Применение антитела против tau ps422 для лечения заболеваний головного мозга

Применение антитела против tau ps422 для лечения заболеваний головного мозга

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению антитела, которое специфично связывается с фосфорилированным фрагментом Tau SEQ ID NO:9 (pS422), для лечения заболеваний головного мозга.

Предшествующий уровень техники

Белок Tau человека (белок, ассоциированный с микротрубочками, Tau (белок нейрофибриллярных клубков, белок парных спиральных филаментов Tau, PHF-Tau) представляет собой нейрональный белок, ассоциированный с микротрубочками, обнаруженный преимущественно в аксонах, функцией которого является стимуляция полимеризации тубулина и стабилизация микротрубочек. Шесть изоформ (изоформа А, В, С, D, Е, F, G, фетальный Tau) обнаружено в головном мозге человека, где самая длинная изоформа содержит 441 аминокислоту (изоформа F, Uniprot P10636-8). Tau и его свойства также описаны Reynolds, C.H. et al., J. Neurochem. 69 (1997) 191-198.

Tau в его гиперфосфорилированной форме является основным компонентом парных спиральных филаментов (PHF), строительного блока нейрофибриллярных повреждений в головном мозге при болезни Альцгеймера (БА). Tau может фосфорилироваться по его остаткам серина или треонина несколькими различными киназами, включающими GSKSbeta, cdk5, MARK и членов семейства MAP киназ.

Таупатии характеризуются аномальным гиперфосфорилированием Tau и представляют собой в соответствии с Iqbal, К. et al. (Biochimica et Biophysica Acta (ВВА) 1739 (2005) 198-210):

- Болезнь Альцгеймера, включая только клубковую форму этого заболевания

- Синдром Дауна, случаи у взрослых

- Комплекс паркинсонизм-деменция (синдром Гуама)

- Деменция боксеров

- Болезнь Пика

- Деменция с аргирофильными зернами

- Лобно-височная деменция

- Кортико-базальная дегенерация

- Паллидо-понто-нигральная дегенерация

- Прогрессирующий надъядерный паралич

- Болезнь Герштмана-Штрауслера-Шейнкера с клубками.

В данное время в Tau из головных мозгов болезни Альцгеймера обнаружено почти 40 сериновых (S)/треониновых (Т) сайтов фосфорилирования (Hanger, D.P. et al., J. Biol. Chem 282 (2007) 23645-23654). Развитие патологии Tau при болезни Альцгеймера обусловлено его состоянием фосфорилирования. Однако большинство из 40 сайтов фосфорилирования не связано с патологией заболевания, поскольку они также обнаружены в Tau, экстрагированном из ткани здорового фетального головного мозга. Только несколько фосфорилирований являются уникальными для болезненного состояния, и предположительно они ответственны за аномальную характеристическую нерастворимость и агрегацию, которая определяет Tau в PHF головного мозга с болезнью Альцгеймера (Morishima-Kawashima, M. et al., J. Biol. Chem 270 (1995) 823-829). Согласно Pel, J.J. et al., Journal of Alzheimer's Disease 14 (2008) 385-392, в существующей литературе представлена ограниченная и неясная информация о том, какие из этих сайтов специфичны для головного мозга при БА. Pei использовал ряд фосфоспецифичных антител к Tau и измерил их уровни в гомогенатах медиальной височной коры от 22 БА и 10 контролей.

Авторы Bussiere, Т. et al. (Acta Neuropathol. 97 (1999) 221-230) описывают, что фосфорилированный серин 422 на белках Tau является патологическим эпитопом, обнаруженным при некоторых заболеваниях с нейрофибриллярной дегенерацией. Augustinack, J.C. et al., (Acta Neuropathol 103 (2002) 26-35) описывают р3422 как коррелирующий с тяжестью нейрональной патологии при болезни Альцгеймера. Guillozet-Bongaarts, A. (J. Neurochem 97 (2006) 1005-1014) описывают фосфорилирование Tau при S422 как составляющее часть процесса созревания PHF. Tau р8422 также обнаружен в сочетании с развивающейся патологией в различных моделях болезни Альцгеймера на трансгенных мышах. Так, Deters, N. et al. упоминают в статье Biochem. Biophys. Res. Commun. 379 (2009) 400-405, что двойные трансгенные мыши Dom5/pR5 проявляют 7-кратно повышенные числа нейронов гиппокампа, которые содержат Tau со специфично фосфорилированным патологическим эпитопом S422. Goetz, J. et al. (Science 293 (2001) 1491-1495) сообщили о появлении Tau, фосфорилированного по S422, в головном мозге трансгенных мышей Tau P301L, инъецированных фибриллами Abeta42.

ЕР 2009104 относится к эпитопам белка Tau, которые встречаются в фосфорилированном состоянии в белке Tau из PHF болезни Альцгеймера, и к применению этих эпитопов для создания антител, специфично обнаруживающих белок Tau болезни Альцгеймера. WO 2002/062851 и US 7446180 относятся к антителам со специфичностью к аномально укороченной форме белка Tau и к диагностическим и терапевтическим аспектам в отношении болезни Альцгеймера и родственных таупатий.

WO 98/22120 относится к способу лечения пациента с болезнью Альцгеймера, включающему стадию введения пациенту антитела против фосфорилированного фрагмента Tau из аминокислот от примерно 207 до примерно 222, аминокислот от примерно 224 до примерно 240 и аминокислот от примерно 390 до примерно 408. Исследования на животных, где фосфорилированный Tau-фрагмент 379-408 [P-Ser396,404] используют для вакцинации трансгенных мышей Tau, упомянуты в статье Asuni, A.A. et al., J. Neuroscience 27 (2007) 9115-9129. US 2008/0050383 относится к способам лечения и предупреждения болезни Альцгеймера или других таупатий у субъекта путем введения фрагмента белка Tau.

Моноклональные антитела против Tau р3422 описаны, например, в ЕР 1876185. Поликпональные антитела против Tau pS422 имеются в продаже (например, ProSci Inc. и Biosource International).

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение включает антитело, связывающееся с Tau, фосфорилированным по серину 422 (Tau pS422), характеризующееся специфичным связыванием с фосфорилированным фрагментом Tau Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO₃H₂)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp (SEQ ID NO:9) и с Tau pS422, но не связывающееся с Tau и с фосфорилированным фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, для применения при лечении таупатий, и такой способ лечения.

Изобретение включает антитело, связывающееся с Tau, фосфорилированным по серину 422 (Tau pS422), характеризующееся специфичным связыванием с фосфорилированным фрагментом Tau SEQ ID NO:9 и с Tau pS422, но не связывающееся с Tau и с фосфорилированным фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, для получения лекарства для лечения таупатий и к такому способу получения.

Изобретение включает антитело, связывающее фосфорилированный Tau, характеризующееся специфичным связыванием с тем же эпитопом, который связывает Mab2.10.3 (антитело анти-Tau pS422).

Изобретение включает применение антитела, связывающего фосфорилированный Tau, характеризующееся специфичным связыванием с с тем же эпитопом, который связывает Mab2.10.3 (антитело анти-Tau pS422), для применения при лечении таупатии или для получения лекарства для лечения таупатии.

Антитело в соответствии с изобретением специфично связывается с Tau р8422 и с агрегированным (фибриллярным), фосфорилированным Tau. Антитело в соответствии с изобретением не связывается с нефосфорилированным Tau, нефосфорилированным фрагментом Таи SEQ ID NO:10 и с фосфорилированным фрагментом MCAK SEQ ID NO:17.

Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно принадлежит к подтипу IgG1 человека. В следующей форме осуществления изобретения антитело в соответствии с изобретением предпочтительно принадлежит к подтипу IgG4 человека.

Изобретение включает антитело анти-Tau р8422, характеризующееся тем, что оно включает

a) CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7 и CDR3H SEQ ID NO:8,

b) CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 и CDR3H SEQ ID NO:25,

c) CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 и CDR3H SEQ ID NO:33,

d) CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 и CDR3H SEQ ID NO:41,

e) CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:48 и CDR3H SEQ ID NO:49,

f) CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:48 и CDR3H SEQ ID NO:49, или

g) CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 и CDR3H SEQ ID NO:65.

Предпочтительно антитело характеризуется тем, что оно включает

a) CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 и CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5,

b) CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 и CDR3H SEQ ID NO:25, и CDR1L SEQ ID NO:27, CDR2L SEQ ID NO:28, CDR3L SEQ ID NO:29,

c) CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 и CDR3H SEQ ID NO:33, и CDR1L SEQ ID NO:35, CDR2L SEQ ID NO:36, CDR3L SEQ ID NO:37,

d) CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 и CDR3H SEQ ID NO:41, и CDR1L SEQ ID NO:43, CDR2L SEQ ID NO:44, CDR3L SEQ ID NO:45,

e) CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:48, и CDR3H SEQ ID NO:49, и CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:52, CDR3L SEQ ID NO:53,

f) CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:48 и CDR3H SEQ ID NO:49, и CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:60, CDR3L SEQ ID NO:61, или

g) CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 и CDR3H SEQ ID NO:65, и CDR1L SEQ ID NO:67, CDR2L SEQ ID NO:68, CDR3L SEQ ID NO:69.

Предпочтительно антитело характеризуется тем, что оно включает a) вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:1 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:2,

b) вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:26 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:22,

c) вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:34 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:30,

d) вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:42 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:38,

e) вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:50 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:46,

f) вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:58 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:54, или

g) вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:66 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:62.

Изобретение включает гуманизированный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab2.10.3. Изобретение включает химерный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab2.10.3. Изобретение включает вариант, истощенный по Т-клеточному эпитопу, антитела анти-Tau pS422 Mab2.10.3. Mab2.10.3 характеризуется его вариабельными цепями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.

Изобретение включает гуманизированный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 005. Изобретение включает химерный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 005. Изобретение включает вариант, истощенный по Т-клеточному эпитопу, антитела анти-Tau pS422 Mab 005. Mab 005 характеризуется его вариабельными цепями SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:22.

Изобретение включает гуманизированный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 019. Изобретение включает химерный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab

019. Изобретение включает вариант, истощенный по Т-клеточному эпитопу, антитела анти-Tau pS422 Mab 019. Mab 019 характеризуется его вариабельными цепями SEQ ID NO:34 и SEQ ID NO:30.

Изобретение включает гуманизированный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 020. Изобретение включает химерный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab

020. Изобретение включает вариант, истощенный по Т-клеточному эпитопу, антитела анти-Tau pS422 Mab 020. Mab 020 характеризуется его вариабельными цепями SEQ ID NO:42 и SEQ ID NO:38.

Изобретение включает гуманизированный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 085. Изобретение включает химерный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 085. Изобретение включает вариант, истощенный по Т-клеточному эпитопу, антитела анти-Tau pS422 Mab 085. Mab 085 характеризуется его вариабельными цепями SEQ ID NO:50 и SEQ ID NO:46.

Изобретение включает гуманизированный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 086. Изобретение включает химерный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 086. Изобретение включает вариант, истощенный по Т-клеточному эпитопу, антитела анти-Tau pS422 Mab 086. Mab 086 характеризуется его вариабельными цепями SEQ ID NO:58 и SEQ ID NO:54.

Изобретение включает гуманизированный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 097. Изобретение включает химерный вариант антитела анти-Tau pS422 Mab 097. Изобретение включает вариант, истощенный по Т-клеточному эпитопу, антитела анти-Tau pS422 Mab 097. Mab 097 характеризуется его вариабельными цепями SEQ ID NO:66 и SEQ ID NO:62.

Изобретение включает химерный, гуманизированный или истощенный по Т-клеточному эпитопу вариант антитела анти-Tau pS422, включающий CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 и CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:1 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:2.

Изобретение включает химерный, гуманизированный или истощенный по Т-клеточному эпитопу вариант антитела анти-Tau pS422, включающий CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 и CDR3H SEQ ID NO:25, и CDR1L SEQ ID NO:27, CDR2L SEQ ID NO:28, CDR3L SEQ ID NO:29, или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:26 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:22.

Изобретение включает химерный, гуманизированный или истощенный по Т-клеточному эпитопу вариант антитела анти-Tau pS422, включающий CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 и CDR3H SEQ ID NO:33, и CDR1L SEQ ID NO:35, CDR2L SEQ ID NO:36, CDR3L SEQ ID NO:37 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:34 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:30.

Изобретение включает химерный, гуманизированный или истощенный по Т-клеточному эпитопу вариант антитела анти-Tau pS422, включающий CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 и CDR3H SEQ ID NO:41, и CDR1L SEQ ID NO:43, CDR2L SEQ ID NO:44, CDR3L SEQ ID NO:45 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:42 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:38.

Изобретение включает химерный, гуманизированный или истощенный по Т-клеточному эпитопу вариант антитела анти-Tau pS422, включающий CDR1H SEQ ID NO:47, CDR2H SEQ ID NO:48 и CDR3H SEQ ID NO:49, и CDR1L SEQ ID NO:51 CDR2L SEQ ID NO:52, CDR3L SEQ ID NO:53 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:50 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:46.

Изобретение включает химерный, гуманизированный или истощенный по Т-клеточному эпитопу вариант антитела анти-Tau р8422, включающий CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:48 и CDR3H SEQ ID NO:49, и CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:60, CDR3L SEQ ID NO:61 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:58 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:54.

Изобретение включает химерный, гуманизированный или истощенный по Т-клеточному эпитопу вариант антитела анти-Tau pS422, включающий CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 и CDR3H SEQ ID NO:65, и CDR1L SEQ ID NO:67, CDR2L SEQ ID NO:68, CDR3L SEQ ID NO:69 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:66 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:62.

Изобретение включает способ гуманизации, истощения по Т-клеточному эпитопу или химеризации антитела анти-Tau pS422, характеризующегося тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 и CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:1 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:2.

Изобретение включает способ гуманизации, истощения по Т-клеточному эпитопу или химеризации антитела анти-Tau pS422, характеризующегося тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 и CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:1 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:2.

Изобретение включает способ гуманизации, истощения по Т-клеточному эпитопу или химеризации антитела анти-Tau pS422, характеризующегося тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 и CDR3H SEQ ID NO:25, и CDR1L SEQ ID NO:27, CDR2L SEQ ID NO:28, CDR3L SEQ ID NO:29 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:26 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:22.

Изобретение включает способ гуманизации, истощения по Т-клеточному эпитопу или химеризации антитела анти-Tau pS422, характеризующегося тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 и CDR3H SEQ ID NO:33, и CDR1L SEQ ID NO:35, CDR2L SEQ ID NO:36, CDR3L SEQ ID NO:37 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:34 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:30.

Изобретение включает способ гуманизации, истощения по Т-клеточному эпитопу или химеризации антитела анти-Tau pS422, характеризующегося тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 и CDR3H SEQ ID NO:41, и CDR1L SEQ ID NO:43, CDR2L SEQ ID NO:44, CDR3L SEQ ID NO:45 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:42 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:38.

Изобретение включает способ гуманизации, истощения по Т-клеточному эпитопу или химеризации антитела анти-Tau pS422, характеризующегося тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:48 и CDR3H SEQ ID NO:49, и CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:52, CDR3L SEQ ID NO:53 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:50 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:46.

Изобретение включает способ гуманизации, истощения по Т-клеточному эпитопу или химеризации антитела анти-Tau pS422, характеризующегося тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:48 и CDR3H SEQ ID NO:49, и CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:60, CDR3L SEQ ID NO:61 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:58 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:54.

Изобретение включает способ гуманизации, истощения по Т-клеточному эпитопу или химеризации антитела анти-Tau pS422, характеризующегося тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 и CDR3H SEQ ID NO:65, и CDR1L SEQ ID NO:67, CDR2L SEQ ID NO:68, CDR3L SEQ ID NO:69 или вариабельную легкую цепь SEQ ID NO:66 и вариабельную тяжелую цепь SEQ ID NO:62.

Предпочтительно антитело, связывающееся с Tau pS422 и характеризующееся вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, принадлежит к подтипу IgG1 человека. Предпочтительно антитело, связывающееся с Tau pS422 и характеризующееся вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, принадлежит к подтипу IgG4 человека.

Следующей формой осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая антитело в соответствии с изобретением.

Следующей формой осуществления изобретения является применение антитела в соответствии с изобретением для получения фармацевтической композиции.

Следующей формой осуществления изобретения является применение антитела в соответствии с изобретением для лечения таупатии, выбранной из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (БА), включая только клубковую форму заболевания, синдрома Дауна (случаев у взрослых), комплекса паркинсонизм-деменция (синдрома Гуама), деменции боксеров, болезни Пика, деменции с аргирофильными зернами, лобно-височной деменции, кортико-базальной дегенерации, паллидо-понто-нигральной дегенерации, прогрессирующего надъядерного паралича и болезни Герштмана-Штрауслера-Шейнкера с клубками.

Следующей формой осуществления изобретения является способ получения фармацевтической композиции, содержащей антитело в соответствии с изобретением.

Следующей формой осуществления изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи антитела в соответствии с изобретением.

Далее в изобретении предложены экспрессионные векторы, содержащие нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, способные экспрессировать эту нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы для рекомбинантного продуцирования такого антитела.

Далее изобретение включает прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, содержащую вектор в соответствии с изобретением.

Далее изобретение включает способ продуцирования рекомбинантного человеческого или гуманизированного антитела в соответствии с изобретением, характеризующийся экспрессией нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделением антитела из клетки или из супернатанта клеточной культуры. Далее изобретение включает антитело, которое может быть получено таким рекомбинантным способом.

Далее изобретение включает способ селекции моноклонального антитела в соответствии с изобретением, характеризующийся получением ряда моноклональных антител, связывающихся с Tau pS422, определением специфичного связывания этих антител с фосфорилированным фрагментом Tau SEQ ID NO:9, с Tau и с фосфорилированным фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, и селекцией антитела со специфичным связыванием с данным фосфорилированным фрагментом Tau, по меньшей мере 10000-кратным по сравнению с его связыванием с Tau, и со специфичным связыванием с данным фосфорилированным фрагментом Tau, по меньшей мере 100-кратным по сравнению с его связыванием с фосфорилированным фрагментом MCAK Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO₃H₂)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:17).

Предпочтительно изобретение включает способ селекции моноклонального антитела в соответствии с изобретением, характеризующийся получением ряда моноклональных антител, связывающихся с Tau р8422, определением специфичного связывания этих антител с фосфорилированным фрагментом Tau SEQ ID NO:9, с Tau pS422, с Tau и с фосфорилированным фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, и селекцией антитела со специфичным связыванием с данным фосфорилированным фрагментом Tau и с Tau pS422, по меньшей мере 10000-кратным по сравнению с его связыванием с Tau, и со специфичным связыванием с данным фосфорилированным фрагментом Tau, по меньшей мере 100-кратным по сравнению с его связыванием с фосфорилированным фрагментом MCAK Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PC>3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:17).

Предпочтительно изобретение включает способ селекции моноклонального антитела в соответствии с изобретением, характеризующийся получением ряда моноклональных антител, связывающихся с Tau pS422, определением специфичного связывания этих антител с фосфорилированным фрагментом Tau SEQ ID NO:9, с Tau pS422, с Tau и с фосфорилированным фрагментом MCAK SEQ ID NO:17, и селекцией антитела со специфичным связыванием с данным фосфорилированным фрагментом Tau и с Tau pS422, по меньшей мере 10000-кратным по сравнению с его связыванием с Tau, и со специфичным связыванием с данным фосфорилированным фрагментом Tau и с Tau pS422, по меньшей мере 100-кратным по сравнению с его связыванием с фосфорилированным фрагментом MCAK Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(P03H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:17).

Антитела в соответствии с изобретением проявляют полезные эффекты для пациентов, нуждающихся в направленной терапии на Tau. Антитела в соответствии с изобретением обладают новыми и изобретательскими свойствами, вызывающими пользу для пациента, страдающего таупатией, в частности БА.

Далее в изобретении предложен способ лечения пациента, страдающего таупатией, в частности БА, включающий введение пациенту, у которого диагностировано такое заболевание (и, следовательно, нуждающемуся в такой терапии), антитела, связывающегося с pS422, в соответствии с изобретением. Антитело предпочтительно вводят в фармацевтической композиции.

Следующей формой осуществления изобретения является способ лечения пациента, страдающего таупатией, в частности БА, характеризующийся введением этому пациенту антитела в соответствии с изобретением.

Далее изобретение включает применение антитела в соответствии с изобретением для лечения пациента, страдающего таупатией, в частности БА, и для получения фармацевтической композиции в соответствии с изобретением. Кроме того, изобретение включает способ получения фармацевтической композиции в соответствии с изобретением.

Далее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело в соответствии с изобретением, необязательно вместе с буфером и/или адъювантом, полезным для приготовления препаратов антител для фармацевтических целей.

Далее в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело в соответствии с изобретением в фармацевтически приемлемом носителе. В одной форме осуществления фармацевтическая композиция может быть включена в готовое изделие или в набор.

Антитело по настоящему изобретению можно применять для диагностики неврологического расстройства, такого как болезнь Альцгеймера, путем обнаружения фосфорилированного полипептида Tau. Антитело по настоящему изобретению можно также применять для специфичного обнаружения Tau р8422 или агрегированного, фосфорилированного Tau.

Подробное описание изобретения

Термин "Tau" в соответствии с изобретением охватывает самую длинную изоформу Tau человека, содержащую 441 аминокислоту (изоформу F, Uniprot Р10636-8).

Термин "фосфорилированный Tau (pTau)" в соответствии с изобретением охватывает фосфорилированную форму самой длинной изоформы Tau человека, содержащей 441 аминокислоту (изоформу F, Uniprot P10636-8), образованную путем фосфорилирования по S422 киназой ERK2.

Термин "агрегированный, фосфорилированный Tau" или "агрегированный (фибриллярный), фосфорилированный Tau" в соответствии с изобретением охватывает агрегированную и фосфорилированную форму самой длинной изоформы Tau человека, содержащей 441 аминокислоту (изоформу F, Uniprot P10636-8), образованную путем фосфорилирования агрегированного Tau киназой ERK2.

Термин "фрагмент Tau" в соответствии с изобретением охватывает фрагмент Tau Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp (SEQ ID NO:10).

Термин "фосфорилированный фрагмент Tau" в соответствии с изобретением охватывает фосфорилированный фрагмент Tau Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO₃H₂)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp (SEQ ID NO:9).

Термин "MCAK" в соответствии с изобретением охватывает митотический кинезин человека, ассоциированный с центромерой (кинезиноподобный белок KIF2C, UniProt Q99661)). MCAK_Human (88-102)[95-pSer] представляет собой фосфорилированный фрагмент MCAK, состоящий из аминокислот 88-102, фосфорилированный по серину 95 (SEQ ID NO:17). Этот фосфорилированный фрагмент MCAK не обладает идентичностью или подобием последовательности по сравнению с фосфорилированным фрагментом Tau SEQ ID NO:9. Авторы изобретения обнаружили, что антитела против фосфорилированных фрагментов Tau в соответствии с уровнем техники могут проявлять значительную перекрестную реактивность с неродственными фосфорилированными пептидами и белками человека. Для антител в соответствии с изобретением, которые не связываются с фосфорилированным фрагментом MCAK, такую нежелательную перекрестную реактивность невозможно обнаружить.

Связывание с Tau pS422 и связывание с Tau исследуют с помощью ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) с электролюминесцентным считыванием. Tau или Tau pS422 иммобилизуют при концентрации 2 мкг/мл и добавляют тестируемое антитело (например, человека или мыши). Для обнаружения связанного тестируемого антитела добавляют меченый рутением IgG против человека или против мыши, соответственно, при концентрации 0,5 мкг/мл. Специфичное связывание с Tau pS422 обнаруживают, если отношение сигнала обнаружения Tau pS422 и Tau является по меньшей мере 10000-кратным при максимальном сигнале связывания Tau pS422.

Связывание с фосфорилированным фрагментом Tau SEQ ID NO:9, связывание с нефосфорилированным фрагментом Tau SEQ ID NO:10 и с фосфорилированным фрагментом MCAK SEQ ID NO:17 исследуют с помощью ELISA. Тестируемое антитело инкубируют с иммобилизованным фосфорилированным фрагментом Tau и для сравнения с иммобилизованным нефосфорилированным фрагментом Tau или с фрагментом MCAK. Это антитело является меченым, и метку обнаруживают. Специфичное связывание с фосфорилированным фрагментом Tau обнаруживают, если отношение сигнала обнаружения с использованием фосфорилированного фрагмента Tau и нефосфорилированного фрагмента Tau составляет по меньшей мере 100 при максимальном сигнале связывания фосфорилированного фрагмента Tau, и, если отношение сигнала обнаружения с использованием фосфорилированного фрагмента Tau и фосфорилированного фрагмента MCAK также составляет по меньшей мере 100 при максимальном сигнале связывания фосфорилированного фрагмента Tau.

Термин "эпитоп Mab2.10.3" охватывает эпитоп, локализованный внутри фосфорилированного фрагмента Tau Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO₃H₂)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp (SEQ ID NO:9), который специфично распознается Mab2.10.3. Свойство связывания эпитопа антитела к Tau в соответствии с настоящим изобретением определяют с помощью анализа перекрестного блокирования связывания in vitro, такого как анализ перекрестного блокирования связывания Biacore™ in vitro, чтобы определить способность Mab2.10.3 к стерическому затруднению связывания тестируемого антитела с pTau. Для такого анализа Mab2.10.3 иммобилизуют в качестве первого антитела на сенсоре Biacore, после чего осуществляют последовательные впрыскивания pTau и второго антитела, подлежащего тестированию. Если второе антитело не проявляет какого-либо обнаружимого сигнала связывания, это второе антитело связывается с тем же эпитопом, что и Mab2.10.3.

Антитело в соответствии с изобретением связывается с Tau р3422 со сродством от 5×10^-8 М^-1 до 10^-12 M^-1, как определено с помощью анализа Biacore™, описанного выше.

Связывание с фибриллярными агрегатами Tau р8422 исследуют с помощью анализа Biacore. Для этого анализа агрегированный Tau р8422 иммобилизуют, и добавляют тестируемое антитело в различных концентрациях, используя коэффициент разведения 2 и максимальную концентрацию 200 нМ. Антитело в соответствии с изобретением связывается с фибриллярным Tau р8422 с Kd от 0,1 до 30, предпочтительно с Kd от 10 до 20 нМ.

Термин "моноклональное антитело или антитело" охватывает различные формы антитела, предпочтительно моноклонального антитела и особенно предпочтительно моноклонального антитела IgG1 или IgG4. Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело или дополнительно генетически сконструированное антитело, если сохраняются его характеристические свойства в соответствии с изобретением. Антитела, истощенные по Т-клеточному эпитопу, могут быть получены с использованием способов, описанных в WO 98/08097.

"Фрагменты антитела" включают участок полноразмерного антитела, предпочтительно его вариабельный домен или по меньшей мере его антигенсвязывающий сайт. Примеры фрагментов антитела включают диатела, одноцепочечные молекулы антитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Антитела scFv описаны, например, в Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Кроме того, фрагменты антитела включают одноцепочечные полипептиды, обладающие характеристиками домена V_H, а именно способные к сборке вместе с доменом V_L, или домена V_L, связывающегося с Таи р8422, а именно способные к сборке вместе с доменом V_H с образованием функционального антигенсвязывающего сайта. Термин "гуманизированное антитело" относится к антителам, в которых каркасные участки и/или "участки определения комплементарности" (CDR) модифицированы таким образом, что включают CDR иммуноглобулина другого вида по сравнению с видом родительского иммуноглобулина. В предпочтительной форме осуществления

a) CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8 и CDR1L SEQ ID NO:3, CDR2L SEQ ID NO:4, CDR3L SEQ ID NO:5,

b) CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:24 и CDR3H SEQ ID NO:25 и CDR1L SEQ ID NO:27, CDR2L SEQ ID NO:28, CDR3L SEQ ID NO:29,

c) CDR1H SEQ ID NO:31, CDR2H SEQ ID NO:32 и CDR3H SEQ ID NO:33 и CDR1L SEQ ID NO:35, CDR2L SEQ ID NO:36, CDR3L SEQ ID NO:37,

d) CDR1H SEQ ID NO:39, CDR2H SEQ ID NO:40 и CDR3H SEQ ID NO:41 и CDR1L SEQ ID NO:43, CDR2L SEQ ID NO:44, CDR3L SEQ ID NO:45,

e) CDR1H SEQ ID NO:23, CDR2H SEQ ID NO:48 и CDR3H SEQ ID NO:49 и CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:52, CDR3L SEQ ID NO:53,

f) CDR1H SEQ ID NO:55, CDR2H SEQ ID NO:48 и CDR3H SEQ ID NO:49 и CDR1L SEQ ID NO:51, CDR2L SEQ ID NO:60, CDR3L SEQ ID NO:61 или

g) CDR1H SEQ ID NO:63, CDR2H SEQ ID NO:64 и CDR3H SEQ ID NO:65 и CDR1L SEQ ID NO:67, CDR2L SEQ ID NO:68, CDR3L SEQ ID NO:69

прививают на каркасный участок человеческого антитела с получением "гуманизированного антитела". См., например, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; и Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270.

"Вариабельный домен" (вариабельный домен легкой цепи (V_L), вариабельный домен тяжелой цепи (V_H)), как используют в данной заявке, означает каждую из пар доменов легкой и тяжелой цепи, которые вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепи имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен включает четыре каркасных (FR) участка, последовательности которых широко консервативны, соединенные тремя "гипервариабельными участками" (или участками определения комплементарности, CDR). Каркасные участки принимают β-складчатую конформацию, а CDR могут образовать петли, соединяющие β-складчатую структуру. Участки CDR в каждой цепи удерживаются в своей трехмерной структуре каркасными участками и вместе с CDR из другой цепи образуют антигенсвязывающий сайт. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепи антитела играют особенно важную роль в связывающей специфичности/сродстве антител в соответствии с изобретением и, следовательно, образуют следующий аспект изобретения.

Термин "антигенсвязывающий участок антитела" при использовании в данной заявке относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Антигенсвязывающий участок антитела включает аминокислотные остатки из "участков определения комплементарности" или "CDR". "Каркасные" или "FR" участки представляют собой участки вариабельных доменов, иные, чем остатки гипервариабельных участков, как определено в данной заявке. Таким образом, вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела включают от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В частности, CDR3 тяжелой цепи является участком, который вносит наибольший вклад в связывание антигена и определяет свойства антитела. Участки CDR и FR определяют в соответствии со стандартным определением Кэбота, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) и/или как остатки из "гипервариабельной петли".

Термин "CDR1H" обозначает участок CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, вычисленный согласно Кэботу. CDR2L, CDR3H и т.д. означают соответствующие участки из тяжелой (Н) или легкой (L) цепи. Например, антитело, характеризующееся тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:6, означает, что антитело включает эту аминокислотную последовательность в качестве вариабельного участка тяжелой цепи CDR1 в его вариабельной тяжелой цепи. Например, антитело, характеризующееся тем, что оно включает CDR1H SEQ ID NO:6, CDR2H SEQ ID NO:7, CDR3H SEQ ID NO:8, означает, что антитело включает в его тяжелой цепи в качестве последовательности CDR1 SEQ ID NO:6, в качестве последовательности CDR2 SEQ ID NO:7 и в качестве последовательности CDR3 SEQ ID NO:8.

Термины "нуклеиновая кислота" или "молекула нуклеиновой кислоты", как используют в данной заявке, подразумевают как включающие молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитевой или двунитевой, но предпочтительно представляет собой двунитевую ДНК.

Термин "аминокислота", как используют в данной заявке при данном применении, означает группу встречающихся в природе карбокси-α-аминокислот, включающую аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gin, Q), глутаминовую кислоту (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, M), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серин (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Нуклеиновая кислота "оперативно сцеплена", когда ее помещают в функциональные взаимоотношения с другой аминокислотой. Например, ДНК для препоследовательности или секреторной лидерной последовательности оперативно сцеплена с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде пребелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер оперативно сцеплен с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой последовательности; или сайт связывания рибосомы оперативно сцеплен с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что способствует трансляции. В целом "оперативно сцепленный" означает, что последовательности ДНК, которые являются сцепленными, являются коллинеарными, и в случае секреторной лидерной последовательности являются непрерывными и находятся в одной рамке считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть непрерывными. Сцепление осуществляют путем лигирования в удобных сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

Как используют в данной заявке, выражения "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используют взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают первичную обсуждаемую клетку и культуры, имеющие от нее происхождение, независимо от числа переносов. Также понятно, что все потомство может быть не в точности идентичным по содержанию ДНК вследствие преднамеренных или случайных мутаций. Включены варианты потомства, обладающие одной и той же функцией и биологической активностью, скрининг на которую осуществляют в исходно трансформированной клетке.

"Участок Fc" антитела не вовлечен непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции. "Участок Fc антитела" является термином, хорошо известным специалистам в данной области техники, и определен на основании расщепления антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности каркасной области их тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины делят на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (подтипы), например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. В соответствии с константными областями тяжелой цепи различные классы иммуноглобулинов называют α, δ, ε, γ и µ соответственно. Антитело в соответствии с изобретением предпочтительно включает участок Fc человеческого происхождения, который принадлежит к подтипу IgG1 или IgG4.

Константные легкие и тяжелые цепи человека и константные цепи подтипа IgG1 или IgG4 хорошо известны на уровне техники и описаны, например, Кэботом (см., например, Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Например, полезная константная область тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 или 14 (IgG1) или SEQ ID NO:15 или 16 (IgG4). Например, полезная константная область легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность константную область легкой цепи каппа SEQ ID NO:11. Кроме того, предпочтительно, чтобы антитело имело мышиное происхождение и включало каркас вариабельной последовательности антитела мышиного антитела в соответствии с Кэботом (см., например, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E.A. et al., 5^th edition, DIANE Publishing (1992)).

Изобретение включает способ лечения пациента, нуждающегося в терапии, характеризующийся введением этому пациенту антитела в соответствии с изобретением.

Изобретение включает применение антитела в соответствии с изобретением для терапии.

Изобретение включает применение антитела в соответствии с изобретением для получения лекарства для лечения таупатии, в частности БА.

Изобретение включает применение антитела в соответствии с изобретением для лечения заболеваний головного мозга, предпочтительно для лечения таупатии, в частности БА.

Следующей формой осущ