Иммуноглобулины с уменьшенной агрегацией

Иммуноглобулины с уменьшенной агрегацией

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие относится к улучшенным иммуноглобулинам, которые обладают уменьшенной агрегацией.

Уровень техники

Область понимания и контроля стабильности белков была желанным устремлением биологов, химиков и инженеров. Первая связь между аминокислотной заменой и заболеванием (Ingram. Nature. 1957, 180(4581): 326-8) открыла новые и имеющие принципиальное значение горизонты в области исследований стабильности белков в норме и патологии. Серьезное увеличение количества препаратов на основе белков в последнее время, особенно препаратов на основе иммуноглобулинов, привело к появлению новой проблемы. Терапевтические белки хранятся в жидкости в течение нескольких месяцев при очень высоких концентрациях. С течением времени увеличивается процент немономерных видов. Образование агрегатов не только уменьшает эффективность продукта, но также может привести к появлению побочных эффектов, таких как иммунный ответ на введение. Гарантия стабильности белкового фармацевтического препарата в течение срока годности продукта является первоочередным требованием.

По причине высокого потенциала антител при лечении различных заболеваний, в настоящее время они являются наиболее быстро растущим классом терапевтических препаратов для человека (Carter. Nature Reviews Immunology. 2006, 6(5), 343). С 2001 года, рынок таких препаратов растет в среднем ежегодно со скоростью 35%, с наибольшей скоростью среди всех категорий биотехнологических лекарственных средств (S.Aggarwal. Nature. BioTech. 2007, 25 (10) 1097).

Терапевтические иммуноглобулины получают и хранят в водных растворах в высоких концентрациях, т.к. это требуется для лечения заболеваний. Однако в таких условиях эти иммуноглобулины являются термодинамически нестабильными и деградируют в результате агрегации. Агрегация, в свою очередь, приводит к уменьшению активности антител, делая лекарственное средство неэффективным, и даже может вызвать иммунный ответ. Таким образом, существует неотложная потребность в получении терапевтических иммуноглобулинов менее склонных к агрегации.

Во множестве существующих подходов для предотвращения агрегации иммуноглобулинов прибегают к применению добавок составах на основе белков. Такой подход отличается от описанного в данном документе прямого подхода, в котором иммуноглобулин сам по себе модифицируют в предрасполагающих к агрегации областях, предсказанных с помощью молекулярного моделирования. Добавки, обычно используемые для стабилизации антител, являются солями азотсодержащих оснований, таких как аргинин, гуанидин или имидазол (ЕР 0025275). Другими подходящими добавками для стабилизации являются полиэфиры (ЕРА 0018609), глицерин, альбумин и декстран сульфат (патент США №. 4808705), детергенты и ПАВ, такие как ПАВ на основе полисорбата (публикация DE 2652636, и публикация GB 2175906 (заявка на патент Великобритании № GB 8514349)), шапероны, такие как GroEL (Mendoza. Biotechnol. Tech. 1991, (10) 535-540), нитратный буфер (WO 9322335) или хелатирующие агенты (WO 9115509). Хотя эти добавки позволяют в некоторой степени стабилизировать белки в растворе, они страдают от определенных недостатков, таких как необходимость дополнительных стадий обработки для удаления добавок.

Для улучшения других характеристик, таких как связывание с Fc-рецептором, были получены оптимизированные варианты иммуноглобулинов. Например, получили набор двухсот шестнадцати вариантов антитела (включая мутантные виды L234 и L235) и протестировали их на эффект связывания с FcγRIIIa и FcγRIIb, как раскрыто в публикации США 2004/0132101 (Lazar et al.). Однако Lazar et al. не тестировали какой-либо из вариантов антитела на предмет их склонности к агрегации.

Таким образом, существует потребность в улучшенных иммуноглобулиновых композициях, таких как терапевтические препараты с антителами, напрямую стабилизированные без применения добавок.

Раскрытие изобретения

Описанное в данном документе является удовлетворяющими эту потребность в улучшенных иммуноглобулинах, которые демонстрируют уменьшенную агрегацию и/или улучшенную стабильность.

Таким образом, один аспект включает модифицированные и/или изолированные иммуноглобулины, обладающие уменьшенной склонностью к агрегации и содержащие, по меньшей мере, одну уменьшающую агрегацию мутацию в остатке из консервативного домена иммуноглобулина, который (i) имеет значение пространственной склонности к агрегации (ПСА) (радиус сферы 5 Å) равное, по меньшей мере, 0,15, или (ii) имеет значение ПСА больше чем 0,0 и находится в пределах 5 Å от остатка имеющего значение ПСА (радиус сферы 5 Å) равное, по меньшей мере, 0,15, где, по меньшей мере, одна уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, который снижает значение ПСА (радиус сферы 5 Å) остатка по сравнению с немутированным иммуноглобулином, а агрегация, склонность к которой уменьшается, является агрегацией между молекулами иммуноглобулина в концентрированном жидком растворе. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна уменьшающая агрегацию мутация не является остатком, соответствующим по Кабату остатку 234 (шарнир) или 235 (шарнир) в IgG1 на основании выравнивания с последовательностью IgG1. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин имеет вторую мутацию, уменьшающую агрегацию, в остатке, который (1) имеет значение ПСА (радиус сферы 5 Å) равное, по меньшей мере, 0,15, или (ii) имеет значение ПСА (радиус сферы 5 Å) больше чем 0,0 и находится в пределах 5 Å относительно остатка, имеющего значение ПСА (радиус сферы 5 Å) равное, по меньшей мере, 0,15, где вторая уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, который снижает значение ПСА (радиус сферы 5 Å) остатка по сравнению с немутированным иммуноглобулином. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, имеющими вторую уменьшающую агрегацию мутацию, где уменьшающая агрегацию мутация и вторая уменьшающая агрегацию мутация находятся на расстоянии, по меньшей мере, 5 Å, по меньшей мере, 10 Å, по меньшей мере, 15 Å, по меньшей мере, 20 Å друг от друга. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, имеющими вторую уменьшающую агрегацию мутацию, уменьшающая агрегацию мутация и вторая уменьшающая агрегацию мутация находятся в разных вызывающих агрегацию мотивах. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, который является менее гидрофобным, чем остаток в модифицированном иммуноглобулине. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из лизина, аргинина, гистидина, глутамата, аспартата, глутамина и аспарагина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из лизина, аргинина и гистидина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, уменьшающая агрегацию мутация является заменой на остаток лизина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, значение ПСА (радиус сферы 5 Å) рассчитывается с помощью шкалы гидрофобности Блэка-Моулд, нормализованной так, чтобы глицин был равен 0. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин является IgG1, IgG2, IgG3, или IgG4. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин является IgG1. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин имеет человеческий домен С_Н1. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин имеет человеческий домен С_Н2. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин имеет человеческий домен С_Н3. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин имеет человеческий домен CL. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин обладает сродством связывания с целевым антигеном и сродство связывания с целевым антигеном составляет, по меньшей мере, семьдесят процентов, по меньшей мере, восемьдесят процентов, по меньшей мере, девяносто процентов, по меньшей мере, сто процентов, или, по меньшей мере, сто пять процентов от сродства связывания с целевым антигеном немутированного иммуноглобулина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, концентрированный жидкий раствор имеет концентрацию, по меньшей мере, 10 мг/мл, по меньшей мере, 20 мг/мл, по меньшей мере, 30 мг/мл, по меньшей мере, 40 мг/мл, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 75 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл, по меньшей мере, 125 мг/мл, по меньшей мере, 150 мг/мл.

Другой аспект включает измененный или выделенный иммуноглобулин, обладающий уменьшенной склонностью к агрегации, который содержит, по меньшей мере, одну уменьшающую агрегацию мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из остатков мотива агрегации 1: 174 (С_Н1), 175 (С_Н1), и 181 (С_Н1), мотива агрегации 2:226 (шарнир), 227 (шарнир), 228 (шарнир), 229 (шарнир), 230 (шарнир), 231 (шарнир) и 232 (шарнир); мотива агрегации 3:234 (шарнир) и 235(шарнир); мотива агрегации 4:252 (С_Н2) и 253 (C_H2); мотива агрегации 5:282 (С_Н1); мотива агрегации 6:291 (С_Н2); мотива агрегации 7: 296 (С_Н2); мотива агрегации 8:308 (С_Н2) и 309 (С_Н2); мотива агрегации 9: 328 (С_Н2), 329 (С_Н2), 330 (С_Н2) и 331 (С_Н2); мотива агрегации 10:395 (С_Н3), 396 (С_Н3), 397 (С_Н3), 398 (С_Н3) и 404 (С_Н3); мотива агрегации 11:443 (С_Н3); мотива агрегации 12:110 (C_L) и 111 (C_L); мотива агрегации 13:153 (C_L) и 154 (C_L) и мотива агрегации 14: 201 (C_L), и в котором, по меньшей мере, одна уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, который является менее гидрофобным, чем остаток в немодифицированном иммуноглобулине и агрегация, склонность к которой уменьшается, является агрегацией между молекулами иммуноглобулина в концентрированном жидком растворе; и в котором номера остатков соответствуют номерам остатков по Кабату в IgG1 на основе выравнивания с последовательностью IgG1. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна уменьшающая агрегацию мутация выбирается из группы, состоящей из остатков мотива агрегации 1: 175 (С_Н1); мотива агрегации 2: 227 (шарнир), 228 (шарнир), и 230 (шарнир); мотива агрегации 3: 234 (шарнир) и 235 (шарнир); мотива агрегации 4: 253 (С_Н2); мотива агрегации 5: 282 (С_Н2); мотива агрегации 6: 291 (С_Н2); мотива агрегации 7: 296 (С_Н3); мотива агрегации 8: 309 (С_Н2); мотива агрегации 9: 329 (С_Н1) и 330 (С_Н2); мотива агрегации 10: 395 (С_Н3) и 398 (С_Н3); мотива агрегации 11: 443 (С_Н3); мотива агрегации 12: 110 (C_L); мотива агрегации 13: 154 (C_L); и мотива агрегации 14: 201 (C_L). В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, уменьшающей агрегацию мутацией не являются остатки 234 (шарнир) или 235 (шарнир). В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, остатком уменьшающей агрегацию мутации являются 234 (шарнир), 235 (шарнир), 253 (С_Н1) или 309 (С_Н1). В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, остатком уменьшающей агрегацию мутации являются 253 (С_Н2) или 309 (С_Н2). В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, иммуноглобулин обладает второй уменьшающей агрегацию мутацией в гидрофобном остатке, который (i) имеет значение ПСА равное, по меньшей мере, 0,15, или который (ii) находится в пределах 5 Å от остатка имеющего значение ПСА равное, по меньшей мере, 0,15, где третья уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, который является менее гидрофобным, чем остаток в немодифицированном иммуноглобулине. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, имеющими вторую уменьшающую агрегацию мутацию, где уменьшающая агрегацию мутация и вторая уменьшающая агрегацию мутация находятся на расстоянии, по меньшей мере, 5 Å, по меньшей мере, 10 Å, по меньшей мере, 15 Å, по меньшей мере, 20 Å друг от друга. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, имеющих вторую уменьшающую агрегацию мутацию, уменьшающая агрегацию мутация и вторая уменьшающая агрегацию мутация находятся в отдельных вызывающих агрегацию мотивах. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет, по меньшей мере, пятнадцать уменьшающих агрегацию мутаций, где каждая уменьшающая агрегацию мутация выбирается из отдельного вызывающего агрегацию мотива. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из лизина, аргинина, гистидина, глутамата, аспартата, глутамина и аспарагина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из лизина, аргинина и гистидина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, уменьшающая агрегацию мутация является заменой на остаток лизина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, значение ПСА (радиус сферы 5 Å) рассчитывается с помощью шкалы гидрофобности Блэка-Моулд, нормализованной так, чтобы глицин был равен 0. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин является IgG1, IgG2, IgG3, или IgG4. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин содержит IgG1. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет человеческий домен С_Н1. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет человеческий домен С_Н2. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет человеческий домен С_Н3. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет человеческий домен C_L. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин обладает сродством связывания с целевым антигеном и сродство связывания с целевым антигеном составляет, по меньшей мере, семьдесят процентов, по меньшей мере, восемьдесят процентов, по меньшей мере, девяносто процентов, по меньшей мере, сто процентов, или, по меньшей мере, сто пять процентов от сродства связывания с целевым антигеном немутированного иммуноглобулина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, концентрированный жидкий раствор имеет концентрацию, по меньшей мере, 10 мг/мл, по меньшей мере, 20 мг/мл, по меньшей мере, 30 мг/мл, по меньшей мере, 40 мг/мл, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 75 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл, по меньшей мере, 125 мг/мл, по меньшей мере, 150 мг/мл.

Другой аспект включает составы с измененным иммуноглобулином, которые могут быть сделаны из иммуноглобулина любого из предыдущих аспектов и с любой и со всеми комбинациями предыдущих воплощений в концентрации, по меньшей мере, 10 мг/мл, по меньшей мере, 20 мг/мл, по меньшей мере, 30 мг/мл, по меньшей мере, 40 мг/мл, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 75 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл, по меньшей мере, 125 мг/мл или, по меньшей мере, 150 мг/мл. В некоторых воплощениях, иммуноглобулин находится в концентрации большей, чем концентрация, при которой немутированный иммуноглобулин агрегирует сам с собой в концентрированном жидком растворе в тех же условиях. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, по меньшей мере, восемьдесят процентов, по меньшей мере, восемьдесят пять процентов, по меньшей мере, девяносто процентов, по меньшей мере, девяносто пять процентов, по меньшей мере, девяносто шесть процентов, по меньшей мере, девяносто семь процентов, по меньшей мере, девяносто восемь процентов или, по меньшей мере, девяносто девять процентов измененного иммуноглобулина является неагрегированным мономером. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, состав включает фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, состав с иммуноглобулином демонстрирует, по меньшей мере, на пять процентов, по меньшей мере, на десять процентов, по меньшей мере, на пятнадцать процентов, по меньшей мере, на двадцать процентов, по меньшей мере, на двадцать пять процентов, по меньшей мере, на тридцать процентов, по меньшей мере, на тридцать пять процентов, по меньшей мере, на сорок процентов или, по меньшей мере, на пятьдесят процентов меньше агрегации после двадцати четырех часовой ускоренной агрегации по сравнению с немутированным иммуноглобулином в тех же условиях. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, агрегация измеряется с помощью гель-фильтрации с ВЭЖХ. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, состав с иммуноглобулином практически не содержит каких-либо добавок, уменьшающих агрегацию иммуноглобулинов. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, состав с иммуноглобулином практически не содержит свободного гистидина, сахаридов и полиолов.

Еще один аспект включает изолированные или рекомбинантные полинуклеотиды, которые кодируют иммуноглобулин по любому из предыдущих аспектов, касающихся модифицированного иммуноглобулина, и по любой или всем комбинациям предыдущих воплощений. В некоторых воплощениях, полинуклеотид находится в векторе. В некоторых воплощениях, вектор является экспрессирующим вектором. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, с полинуклеотидом функционально связан индуцируемый промотор. Другой аспект включает клетки-хозяина с вектором любого из предыдущих воплощений. В некоторых воплощениях, клетки-хозяина способны экспрессировать иммуноглобулин, кодируемый полинуклеотидом.

Еще один аспект включает способы получения иммуноглобулина с уменьшенной склонностью к агрегации, включающие обеспечение культуральной среды, содержащей клетки-хозяина предыдущего аспекта, и помещение культуральной среды в условия, в которых экспрессируется иммуноглобулин. В некоторых воплощениях, способы включают дополнительную стадию изолирования экспрессируемого иммуноглобулина.

Другой аспект включает способы уменьшения склонности к агрегации иммуноглобулина в сильноконцентрированном фармацевтическом составе, которые включают: обеспечение иммуноглобулина, склонного к агрегации; замену остатка в консервативном домене иммуноглобулина, который (1) имеет значение ПСА равное, по меньшей мере, 0,15, или (ii) имеет значение ПСА (радиус сферы 5 Å) больше чем 0,0 и находится в пределах 5 Å от остатка, имеющего значение ПСА равное, по меньшей мере, 0,15, на аминокислотный остаток, который снижает значение ПСА (радиус сферы 5 Å); и образование высококонцентрированного жидкого состава с модифицированным иммуноглобулином, в котором концентрация измененного иммуноглобулина составляет, по меньшей мере, 20 мг/мл, по меньшей мере, 30 мг/мл, по меньшей мере, 40 мг/мл, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 75 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл, по меньшей мере, 125 мг/мл, или, по меньшей мере, 150 мг/мл, и в котором агрегация, склонность к которой уменьшается, является агрегацией между молекулами иммуноглобулина в концентрированном жидком растворе.

Другой аспект включает применения измененного иммуноглобулина по любому из предыдущих аспектов и по любой и всем комбинациям предыдущих воплощений для изготовления лекарственного средства, содержащего высококонцентрированный жидкий состав, в котором концентрация модифицированного иммуноглобулина составляет, по меньшей мере, 20 мг/мл, по меньшей мере, 30 мг/мл, по меньшей мере, 40 мг/мл, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 75 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл, по меньшей мере, 125 мг/мл, или, по меньшей мере, 150 мг/мл. В некоторых воплощениях применения лекарственное средство предназначается для лечения аутоиммунных заболеваний, иммунологических заболеваний, инфекционных заболеваний, воспалительных заболеваний, неврологических заболеваний и онкологических и неопластических заболеваний, включая злокачественное новообразование. В некоторых воплощениях применения лекарственное средство предназначается для лечения застойной сердечной недостаточности, васкулита, розацеа, акне, экземы, миокардита и других состояний миокарда, системной красной волчанки, диабета, спондилопатий, синовиальных фибробластов и стромы костного мозга; потери костной массы; болезни Педжета, остеокластомы, рака молочной железы; остеопении при бездействии; нарушения питания, пародонтоза, болезни Гоше, гистиоцитоза клеток Лангерганса, травмы спинного мозга, острого септического артрита, остеомаляции, синдрома Кушинга, монооссальной формы фиброзной дисплазии, полиоссальной формы фиброзной дисплазии, периодонтальной реконструкции и переломов костей; саркоидоза; остолитических злокачественных опухолей костей, рака молочной железы, рака легких, рака почек и рака прямой кишки; костных метастазов, купировании болевого синдрома в костях и гуморальной злокачественной гиперкальциемии, анкилозирующего спондилита, и других спонгилоартропатий; отторжения при трансплантации, вирусных инфекций, гематологических неоплазий и похожих на неоплазии состояний, например, ходжкинской лимфомы; неходжкинской лимфомы (лимфомы Беркитта, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы/хронического лимфолейкоза, грибовидного лейкоза, лимфомы из клеток мантии, фолликулярной лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, волосатоклеточного лейкоза и лимфоплазматической лейкемии), опухоли клеток-предшественников лейкоцитов, включая В-клеточный острый лимфобластный лейкоз/лимфому, тимому, опухоли зрелых Т-клеток и натуральных киллеров, включая лейкемии периферических Т-клеток, зрелой Т-клеточной лейкемии/Т-клеточной лимфомы, лейкемии больших гранулярных лимфоцитов, гистиоцитоза из клеток Лангерганса, миелоидных неоплазий, таких как острые миелобластные лейкозы, включая ОМЛ без созревания, ОМЛ без дифференцировки, острую промиелоцитарную лейкемию, острую миеломоноцитарную лейкемию, и острые моноцитарные лейкемии, миелодиспластические синдромы и хронические миелопролиферативные расстройства, в том числе хронические миелоидные лейкемии, новообразований центральной нервной системы, например новообразований мозга (глиомы, нейробластомы, астроцитомы, медуллобластомы, эпендимомы и ретинобластомы), солидных опухолей (рака носоглотки, базальноклеточного рака, рака поджелудочной железы, рака желчного протока, саркомы Калоши, рака яичек, рака матки, влагалища и шейки матки, рака яичников, первичного рака печени или рака эндометрия, и новообразований сосудистой системы (ангиосаркомы и гемангиоперицитомы), остеопороза, гепатита, ВИЧ, СПИД, спондилоартрита, ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний кишечника, сепсиса и септического шока, болезни Крона, псориаза, склеродермы, реакции «трансплантат против хозяина», отторжения аллогенного островкового трансплантата, гематологических злокачественных новообразований, таких как множественная миелома, миелодиспластический синдром и острый миелобластный лейкоз, воспалений, ассоциированных с опухолями, травм периферических нервов или демиелинизирующих заболеваний. В некоторых воплощениях применения лекарственное средство предназначается для лечения пятнистого псориаза, язвенного колита, неходжкинской лимфомы, рака молочной железы, колоректального рака, ювенильного идиопатического артрита, дегенерации желтого пятна, респираторно-синцитиального вируса, болезни Крона, ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, остеопороза, потери костной массы, вызванной лечением, костных метастазов, множественной миеломы, болезни Альцгеймера, глаукомы и рассеянного склероза. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, применение лекарственного средства дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин в лекарственном средстве демонстрирует, по меньшей мере, на пять процентов, по меньшей мере, на десять процентов, по меньшей мере, на пятнадцать процентов, по меньшей мере, на двадцать процентов, по меньшей мере, на двадцать пять процентов, по меньшей мере, на тридцать процентов, по меньшей мере, на тридцать пять процентов, по меньшей мере, на сорок процентов или, по меньшей мере, на пятьдесят процентов меньше агрегации после двадцати четырех часовой ускоренной агрегации по сравнению с немутированным иммуноглобулином в тех же условиях. В некоторых воплощениях, агрегация измеряется с помощью гель-фильтрации с ВЭЖХ. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, лекарственное средство практически не содержит каких-либо добавок, уменьшающих агрегацию иммуноглобулинов. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, состав с иммуноглобулином практически не содержит свободного гистидина, сахаридов и полиолов.

Другой аспект включает применения измененного иммуноглобулина по любому из предыдущих аспектов и по любому и всем комбинациям предыдущих воплощений, в качестве неагрегирующего фармацевтически активного ингредиента.

Другой аспект включает фармацевтические композиции, которые содержат иммуноглобулин по любому из предыдущих аспектов и любой и всех комбинаций предыдущих воплощений и фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых воплощениях иммуноглобулин находится в концентрации, по меньшей мере, 10 мг/мл, по меньшей мере, 20 мг/мл, по меньшей мере, 30 мг/мл, по меньшей мере, 40 мг/мл, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 75 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл, по меньшей мере, 125 мг/мл, или, по меньшей мере, 150 мг/мл. В некоторых воплощениях, иммуноглобулин находится в концентрации большей, чем концентрация, при которой немутированный иммуноглобулин агрегирует сам с собой в концентрированном жидком растворе в тех же условиях. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, по меньшей мере, восемьдесят процентов, по меньшей мере, восемьдесят пять процентов, по меньшей мере, девяносто процентов, по меньшей мере, девяносто пять процентов, по меньшей мере, девяносто шесть процентов, по меньшей мере, девяносто семь процентов, по меньшей мере, девяносто восемь процентов или, по меньшей мере, девяносто девять процентов измененного иммуноглобулина является неагрегированным мономером. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, состав с иммуноглобулином демонстрирует, по меньшей мере, на пять процентов, по меньшей мере, на десять процентов, по меньшей мере, на пятнадцать процентов, по меньшей мере, на двадцать процентов, по меньшей мере, на двадцать пять процентов, по меньшей мере, на тридцать процентов, по меньшей мере, на тридцать пять процентов, по меньшей мере, на сорок процентов или, по меньшей мере, на пятьдесят процентов меньше агрегации после двадцати четырех часовой ускоренной агрегации по сравнению с немутированным иммуноглобулином в тех же условиях. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, агрегация измеряется с помощью гель-фильтрации с ВЭЖХ. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, состав с иммуноглобулином практически не содержит каких-либо добавок, уменьшающих агрегацию иммуноглобулинов. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, состав с иммуноглобулином практически не содержит свободного гистидина, сахаридов и полиолов.

Другой аспект включает модифицированный или изолированный иммуноглобулин, который обладает уменьшенной склонностью к агрегации, имеющий, по меньшей мере, одну уменьшающую агрегацию мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из 235 (шарнир), 241 (С_Н1), 243 (С_Н2), 282 (С_Н2) и 309 (С_Н2), где если выбирается остаток 235, то его мутируют в глутамин или серин, если выбирается остаток 282, то его мутируют в лизин, а если выбирается остаток 309, то его мутируют в лизин, и где, по меньшей мере, одна уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, который является менее гидрофобным, чем остаток в неизмененном иммуноглобулине, а агрегация, склонность к которой уменьшается, является агрегацией между молекулами иммуноглобулина в концентрированном жидком растворе; и где нумерация остатков соответствует нумерации остатков по Кабату в IgG1 на основе выравнивания с последовательностью IgG1. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна уменьшающая агрегацию мутация является мутацией остатка 241 в серин, а модифицированный и изолированный иммуноглобулин дополнительно содержит вторую уменьшающую агрегацию мутацию остатка 243 в серин. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна уменьшающая агрегацию мутация является мутацией остатка 241 в тирозин, и модифицированный и изолированный иммуноглобулин дополнительно содержит вторую уменьшающую агрегацию мутацию остатка 243 в тирозин. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, одна уменьшающая агрегацию мутация является мутацией остатка 282 в лизин, и модифицированный или изолированный иммуноглобулин дополнительно содержит вторую и третью уменьшающие агрегацию мутации, где вторая уменьшающая агрегацию мутация является мутацией остатка 235 в лизин, а третья уменьшающая агрегацию мутация является мутацией остатка 309 в лизин. В некоторых воплощения, иммуноглобулин имеет вторую уменьшающую агрегацию мутацию в гидрофобном остатке, где вторая уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, который является менее гидрофобным, чем остаток в неизмененном иммуноглобулине. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, имеющими вторую уменьшающую агрегацию мутацию, вторая уменьшающая агрегацию мутация (1) имеет значение ПСА равное, по меньшей мере, 0,15, или (ii) находится в пределах 5 Å от остатка, имеющего значение ПСА равное, по меньшей мере, 0,15. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, имеющими вторую уменьшающую агрегацию мутацию, иммуноглобулин обладает третьей уменьшающей агрегацию мутацией, которая (i) имеет значение ПСА равное, по меньшей мере, 0,15, или которая (ii) находится в пределах 5 Å от остатка, имеющего значение ПСА равное, по меньшей мере, 0,15, где третья уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, который является менее гидрофобным, чем остаток в неизмененном иммуноглобулине. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, имеющими вторую уменьшающую агрегацию мутацию, где уменьшающая агрегацию мутация и вторая уменьшающая агрегацию мутация находятся на расстоянии, по меньшей мере, 5 Å, по меньшей мере, 10 Å, по меньшей мере, 15 Å, по меньшей мере, 20 Å друг от друга. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, имеющих вторую уменьшающую агрегацию мутацию, уменьшающая агрегацию мутация и вторая уменьшающая агрегацию мутация находятся в отдельных вызывающих агрегацию мотивах. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет, по меньшей мере, пятнадцать уменьшающих агрегацию мутаций, где каждая уменьшающая агрегацию мутация выбирается из отдельного вызывающего агрегацию мотива. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из лизина, аргинина, гистидина, глутамата, аспартата, глутамина, аспарагина, тирозина и серина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, уменьшающая агрегацию мутация является заменой на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из лизина, серина, глутамата и тирозина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, значение ПСА (радиус сферы 5 Å) рассчитывается с помощью шкалы гидрофобности Блэка-Моулд, нормализованной так, чтобы глицин был равен 0. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин является IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин содержит IgG1. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет человеческий домен СН1. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет человеческий домен СН2. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет человеческий домен СН3. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин имеет человеческий домен C_L. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с любым из предыдущих воплощений, иммуноглобулин обладает сродством связывания к целевому антигену и сродство связывания к целевому антигену составляет, по меньшей мере, семьдесят процентов, по меньшей мере, восемьдесят процентов, по меньшей мере, девяносто процентов, по меньшей мере, сто процентов, или, по меньшей мере, сто пять процентов относительно сродства связывания с целевым антигеном немутированного иммуноглобулина. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, концентрированный жидкий раствор имеет концентрацию, по меньшей мере, 10 мг/мл, по меньшей мере, 20 мг/мл, по меньшей мере, 30 мг/мл, по меньшей мере, 40 мг/мл, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 75 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл, по меньшей мере, 125 мг/мл, по меньшей мере, 150 мг/мл.

Другой аспект включает составы с модифицированным иммуноглобулином, который может быть сделан из иммуноглобулина любого из предыдущих аспектов и любой из всех комбинаций предыдущих воплощений в концентрации, по меньшей мере, 10 мг/мл, по меньшей мере, 20 мг/мл, по меньшей мере, 30 мг/мл, по меньшей мере, 40 мг/мл, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 75 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл, по меньшей мере, 125 мг/мл или, по меньшей мере, 150 мг/мл. В некоторых воплощениях, иммуноглобулин находится в концентрации большей, чем концентрация, при которой немутированный иммуноглобулин агрегирует сам с собой в концентрированном жидком растворе в тех же условиях. В некоторых воплощениях, которые могут быть объединены с предыдущими воплощениями, по меньшей мере, восемьдесят процентов, по меньшей мере, восемьдесят пять процентов, по меньшей мере, девяносто процентов, по меньшей мере, девяносто пять процентов, по меньшей мере, девяносто шесть процентов, по меньшей мере, девяносто семь процентов, по меньшей мере, девяносто восемь процентов или, по меньшей мере, девяносто девять процентов модифицированного иммуноглобулина является неагрегированным мономером. В некоторых воплощениях, которые