей мере, один ген cas; и (iii) определения того, модулирует ли клетка устойчивость к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, где модулирование устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции указывает на то, что ген cas может применяться для модулирования устойчивости клетки.

Настоящее изобретение также относится к способам идентификации повтора CRISPR для применения при модулировании устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, включающим стадии: (i) получения клетки, содержащей, по меньшей мере, один спейсер CRISPR и, по меньшей один ген cas;(ii) генной инженерии клетки с тем, чтобы она содержала повтор CRISPR; и (iii) определения того, модулирует ли клетка устойчивость к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, где модулирование устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции указывает на то, что повтор CRISPR может применяться для модулирования устойчивости клетки.

Настоящее изобретение также относится к способам идентификации функциональной комбинации гена cas и повтора CRISPR, включающим стадии: (а) определения последовательностей гена cas и повтора CRISPR; (b) идентификации одного или нескольких кластеров генов cas, по данным определения анализом сравнения последовательностей; (с) идентификации одного или нескольких кластеров повторов CRISPR; и (d) комбинирования тех генов cas и повторов CRISPR, которые укладываются в пределы одного и того же кластера, где комбинация последовательностей гена cas и повтора CRISPR, в пределы одного и того же кластера указывает на то, что комбинация представляет собой функциональную комбинацию.

Настоящее изобретение также относится к способам модулирования фаготипа бактериальной клетки, содержащего один или несколько генов или белков cas и два или более повторов CRISPR, включающим стадии: (i) идентификации одного или нескольких псевдо-спейсеров CRISPR в геномной последовательности бактериофага, к которой должна модулироваться устойчивость; и (ii) модификации последовательности одного или нескольких спейсеров CRISPR бактериальной клетки с тем, чтобы спейсер(ы) CRISPR бактериальной клетки имел гомологию с псевдо-спейсером (спейсерами) CRISPR бактериофага, устойчивость к которому должна модулироваться.

Настоящее изобретение также относится к способам модулирования (например, придания или увеличения) устойчивости бактериальной клетки к бактериофагу, включающим стадии: (i) идентификации последовательности (например, консервативной последовательности) в бактериофаге (предпочтительно, последовательности, существенной для функции или выживания бактериофага); (ii) получения спейсера CRISPR, который гомологичен идентифицированной последовательности; (iii) получения нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один ген cas и, по меньшей мере, два повтора CRISPR вместе со спейсером CRISPR; и (iv) введение нуклеиновой кислоты в бактериальную клетку, таким образом, делая бактериальную клетку устойчивой к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции.

Настоящее изобретение также относится к способам модулирования (например, придания или увеличения) устойчивости бактериальной клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции в бактериофаге, включающим стадии: (i) идентификации одного или нескольких псевдо-спейсеров CRISPR в геноме бактериофага, который способен обеспечить устойчивость к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции; (ii) получения рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей, по меньшей мере, один ген cas и, по меньшей мере, два повтора CRISPR вместе с идентифицированными одним или несколькими псевдо-спейсерами CRISPR; и (iii) введения рекомбинантной нуклеиновой кислоты в бактериальную клетку, таким образом, делая бактериальную клетку устойчивой к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции.

Настоящее изобретение также относится к способам модулирования устойчивости бактериальной клетки, содержащей один или более генов или белков cas и два или более повторов CRISPR к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции в бактериофаге, включающим стадии: (i) идентификации одного или нескольких псевдо-спейсеров CRISPR в бактериофаге, который способен обеспечить устойчивость к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции; (ii) идентификации одного или нескольких спейсеров CRISPR в бактериальной клетке, в которой должна модулироваться устойчивость; и (iii) модификации последовательности спейсера(ов) CRISPR в бактериальной клетке, в которой должна модулироваться устойчивость, с тем, чтобы спейсер(ы) CRISPR имел более высокую степень гомологии с псевдо-спейсером (спейсерами) CRISPR бактериофага, к которому должна модулироваться устойчивость.

Настоящее изобретение также относится к способам определения устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции, включающим идентификацию одной или нескольких функциональных комбинаций повтора CRISPR-cas и одного или нескольких спейсеров CRISPR в клетке.

Настоящее изобретение также относится к клеткам, полученным или получаемым с использованием представленных в настоящем описании способов. В некоторых вариантах осуществления. настоящее изобретение относится к спейсерам CRISPR или псевдо-спейсерам CRISPR, полученным или получаемым способами, описанными в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к генам cas, полученным или получаемым способами, описанными в настоящей заявке. В некоторых других вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к повторам CRISPR, полученным или получаемым способами, описанными в настоящей заявке. В еще одних вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к функциональным комбинациям, полученным или получаемым способами, описанными в настоящей заявке. В еще одних вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к рекомбинантным локусам CRISPR, содержащим, по меньшей мере, один спейсер CRISPR или псевдо-спейсер CRISPR, и/или, по меньшей мере, один ген cas, и/или, по меньшей мере, один повтор CRISPR и/или функциональную комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам применения клеток, по меньшей мере, одного спейсера CRISPR или псевдо-спейсера CRISPR, по меньшей мере, одного гена cas, по меньшей мере, одного повтора CRISPR или их функциональной комбинации для модулирования устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции.

В некоторых других вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к клеточным культурам, содержащим, по меньшей мере, одну клетку, по меньшей мере, один спейсер CRISPR или псевдо-спейсер CRISPR, по меньшей мере, один ген cas, по меньшей мере, один повтор CRISPR или функциональную комбинацию для модулирования устойчивости клетки к нуклеиновой кислоте-мишени или продукту ее транскрипции.

В некоторых других вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к пищевым продуктам и/или корму, содержащих представленные в настоящем описании культуры. В некоторых других вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам получения пищевых продуктов и/или корма, содержащих представленные в настоящем описании культуры. В других дополнительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к пищевым продуктам и/или корму, полученным или получаемым представленным в настоящем описании способами. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам применения культур, представленных в настоящем описании, для получения пищевых продуктов и/или корма.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к нуклеотидным последовательностям, содержащим или