Система векторов экспрессии, включающая два селективных маркера

Система векторов экспрессии, включающая два селективных маркера

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новой системе отбора, применимой для отбора клеток-хозяев, в частности клеток-хозяев млекопитающих, экспрессирующих целевой продукт. Указанная система отбора основана на применении по меньшей мере двух селективных маркеров (sm I и sm II), причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) частично влияет действие другого селективного маркера. Настоящее изобретение предусматривает соответствующие векторы экспрессии, клетки-хозяева и способы отбора клеток-хозяев, экспрессирующих целевой продукт с высоким выходом. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу эффективного получения полипептидов с высоким выходом.

Предпосылки создания изобретения

Способность клонировать и экспрессировать в больших количествах целевые продукты, например рекомбинантные пептиды и белки, приобретает все большее значение. Способность получать белки с высокой степенью очистки является важной задачей в области фармацевтики и биотехнологии, например, для получения белковых фармацевтических средств, а также в фундаментальных исследованиях, например, для кристаллизации белков с целью определения их трехмерной структуры. Белки, которые иным образом трудно получить в достаточном количестве, могут быть подвергнуты повышенной экспрессии в клетках-хозяевах и затем выделены и очищены.

Выбор системы экспрессии для выработки рекомбинантных белков зависит от многих факторов, включая особенности роста клеток, уровни экспрессии, внутриклеточную и внеклеточную экспрессию, посттрансляционные модификации и биологическое действие целевого белка, а также результаты регуляции и экономические обоснования при выработке терапевтических белков. Принципиальными преимуществами клеток млекопитающих относительно других систем экспрессии, например бактерий или дрожжей, являются их способность осуществлять правильную укладку белка, сложное N-связанное гликозилирование и аутентичное O-связанное гликозилирование, а также широкий спектр других посттрансляционных модификаций. Учитывая указанные преимущества, эукариотические клетки, и особенно клетки млекопитающих, в настоящее время являются предпочтительными системами экспрессии для выработки сложных белков терапевтического назначения, например, моноклональных антител.

Наиболее общий подход к получению клеток-хозяев с высоким уровнем экспрессии (также называемых высокоактивными продуцентами) сводится к получению соответствующего вектора экспрессии для экспрессии целевого продукта в качестве первой стадии. Вектор экспрессии индуцирует экспрессию полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, в клетках-хозяевах и предусматривает по меньшей мере один селективный маркер для получения линии рекомбинантных клеток. К ключевым элементам векторов экспрессии млекопитающих обычно относится конститутивный или индуцибельный промотор, способный к надежной транскрипции; оптимизированный процессинг иРНК и сигналы трансляции, которые обычно включают последовательность Kozak, кодон терминации трансляции, сигналы расщепления иРНК и полиаденилирования, терминатор транскрипции и селективные маркеры для получения линий стабильных клеток и для амплификации гена; кроме того, начало репликации прокариот и селективные маркеры для размножения вектора в бактериях могут быть обеспечены вектором экспрессии.

В предшествующие годы внимание было сосредоточено на конструировании усовершенствованных векторов для экспрессии генов в организме хозяина, в частности в клетках млекопитающих. Несмотря на избыток доступных векторов, по-прежнему требуется надежная выработка полипептида/белка на высоком уровне в клетках млекопитающих.

Одним из общепринятых методов получения линий высокопродуктивных клеток, экспрессирующих целевой продукт на высоком уровне, является стабильная трансфекция клеток-хозяев. Однако стабильная интеграция в геном является редким событием, и только небольшая часть стабильно трансфецированных клеток представлена высокоэффективными продуцентами.

Селективные маркеры и системы селекции широко применяются в генной инженерии, методах рекомбинантной ДНК и в выработке рекомбинантных продуктов для получения клеток-хозяев, экспрессирующих на высоком уровне целевой продукт. Соответствующие системы также применяют для получения и идентификации стабильно трансфецированных клонов. Основной целью применения соответствующих селективных маркеров и селективных систем является внедрение селективного гена, который при воздействии селективных условий роста позволяет идентифицировать клетки, способные вырабатывать на высоком уровне целевые продукты рекомбинации. Повышение уровня экспрессии продукта может быть достигнуто, например, амплификацией гена, используя линии клеток, например, недостаточных по ферменту, например, по дигидрофолатредуктазе (ДГФР) или глутаминсинтетазе (ГС), соединенного с векторами экспрессии, содержащими гены, кодирующие такие ферменты - селективные маркеры, и агенты, например метотрексат (МТК), который ингибирует ДГФР, и метионин сульфоксамин (МСА), который ингибирует ГС. Более чувствительные мутантные формы соответствующих селективных маркеров также могут применяться в сочетании с клетками дикого типа. Используемые векторы экспрессии, содержащие рекомбинантный ген под контролем сильного промотора, и гены, кодирующие селективные маркеры, например ДГФР или ГС, ДГФР (плюс) или ГС (плюс) трансфектанты, соответственно, сначала получают, а затем гены амплифицируют путем выращивания трансфектантов при постепенном повышении концентраций МТК или МСА. Цель обеспечения такого селективного давления заключается в выделении клеток, которые экспрессируют селективные маркеры и соответственно на высоком уровне экспрессируют целевой продукт.

Таким образом, высокая эффективность системы отбора имеет принципиальное значение для накопления высокопродуктивных клеток в популяции трансфецированных клеток. Чем выше эффективность системы отбора, тем ниже количество низкопродуктивных вариантов после процесса отбора и выше вероятность обнаружения очень редких клонов с чрезвычайно высоким уровнем продуктивности.

Задача настоящего изобретения заключается в получении эффективной системы отбора для отбора клеток-хозяев, вырабатывающих на высоком уровне целевой продукт, а также соответствующих векторов экспрессии и клеток-хозяев.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к системе отбора для отбора клеток-хозяев, экспрессирующих целевой продукт на высоком уровне, и к получению соответствующих продуктов, в частности полипептидов.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вектору экспрессии или к комбинации по меньшей мере двух векторов экспрессии, включающих по меньшей мере:

(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт или сайт инсерции для инкорпорирования полинуклеотида, кодирующего целевой продукт,

(б) полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(в) полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I), причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, особенно к клетке-хозяину млекопитающего, по меньшей мере включающей:

(а) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

(б) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(в) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I),

причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата.

Кроме того, предусмотрен способ отбора по меньшей мере одной клетки-хозяина, способной экспрессировать целевой продукт, включающий:

(а) получение множества клеток-хозяев, включающий по меньшей мере

(i) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт,

(ii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(iii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I),

причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата,

(б) культивирование указанного множества клеток-хозяев в условиях, избирательных для селективных маркеров (sm I) и (sm II), тем самым получая клетку-хозяина, экспрессирующую целевой продукт.

Также предусмотрена селективная культуральная среда, которая может применяться в способе отбора по настоящему изобретению и которая включает фолат в предельно допустимой концентрации и антифолат.Понятие «селективная культуральная среда» означает культуральную среду, применимую для отбора клеток-хозяев.

Настоящее изобретение также относится к способу получения целевого продукта, включающему культивирование клеток-хозяев по настоящему изобретению или клеток-хозяев, отобранных по рекомендациям настоящего изобретения в условиях, допускающих экспрессию целевого продукта.

Настоящее изобретение также относится к применению первого селективного маркера (sm I) в комбинации со вторым селективным маркером (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I). На действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера при отборе эукариотической клетки-хозяина, в частности клетки-хозяина млекопитающего, экспрессирующей целевой продукт. Селективные маркеры (sm I) и (sm II) предпочтительно участвуют в одном и том же или согласованном метаболическом процессе или пути, важном для выживаемости или размножения клеток. Предпочтительно селективные маркеры (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата.

Стратегия настоящего изобретения заключается в применении двух селективных маркеров (sm I) и (sm II), причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера, и оба селективных маркера (sm I) и (sm II) участвуют в одном и том же метаболическом пути, важном для выживаемости и деления клеток, что приводит к очень эффективным условиям отбора. В настоящем изобретении это может быть объяснено, исходя из предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения, в котором оба селективных маркера (sm I) и (sm II) участвуют в метаболизме фолата. Метаболизм фолата представляет важный метаболический путь, принципиально важный для выживаемости и роста клеток. Поскольку действие селективного маркера (sm I) или (sm II) влияет на действие другого селективного маркера, и оба селективных маркера участвуют в метаболизме фолата, метаболизм фолата проявляется в селективных культуральных условиях эффективно только в том случае, если оба селективных маркера (sm I) и (sm II) экспрессируются в достаточном количестве и соответственно экспрессируются на высоком уровне в реципиентных клетках-хозяевах. Таким образом, селективное давление на клетки-хозяева в существенной степени повышается.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, который также объясняет, каким образом на действие селективного маркера (sm II) по меньшей мере частично влияет действие селективного маркера (sm I), селективный маркер (sm I) является полипептидом-переносчиком или включает полипептид-переносчик, который инкорпорирует фолат в клетку-хозяина. Селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, процессирующим в качестве субстрата фолат, инкорпорированный селективным маркером (sm I), или последующий продукт, полученный или выработанный из указанного импортированного фолата. Предпочтительным примером соответствующего каталитического полипептида является ДГФР. Полагают, что в таком варианте осуществления настоящего изобретения второй селективный маркер (sm II) действует с повышенной эффективностью или с повышенной скоростью оборота, если переносчик фолата (sm I) инкорпорирует достаточные количества фолата в клетки-хозяева. Не опираясь на теорию, полагают, что эффективная экспрессия переносчика фолата в качестве селективного маркера (sm I) на высоком уровне позволяет клеткам-хозяевам импортировать больше фолата из культуральной среды в клетку и, соответственно, позволяет клеткам-хозяевам переносить пониженные концентрации фолата в культуральной среде. Экспрессия на высоком уровне переносчика фолата (sm I) приводит к тому, что достаточное количество субстрата для каталитического полипептида (sm II) (или предшественника указанного субстрата) импортируется в клетку-хозяина и таким образом становится доступным для каталитического полипептида (sm II). Таким образом, на действие каталитического полипептида (sm II) влияет действие переносчика фолата (sm I), поскольку действие каталитического полипептида (sm II) зависит от того, что достаточные количества фолата импортируются в клетку-хозяина переносчиком фолата (sm I). Поэтому жизнеспособность поддерживается/повышается в том случае, когда клетка-хозяин на высоком уровне экспрессирует первый селективный маркер (sm I) и таким образом импортирует достаточные количества фолата в клетку для поддержания метаболизма фолата, даже если концентрация фолата в культуральной среде очень низкая. Из-за действия переносчика фолата (sm I) доступность субстрата для каталитического полипептида (sm II) повышается. Селективная культуральная среда может включать ингибитор каталитического полипептида (sm II), например конкурента его фактического субстрата. Клетки, интенсивно экспрессирующие каталитический полипептид (sm II), устойчивы к повышенным концентрациям указанного ингибитора, особенно при высоких концентрациях субстрата, причем указанная концентрация по меньшей частично зависит от действия переносчика фолата, используемого в качестве селективного маркера (sm I). Такое соединение активности/функциональности селективных маркеров (sm I) и (sm II) проявляется в том, что жизнеспособность клеток-хозяев и/или скорость роста значительно повышена в условиях селективной среды, если оба селективных маркера (sm I) и (sm II) интенсивно экспрессируются. Выживание/пролиферация клеток-хозяев, происходящая независимо от условий селективной среды, может сохранить на достаточном уровне метаболизм фолата, что позволяет допустить выживание и рост клеток.

Уникальная структура системы экспрессии по настоящему изобретению обеспечивает в высокой степени интенсивную систему отбора, позволяющую накапливать высокопродуктивные клетки из популяции трансфецированных клеток-хозяев. Такая высокая точность системы отбора по настоящему изобретению снижает число низкопродуктивных продуцентов в популяции после отбора и повышает вероятность обнаружения очень редких клонов с чрезвычайно высоким уровнем продуктивности. Это повышает продуктивность отбора популяции клеток по выживаемости. В примерах показано, что клетки-хозяева, полученные с помощью системы отбора по настоящему изобретению, вырабатывают целевой продукт с высокой продуктивностью. Также повышена средняя продуктивность отдельных клонов-продуцентов. Таким образом, система отбора по настоящему изобретению повышает вероятность обнаружения клонов с высокой продуктивностью при меньших усилиях, затраченных на скрининг.

Приведенные выше предположения отражают современное понимание лежащих в основе механизмов, но на низ не замыкаются, поскольку могут быть другие объяснения наблюдаемой зависимости/повышения в селективном давлении при использовании селективных маркеров (sm I) и (sm II), которые оба вовлечены в метаболизм фолата. Кроме того, согласно изложенному в подробном описании, основное положение настоящего изобретения также применимо к другим метаболическим процессам или метаболическим путям и другим селективным маркерам помимо (sm I) и (sm II). Однако важно отметить, что на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера для повышения селективного давления. Таким образом, другие положения, свойства, преимущества и объекты настоящего изобретения станут ясны специалистам в данной области из последующего описания и прилагаемой формулы изобретения. Следует учитывать, однако, что приводимые ниже описание, формула изобретения и конкретные примеры, отражающие предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, приводятся только в качестве иллюстрации. Различные изменения и модификации в рамках охвата описанного изобретения станут очевидны специалистам в данной области после ознакомления с последующим описанием.

Подробное описание изобретения

Согласно одному из объектов настоящего изобретения предусмотрены вектор экспрессии или комбинация по меньшей мере двух векторов экспрессии, включающие по меньшей мере:

(а) полинуклеотид, кодирующий целевой продукт или сайт инсерции для инкорпорирования полинуклеотида, кодирующего целевой продукт,

(б) полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер (sm I),

(в) полинуклеотид, кодирующий второй селективный маркер (sm II), который отличается от первого селективного маркера (sm I),

причем на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера.

Понятие «селективный маркер (selectable marker - sm)» означает маркер, который экспрессируется интродуцированным полинуклеотидом и позволяет в определенных условиях селективной культуры отбирать клетки-хозяева, экспрессирующие указанный селективный маркер. Селективным маркером предпочтительно является биомолекула, в частности полипептид. Соответствующие селективные маркеры подробно описаны ниже.

Понятие «вектор» по настоящему изобретению означает полинуклеотид, способный нести по меньшей мере один полинуклеотидный фрагмент. Вектор функционирует в качестве носителя молекул, высвобождающего фрагменты нуклеиновых кислот, соответственно полинуклеотиды, в клетку-хозяина. Он может представлять по меньшей мере одну кассету экспрессии, включающую регуляторные последовательности для правильной экспрессии полинуклеотида, инкорпорированного в этот вектор. Полинуклеотиды (например, кодирующие целевой продукт или селективные маркеры), интродуцируемые в клетку, могут быть инсертированы в кассету (кассеты) экспрессии вектора для экспрессии с него. Вектор по настоящему изобретению может быть в кольцевой или линейной (линеаризированной) форме, и к этому понятию также относятся фрагменты вектора. Понятие «вектор» также включает искусственные хромосомы или близкие соответствующие полинуклеотиды, позволяя трансфецировать фрагменты чужеродной нуклеиновой кислоты.

Понятие «полинуклеотид» относится к полимеру из нуклеотидов, которые обычно связаны через одну дезоксирибозу или рибозу с другой, и относится к ДНК и РНК в зависимости от контекста. Понятие «полинуклеотид» не подразумевает каких-либо ограничений по размеру и также охватывает полинуклеотиды, включающие модификации, в частности модифицированные нуклеотиды.

Понятие «интродуцированный полинуклеотид» относится к полинуклеотиду, который был интродуцирован в клетку-хозяина, например, за счет применения методов рекомбинации, например трансфекции. Клетка-хозяин может включать или не включать эндогенный полинуклеотид, соответствующий или идентичный интродуцированному полинуклеотиду. Интродукции можно достичь, например, путем трансфекции соответствующего вектора, который может интегрировать в геном клетки-хозяина (стабильная трансфекция). Соответствующие векторы, допускающие интродукцию полинуклеотида в клетку-хозяина, подробно описаны ниже. В том случае, если интродуцированный полинуклеотид не инсертирован в геном, интродуцированный полинуклеотид может быть потерян на более поздней стадии, например, если клетка претерпевает митоз (кратковременная трансфекция). Соответствующие векторы также могут поддерживаться в клетке-хозяине без интеграции в геном, например, путем эписомальной репликации. Однако в предшествующем уровне техники также известны другие методы интродукции полинуклеотида в клетку-хозяина, подробно описанные ниже.

Понятие «целевой продукт» относится к продукту, который экспрессируется в указанной клетке-хозяине. Целевой продукт может быть, например, полипептидом или полинуклеотидом, например РНК. Предпочтительно целевой продукт является полипептидом, в частности молекулой иммуноглобулина. Примеры описаны ниже.

Понятие «полипептид» относится к молекуле, представляющей полимер из аминокислот, связанных вместе пептидными связями (связью). К полипептидам относятся полипептиды какой-либо длины, включая белки (например, имеющие более 50 аминокислот) и пептиды (например, включающие 2-49 аминокислот). К полипептидам относятся белки и/или пептиды какого-либо действия или биологической активности. Соответствующие примеры приведены ниже.

Признак, заключающийся в том, что «на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) по меньшей мере частично влияет действие другого селективного маркера», в частности означает, что на действие одного селективного маркера влияет и/или от него зависит по меньшей мере в определенной степени прямо или опосредованно действие другого селективного маркера (и необязательно vice versa). В данном контексте понятие «действие» в частности описывает какую-либо функцию или действие селективного маркера, которое обеспечивает, индуцирует и/или повышает устойчивость к селективному давлению и включает, но ими не ограничивается, каталитическое действие, степень оборота, скорость кинетической реакции и/или скорость переноса селективного маркера. Такая зависимость/взаимодействие селективных маркеров (sm I) и (sm II) может существенно повысить селективное давление на клетки-хозяева в селективных культуральных условиях. Предпочтительно селективный маркер (sm I) и селективный маркер (sm II) участвуют в одном и том же или в близком метаболическом процессе или метаболическом пути, важном для жизнеспособности или деления клеток. Соответствующие примеры селективных маркеров (sm I) и (sm II) и метаболических процессов и метаболических путей подробно описаны ниже.

Впоследствии в настоящем изобретении описывают варианты его осуществления и преимущества вектора экспрессии или комбинаций векторов экспрессии по настоящему изобретению. В соответствующих местах настоящего изобретения описаны указанные преимущества вместе с применением указанного вектора (векторов) при отборе клеток-хозяев, экспрессирующих целевой продукт.

На основании рекомендаций, приведенных в настоящем изобретении, на действие селективного маркера (sm I) или (sm II) влияет и, соответственно, по меньшей мере частично зависит действие другого селективного маркера в культуральных условиях, избирательных для обоих селективных маркеров. Из-за такого взаимодействия селективных маркеров (sm I) и (sm II) повышается селективное давление на клетки-хозяева. Благодаря уникальному строению предусмотрена в высокой степени эффективная система отбора, позволяющая обогащать содержание высокопродуктивных клеток из популяции трансфецированных клеток-хозяев. Такая в высокой степени эффективная система отбора по настоящему изобретению снижает число низкопродуктивных клеток в популяции после отбора и повышает вероятность обнаружения очень редких чрезвычайно продуктивных клонов.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения оба селективных маркера (sm I) и (sm II) вовлечены в один и тот же метаболический процесс, который предпочтительно важен для жизнеспособности и/или пролиферации клеток, например синтез нуклеиновых кислот или полипептидов. Таким образом, если вектор экспрессии или комбинацию по меньшей мере двух векторов экспрессии интродуцируют в реципиентную клетку-хозяина, действие/наличие указанных селективных маркеров (sm I) и (sm II) в сочетании с селективными условиями культуральной среды воздействуют/атакуют один и тот же метаболический процесс в реципиентных клетках-хозяевах. Таким образом, действие селективных маркеров (sm I) и (sm II) влияет друг на друга в указанном метаболическом процессе, тем самым повышая селективное давление на клетку-хозяина. Клетки-хозяева выживают/пролиферируют в селективных культуральных условиях и, несмотря на селективные культуральные условия, могут поддерживать указанный метаболический процесс в достаточной мере для того, чтобы допустить выживание и рост клеток. Выживание/рост индуцируются, если указанные клетки-хозяева экспрессируют оба селективных маркера (sm I) и (sm II) и соответственно интродуцированные вектор (векторы) экспрессии с высоким уровнем продуктивности. Таким образом, отбирают клетки-хозяева, которые экспрессируют на высоком уровне целевой продукт.

Понятие «метаболический путь» особенно относится к процессу в клетках-хозяевах, который важен для выживания клеток и/или для пролиферации клеток. К примерам метаболических путей относится синтез нуклеиновой кислоты или полипептида. Понятие «метаболический путь» в частности относится к подгруппе метаболических процессов и описывает определенные серии химических реакций, имеющихся в клетке. В каждом метаболическом пути основное химическое вещество модифицируется химическими реакциями. Классическим примером метаболического пути является синтез нуклеотидов (принадлежащий к метаболическому процессу синтеза нуклеиновых кислот), в частности биосинтез пурина или пиримидина, или синтез аминокислот (принадлежащих к метаболическому процессу синтеза полипептидов). Известно несколько уровней метаболических путей, которые также часто являются взаимозависимыми и таким образом связанными. Таким образом, указанные термины следует понимать скорее функционально, поскольку отдельные метаболические пути и метаболические процессы часто перекрещиваются.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) участвуют в метаболическом процессе или в метаболическом пути, который выбран из

а) синтеза нуклеиновых кислот и/или синтеза полипептидов,

б) синтеза нуклеотидов и/или синтеза аминокислот, и

в) метаболизма фолата.

Указанные метаболические процессы/пути важны для поддержания клеточной жизнеспособности клеток-хозяев и/или для пролиферации клеток-хозяев. Таким образом, они являются точками приложения усилий для селективной системы по настоящему изобретению. Таким образом, такие метаболические пути весьма применимы для выбора соответствующих селективных маркеров, участвующих в этом отношении в качестве селективного маркера (sm I) и селективного маркера (sm II), и соответствующих селективных условий, позволяя отбирать клетки-хозяева, экспрессирующие указанные маркеры. Применимые селективные маркеры, участвующие в соответствующих метаболических путях, а также соответствующие клетки-хозяева и соответствующие селективные условия, известны в предшествующем уровне техники и описаны ниже и таким образом могут применяться вместе с настоящим изобретением.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) является селективным эукариотическим маркером. Понятие «эукариотический селективный маркер» относится к маркеру, который позволяет отбирать эукариотические клетки-хозяева, отличающиеся соответственно экспрессией указанного селективного маркера. Указанный эукариотический селективный маркер может быть метаболическим селективным маркером и таким образом маркером, который участвует в метаболическом процессе или пути в клетке, например в синтезе нуклеиновой кислоты или полипептида.

Кроме того, первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) может быть амплифицируемым селективным маркером. Амплифицируемый селективный маркер позволяет отбирать клетки-хозяева, содержащие вектор, и индуцирует амплификацию гена. Примеры соответствующих амплифицируемых селективных маркеров известны из предшествующего уровня техники, например ДГФР и ГС.

Первый селективный маркер (sm I) и/или второй селективный маркер (sm II) может быть каталитическим полипептидом или транспортерным полипептидом. Есть много соответствующих применимых селективных маркеров, которые могут применяться вместе с настоящим изобретением и будут подробно объяснены ниже.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй селективный маркер (sm II) является каталитическим полипептидом, процессирующим:

(а) субстрат, который представляет соединение, инкорпорированное первым селективным маркером (sm I) в клетку-хозяина, или последующий продукт, полученный из указанного инкорпорированного соединения, и/или

(б) субстрат или его предшественник, которые получаются под действием первого селективного маркера (sm I).

Поэтому указанный каталитический полипептид, используемый в качестве селективного маркера (sm II), может процессировать субстрат, импортируемый в клетку-хозяина, за счет действия первого селективного маркера (sm I). Он также может процессировать субстрат, который вырабатывается под действием первого селективного маркера (sm I). Указанное соединение, которое, например, инкорпорировано в клетку-хозяина первым селективным маркером (sm I), также может быть предшественником конкретного субстрата, который процессируется вторым селективным маркером (sm II). Таким образом, каталитический полипептид (sm II) также может процессировать субстрат, который представляет последующий продукт, полученный из соединения, которое инкорпорировано в клетку-хозяина под действием первого селективного маркера (sm I). Тот же подход применяют в случае селективного маркера (sm I), который является каталитическим полипептидом вместо полипептида-переносчика.

Не опираясь на теорию, полагают, что в настоящем изобретении действие второго селективного маркера (sm II) четко зависит от действия первого селективного маркера (sm I) в культуральных условиях, селективных для обоих маркеров. Наличие и/или количество субстрата для второго селективного маркера (sm II) зависит по меньшей мере в некоторой степени от надлежащей экспрессии/действия селективного маркера (sm I). Интенсивная сверхэкспрессия первого селективного маркера (sm I) приводит к повышенной доступности субстрата для второго селективного маркера (sm II). Повышенная доступность субстрата повышает действие второго селективного маркера (например, интенсивность оборота). Однако если селективный маркер (sm I) не экспрессируется на достаточном уровне, не вырабатывается или вырабатывается в меньшем количестве субстрат для селективного маркера (sm II), действие которого также снижается.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первым селективным маркером (sm I) является полипептид-переносчик, ответственный за интродукцию/инкорпорирование соединения из культуральной среды в клетку-хозяина, которое является субстратом или предшественником субстрата второго селективного маркера (sm II). Предпочтительно указанное соединение важно для выживаемости и/или пролиферации клеток. Полагают, что в таком варианте осуществления настоящего изобретения второй селективный маркер (sm II) действует с повышенной интенсивностью оборота, если первый селективный маркер (sm I) инкорпорирует достаточные количества указанного соединения в клетки-хозяева. Не опираясь на теорию, полагают, что интенсивная сверхэкспрессия первого селективного маркера (sm I) позволяет клеткам-хозяевам импортировать большее количество указанного соединения из культуральной среды в клетку и соответственно позволяет клеткам-хозяевам переносить пониженные концентрации указанного соединения в культуральной среде. Это также приводит к повышенной доступности указанного соединения и соответственно субстрата (или предшественника указанного субстрата) второго селективного маркера (sm II) в клетке-хозяине. Те же принципы применимы в случае, когда первый селективный маркер (sm I) является каталитическим полипептидом, вырабатывающим субстрат или предшественник субстрата, который прицессируется/используется вторым селективным маркером (sm II). Такое допущение отражает современное понимание лежащих в основе механизмов, однако не является непременным, поскольку могут быть другие объяснения наблюдаемой зависимости/повышению селективного давления.

Действие селективных маркеров (sm I) или (sm II) влияет на действие других селективных маркеров, и оба нацеливаются на один и тот же или на связанный процесс или метаболический путь, например синтез нуклеотида или метаболизм фолата, которые соответственно функционируют более эффективно в селективных культуральных условиях, если оба селективных маркера экспрессируются в достаточных количествах и, соответственно, экспрессируются на повышенном уровне в клетке-хозяине. Это приводит к селективным условиям особой точности.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) действует ранее по цепи относительно второго селективного маркера (sm II). Это означает, например, что в том же или в согласованном метаболическом пути первый селективный маркер (sm I) может, например, действовать в начале указанного метаболического пути, а второй селективный маркер (sm II) действует далее по цепи от селективного маркера (sm I).

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения первый селективный маркер (sm I) является полипептидом-переносчиком или включает полипептид-переносчик. Понятие «полипептида-переносчика» относится к определенному полипептиду, опосредующему перенос соединения из одного компартмента в другой, в частности из культуральной среды в клетку-хозяина. К примерам соответствующих полипептидов-переносчиков относятся рецепторные полипептиды, каналы и носители.

В качестве полипептида-переносчика указанный селективный маркер (sm I) предпочтительно импортирует соединение в клетку-хозяина, которая участвует в жизнеспособности или пролиферации клетки-хозяина и/или важна для них. Таким образом, клеточная жизнеспособность или пролиферация зависит по меньшей мере частично от импорта указанного соединения в клетку-хозяина. Второй селективный маркер (sm II), используемый в комбинации с полипептидом-переносчиком (sm I), предпочтительно является ферментом, который участвует в метаболическом пути или процессе, на который влияет/от которого зависит действие по переносу первого селективного маркера (sm I), поскольку он позволяет, например, применять импортированное соединение или его последующий продукт. В таком варианте осуществления настоящего изобретения действие и в особенности скорость оборота указанного второго селективного маркера (sm II) по меньшей мере частично зависит от действия полипептида-переносчика (sm I), который импортирует указанное соединение в клетку-хозяина. В соединении с данным вариантом осуществления настоящего изобретения может применяться селективная культуральная среда, которая включает ограничивающую концентрацию указанного соединения, которое импортируется полипептидом-переносчиком (sm I) в клетку-хозяина.

Понятие «ограничивающей концентрации» относится к концентрации указанного соединения в селективной культуральной среде, которая обеспечивает селективное давление на клетку-хозяина. Поэтому указанное соединение не включается в селективную культуральную среду в достатке, тем самым обеспечивая селективное давление на клетку-хозяина. Таким образом, селективная культуральная среда может быть, например, истощенной, соответственно, может содержать небольшие количества указанного соединения, которое включено/перенесено в клетку полипептидом-переносчиком (sm I).

Таким