Микроорганизм, продуцирующий о-фосфосерин, и способ получения l-цистеина или его производных из о-фосфосерина с его использованием

Микроорганизм, продуцирующий о-фосфосерин, и способ получения l-цистеина или его производных из о-фосфосерина с его использованием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения цистеина или его производных с использованием O-фосфосерина в качестве промежуточного продукта и рекомбинантного микроорганизма, используемого для продукции O-фосфосерина.

Известный уровень техники

L-цистеин представляет собой аминокислоту, которая играет важную роль в метаболизме серы у всех живых организмов. Он используется в биосинтезе белков, таких как кератин волос, глутатиона, биотина, метионина, и других содержащих серу метаболитов, а также служит в качестве предшественника коэнзима A. Кроме того, как известно, биосинтез цистеина тесно связан с биосинтезом других аминокислот, включая L-серин, L-глицин и L-метионин. L-цистеин и его производные находят применение в различных отраслях промышленности, включая фармацевтическую промышленность (для лечения бронхиальных заболеваний), косметическую промышленность (в шампунях для волос, составах для перманентной завивки) и пищевую промышленность (для антиоксидантов, усилителей вкуса, в качестве вспомогательного агента при приготовлении теста и т.д.).

L-цистеин получали ранее промышленным способом с помощью кислотного гидролиза волос человека или перьев животных (Biotechnology of the Amino Acids Production под редакцией Ko Aida, p. 217-223, 1986). Однако получение цистеина из волос или перьев не только обеспечивало такой низкий выход, как 7-8%, но также из-за использования хлористоводородной кислоты или серной кислоты возникало большое количество отходов, что приводило к загрязнению окружающей среды. Кроме того, экстракция из волос или перьев может индуцировать у пользователя сильные неблагоприятные эффекты. Эти проблемы дали толчок к развитию способов получения L-цистеина, благоприятных для окружающей среды. Главный современный путь получения включает ферментацию с использованием микроорганизмов.

Среди вариантов микробной продукции L-цистеина примером является 1) биологическое превращение D, L-ATC с использованием микроорганизма (Ryu OH, Ju JY and Shin CS, Process Biochem., 32:201-209, 1997). Этот способ превращения является, однако, трудным для применения в промышленном масштабе из-за низкой растворимости предшественника D, L-ATC. 2) Другой способ получения L-цистеина представляет собой прямую ферментацию с использованием E. coli (патент № EP0885962B; Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). Избыточная аккумуляция L-цистеина в микроорганизмах вызывает внутриклеточную токсичность, создавая ограничение для получения L-цистеина в высокой концентрации. Для преодоления этого препятствия применяют белки, экспортирующие L-цистеин, но при этом не выявлено существенных улучшений продуктивности.

Относительно пути биосинтеза L-цистеина в микроорганизмах и растениях, O-ацетилсерин (OAS) выполняет функцию промежуточного продукта-предшественника, создавая углеродный каркас L-цистеина (Kredich NM and Tomkins GM, J. Biol. Chem., 241: 4955-4965, 1966). Фермент O-ацетилсеринсульфгидрилаза (OASS), используя сульфид водорода в качестве донора серы, катализирует превращение O-ацетилсерина в цистеин. Альтернативно, SO₄ может быть восстановлен до тиосульфата для использования в качестве донора серы при получении цистеина (Nakamura T, Kon Y, Iwahashi H and Eguchi Y, J. Bacteriol., 156: 656-662, 1983). Следовательно, цистеин может быть получен с использованием микроорганизмов, аккумулирующих OAS и OASS, с использованием различных доноров серы (патент США 6579705). В пути биосинтеза цистеина через OAS используются два фермента серинацетилтрансфераза (CysE), которая катализирует превращение серина в OAS, и цистеинсинтаза (CysK), которая катализирует превращение OAS в цистеин. Среди них серинацетилтрансфераза (CysE) высокочувствительна к ингибированию конечным продуктом цистеином по механизму обратной связи (Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006).

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Авторы настоящего изобретения благодаря интенсивным исследованиям выявили в Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis и Trichomonas vaginalis присутствие O-фосфосеринсульфгидрилазы (OPSS), которая использует O-фосфо-L-серин(OPS)-специфичный путь, а не OAS-специфичный путь для синтеза L-цистеина (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW and Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006), и обнаружили что OPSS M. tuberculoses может использовать Na₂S в качестве донора серы при превращении OPS в цистеин даже в отсутствие дополнительных ферментов, когда из нее удаляют пять C-концевых аминокислотных остатков (Argen D, Schnell R and Schneider G, FEBS letters, 583: 330-336, 2009), что привело к настоящему изобретению. В настоящем изобретении микроорганизм является мутантным для аккумуляции в нем OPS, затем происходит инкубация для превращения OPS в цистеин в присутствии фермента OPSS. Этот способ ранее нигде не был описан.

Техническое решение

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения цистеина или его производного.

Другой целью настоящего изобретения является получение рекомбинантного микроорганизма для продукции O-фосфосерина.

Эффективные результаты изобретения

Способ по настоящему изобретению, в котором рекомбинантным микроорганизмом с высоким выходом продуцируется O-фосфосерин и используется для превращения в цистеин как таковой, является более благоприятным для окружающей среды и обеспечивает более высокую эффективность продукции цистеина по сравнению с методами химического синтеза. Цистеин и его производные, получаемые с помощью ферментации и биопревращения по настоящему изобретению, могут широко использоваться при изготовлении пищевых продуктов для человека и животных и пищевых добавок.

Краткое описание фигур

Фиг.1 представляет собой схематическую диаграмму, демонстрирующую аккумуляцию O-фосфосерина при микробной ферментации, и ферментативное превращение аккумулированного O-фосфосерина в L-цистеин.

Фиг.2 представляет собой график, демонстрирующий активность сульфгидрилазы OPS при различной температуре.

Фиг.3 представляет собой панель графиков, демонстрирующих чувствительность сульфгидрилазы OPS к рН.

Фиг.4 представляет собой фотографию, демонстрирующую уровень экспрессии Msm-T в системе pET и системе pCL-Pcj1 при анализе с помощью SDS PAGE.

Фиг.5 представляет собой график, демонстрирующий ферментативную активность сульфгидрилазы OPS при превращении очищенного из ферментационного бульона OPS в цистеин.

Фиг.6 представляет собой график, демонстрирующий ферментативную активность сульфгидрилазы OPS при превращении OPS ферментационного бульона в цистеин.

Лучший способ осуществления изобретения

В рамках изобретения термин «превращение в цистеин» обозначает каталитическую реакцию O-фосфосеринсульфгидрилазы (OPSS), которая приводит к превращению субстрата O-фосфосерина (OPS) в продукт цистеин, то есть он обозначает каталитическую реакцию превращения OPS в цистеин.

В рамках изобретения термин «степень превращения в цистеин» обозначает процентное отношение количества продукта цистеина к количеству исходного соединения OPS. При оптимальных условиях реакции 1 моль OPS превращается в 1 моль цистеина. Например, если 100 моль OPS превращается в 100 моль цистеина, степень превращения в цистеин составляет 100%.

В соответствии с одним из его аспектов настоящее изобретение относится к способу получения цистеина или его производного, включающему:

1) культивирование рекомбинантного микроорганизма, который модифицирован так, чтобы иметь пониженную активность эндогенной фосфосеринфосфатазы (SerB), для продукции O-фосфосерина (OPS); и 2) введение в реакцию OPS со стадии 1) с сульфидом в присутствии O-фосфосеринсульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, экспрессирующего OPSS, для получения цистеина или его производного.

В способе стадия 1) относится к культивированию рекомбинантного микроорганизма, у которого активность эндогенной фосфосеринфосфатазы (SerB) понижена.

SerB представляет собой белок, который обладает гидролизирующей активностью, гидролизуя OPS до L-серина. Таким образом, микроорганизм, который имеет сниженную эндогенную активность SerB, характеризуется аккумуляцией в нем OPS. SerB без ограничения может включать любые аминокислотные последовательности, которые проявляют активность SerB, и предпочтительно может представлять собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2. Однако используется любая аминокислотная последовательность, до тех пор, пока она проявляет активность SerB, которая гомологична SEQ ID NO: 1 или 2 предпочтительно на 90% или более, более предпочтительно на 96% или более, еще более предпочтительно на 98% или более и наиболее предпочтительно на 99% или более. Сниженная активность SerB обозначает снижение активности SerB по сравнению с активностью ранее модифицированного штамма и охватывает разрушение SerB. Различные способы снижения активности SerB хорошо известны в данной области техники. Иллюстративные примеры включают делецию хромосомного serB, введение мутации в хромосомный serB для снижения эндогенной активности SerB, введение мутации в регуляторную область serB для снижения эндогенной активности SerB, замену хромосомного serB мутантным геном для снижения эндогенной активности SerB и введение антисмыслового олигонуклеотида, комплементарного транскрипту serB, для ингибирования трансляции мРНК, но методы снижения активности SerB не ограничиваются этими. Эти методы в настоящем изобретении могут быть применены для снижения активности других ферментов.

Разрушение эндогенной SerB ведет к введению сериновой ауксотрофии в рекомбинантном микроорганизме, так что среда должна быть дополнена глицином и серином. Глицин может быть предоставлен в форме очищенного глицина, содержащего глицин дрожжевого экстракта или триптона. Глицин содержится в концентрации от 0,1 до 10 г/л и предпочтительно в концентрации от 0,5 до 3 г/л. Что касается серина, он может быть предоставлен в форме очищенного серина, содержащего серин дрожжевого экстракта или триптона. Его концентрация в культуральной среде находится в диапазонах от 0,1 до 5 г/л и предпочтительно от 0,1 до 1 г/л.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения при культивировании в среде, содержащей глицин или серин, мутантные Corynebacterium glutamicum или E. coli, в которых нарушена активность эндогенной SerB, как обнаружено, продуцируют более высокое количество OPS по сравнению с диким типом (смотри таблицы 2, 3, 6 и 7).

Кроме того, рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению может иметь повышенную фосфоглицератдегидрогеназную (SerA) или фосфосеринаминотрансферазную (SerC) активность. SerA представляет собой белок, который активен в плане превращения 3-фосфоглицерата в 3-фосфогидроксипируват. SerA может иметь аминокислотную последовательность дикого типа или мутантную аминокислотную последовательность, которая проявляет устойчивость к ингибированию серином по механизму обратной связи, но не ограничивается этим. Предпочтительно SerA может иметь одну из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: с 3 по 7. Любая аминокислотная последовательность может быть использована до тех пор, пока она проявляет активность SerA дикого типа или активность мутантной SerA, устойчивой к ингибированию серином по механизму обратной связи, хотя предпочтительно, чтобы она была гомологична одной из SEQ ID NO: с 3 по 7 на 90% или более, более предпочтительно на 96% или более, еще более предпочтительно на 98% или более и наиболее предпочтительно на 99% или более. «Мутантная SerA, устойчивая к ингибированию серином по механизму обратной связи», обозначает мутанта, проявляющего поддерживаемую или повышенную активность SerA безотносительно к ингибированию серином или глицином по механизму обратной связи. Мутанты, устойчивые к механизму обратной связи, хорошо известны в данной области техники (Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276: 17844-17850, 2001; Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 437-441, 2002; патент EP0943687B). В одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда serA, устойчивый к механизму обратной связи, был дополнительно введен в Corynebacterium glutamicum или E. coli, обладающих нарушенным serB, они, как обнаружено, продуцировали более высокое количество OPS по сравнению с диким типом (смотри таблицы 4 и 9).

SerC представляет собой белок, который активен в плане превращения 3-фосфогидроксипирувата в O-фосфосерин. SerC без ограничения может включать последовательности, которые проявляют активность SerC, и может предпочтительно иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Однако может быть использована любая аминокислотная последовательность до тех пор, пока она проявляет активность SerC, но предпочтительно она должна быть гомологична SEQ ID NO: 8 на 90% или более, более предпочтительно на 96% или более, еще более предпочтительно на 98% или более и наиболее предпочтительно на 99% или более. Более того, в serC может быть введена мутация так, что ферментативная активность может быть повышена. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда в них дополнительно был введен serC, Corynebacterium glutamicum или E. coli, обладающие нарушенным serB и устойчивым к механизму обратной связи serA, как обнаружено, продуцировали более высокое количество OPS по сравнению с диким типом (смотри таблицу 9).

Кроме того, может быть снижена способность рекомбинантного микроорганизма по настоящему изобретению осуществлять внутриклеточный захват O-фосфосерина или его разрушение. Конкретно, рекомбинантный микроорганизм может быть модифицирован для снижения активности ABC транспортера алкилфосфоната PhnC/PhnD/PhnE (оперона PhnCDE, который представляет собой АТФ-связывающий компонент транспорта фосфоната (PhnC; EG 10713)-компонента периплазматического связывающего белка транспортера Pn (PhnD; EG 10714)-интегрального мембранного компонента ABC транспортера алкилфосфоната (PhnE; EG 11283)), щелочной фосфатазы (PhoA) или кислой фосфатазы (AphA).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения дополнительная делеция оперона phnCDE из рекомбинантного мутанта, как обнаружено, приводила к повышению продукции OPS (таблица 10). В рекомбинантном микроорганизме, в котором дополнительно нарушена активность PhoA или AphA, разрушение OPS начинает снижаться в то время, когда снижается концентрация фосфорной кислоты в культуральной среде (таблица 12). Более того, введение serA, устойчивого к механизму обратной связи, или serC повышало продукцию OPS (таблицы с 14 по 16).

Кроме того, рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению может быть дополнительно охарактеризован по повышению активности пиримидиннуклеотидтрансгидрогеназы (PntAB; EC 1.6.1.1). Как описано ранее (Sauer U P et al., J Biol Chem. 20; 279(8):6613-9. Epub 2003), PntAB участвует в метаболизме НАДФН для регуляции внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса. В одном варианте осуществления настоящего изобретения в рекомбинантном микроорганизме, в котором активность PntAB была дополнительно увеличена путем гиперэкспрессии pntAB, как обнаружено, увеличивалась продукция OPS (таблица 17).

Более того, рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению может быть охарактеризован по повышению пермиазы оттока O-ацетилсерина/цистеина (YfiK), белка оттока гомосерина/гомосеринлактона (RhtB; EG 11469) или белка оттока треонина/гомосеринлактона (RhtC; EG11468). YfiK известен как экспортер для внеклеточного экспорта цистеина и OAS (Franke I et al., J. Bacteriology, 185: 1161-1166, 2003), а RhtB, как сообщалось, действует как экспортер из клетки гомосерина/гомосеринлактона, предшественника треонина. Кроме того, RhtC известен как экспортер треонина и гомосерина. Повышение активности YfiK, RhtC и RhtB выявило усиление роста и продукции OPS у штамма, аккумулирующего OPS (таблица 18).

Повышение ферментативной активности может быть достигнуто с использованием различных хорошо известных методов, включая, но не ограничиваясь этим, повышение количества копий гена, кодирующего фермент, представляющий интерес, введение мутации в регуляторную область гена для повышения ферментативной активности, замену хромосомного гена мутантным геном для повышения ферментативной активности и введение мутации в хромосомный ген для повышения ферментативной активности.

Кроме того, рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению может быть дополнительно охарактеризован по сниженной активности фосфоглицератмутазы. Фосфоглицератмутаза существует в виде трех изозимов: GpmI, GpmA и GpmB и ответственна за превращение 3-фосфоглицерата в 2-фосфоглицерат в процессе гликолиза. При использовании 3-фосфоглицерата в качестве субстрата эти ферменты конкурируют с SerA, который катализирует синтез 3-фосфогидроксипирувата. Следовательно, пониженная активность каждого из ферментов, как обнаружено, является причиной избытка 3-фосфоглицерата, предшественника OPS, приводя к продукции повышенного уровня OPS (Таблица 19).

В рекомбинантном микроорганизме по настоящему изобретению может быть также снижена L-сериндегидратаза I (SdaA; EC 4.3.1.17) или 2-амино-3-кетобутират-коэнзим A-лигаза (Kbl). Таким образом, рекомбинантный микроорганизм характеризуется продукцией OPS, поддерживаемой или увеличенной, даже когда он культивируется в среде, содержащей низкую концентрацию глицина или серина (таблица 20).

Кроме того, рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению может быть дополнительно охарактеризован по сниженной активности IclR. IclR представляет собой транскрипционный фактор, который функционирует как репрессор экспрессии aceBAK, оперона обхода глиоксилата (L Gui et al., J. Bacteriol., Vol. 178, №1, 321-324, 1996). Когда его удаляют делецией, продукция OPS, как показано, повышается (таблица 21).

Рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению может быть также дополнительно охарактеризован по повышенной активности ферментов, выбранных из группы, состоящей из i) ацетил-CoA синтетазы (Acs), ii) киназы уксусной кислоты (AckA)-фосфотрансацетилазы (Pta), iii) малатсинтазы G (GlcB), iv) малатдегидрогеназы (MaeB), v) глутаматдегидрогеназы (GdhA), vi) глиоксалаткарболигазы (Glc), vii) тартронатсемиальдегидредуктазы 2 (GlxR), viii) глицераткиназы II (GlxK) и их сочетания.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, когда i) Acs (EC №6.2.1.1; J Bacteriol. 1995 May; 177(10):2878-86) или мономер пируватоксидазы (PoxB; EC 1.2.2.2) или ii) AckA и Pta (EC 2.3.1.8), целью которых у всех является эффективное повторное использование аккумулированного ацетата с сопутствующим потреблением продуцируемого НАДН, были дополнительно повышены, рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению, как обнаружено, повышал продукцию OPS (таблица 22). Функционируя как катализаторы синтеза малата из глиоксилата и превращения малата в пируват iii) GlcB (EC No.2.3.3.9) и iv) MaeB (EC 1.1.137) могут ослаблять цикл TCA и таким образом использоваться для повышения потребления глюкозы и продукции O-фосфосерина (таблица 23). В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения повышение v) GdhA; (EC 1.4.1.2), который катализирует синтез глутамата, субстрата SerC, из 2-оксоглутарата и НАДФН, придает намного более высокий потенциал для продукции OPS микроорганизмом (таблица 17). Все из vi) Glc (EC 4.1.1.47), vii) GlxR (EC 1.1.1.60) и viii) GlxK (EC 2.7.1.31), как известно, превращают гликоксилат в 3-фосфоглицерат, что означает повышение уровня субстрата фосфоглицератдегидрогеназы (Kim HJ et al., J. Bacteriol., 186(11), 3453-3460, 2004; Eva Cusa et al., J. Bacteriol., 181(24), 7479-7484, 1999; Chnag YY et al., J. Biol. Chem. 268(6): 3911-3919, 1993). Рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению при дополнительном увеличении Glc, GlxR и GlxK был улучшен по потреблению сахара и росту (таблица 24).

Рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению относится к любому микроорганизму, в котором существует снижение активности SerB таким образом, что продукция OPS находится на повышенном уровне. Если это условие удовлетворяется, любой микроорганизм, будет ли он прокариотным или эукариотным, попадает в объем настоящего изобретения. Иллюстративными примерами среди них являются энтеробактерии или дифтериеподобные бактерии. Примеры микроорганизмов, пригодных для настоящего изобретения, включают Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp. и Brevibacterium sp. Предпочтительными являются Escherichia sp. и Corynebacterium sp. при большей предпочтительности Escherichia sp. и наибольшей предпочтительности E. coli.

В одном варианте осуществления рекомбинантный штамм, способный продуцировать OPS, назван E. coli CA07-0012 и положен на хранение в Корейский центр культивируемых микроорганизмов, расположенный в 361-221, Hongje 1, Seodaemun, Seoul, Korea, 12 октября 2011 г. под номером поступления KCCM11212P.

Кроме того, в одном варианте осуществления рекомбинантный штамм, способный продуцировать OPS, назван E. coli CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC и положен на хранение в Корейский центр культивируемых микроорганизмов, расположенный в 361-221, Hongje 1, Seodaemun, Seoul, Korea, 28 сентября 2010 г. под номером поступления KCCM11103P. В настоящем описании термин «CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC» используется взаимозаменяемо с CA07-0022 serA*(G336V)/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC.

После культивирования штамма в течение 80 часов в 1 л ферментере O-фосфосерин продуцировался в концентрации 19,5 г/л (пример 35).

В рамках изобретения термин «культивирование» обозначает растущие микроорганизмы в искусственно контролируемых условиях. Процедура культивирования может быть проведена с использованием подходящей среды и условий культивирования, хорошо известных в данной области техники. Специалисты в данной области техники могут легко контролировать процедуру культивирования для ее соответствия используемым штаммам. Например, без ограничения она может быть осуществлена в виде периодического культивирования, непрерывного культивирования или периодического подпитываемого культивирования.

Кроме того, культуральная среда содержит источник углерода. Примеры источника углерода включают сахариды и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода могут присутствовать в культуральной среде отдельно или в сочетании. В качестве источника азота в культуральной среде может содержаться органическое вещество, такое как пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соя и белок злаков, или неорганическое азотистое вещество, такое как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота могут быть использованы отдельно или в сочетании. В качестве источника фосфора среда может содержать дигидрофосфат калия, фосфат калия или соответствующие соли натрия. Среда может содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа. Культуральная среда может также содержать аминокислоты, витамины и подходящие предшественники. К среде могут быть добавлены питательные вещества в виде периодического или непрерывного способа добавления.

Для доведения рН культуры к культуральной среде в течение культивирования может быть добавлено подходящим образом такое соединение, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, в течение культивирования используется противопенный агент, такой как полигликолевый эфир жирной кислоты, для подавления образования пены. Более того, для поддержания культуральной среды в аэробных условиях в культуральную среду можно вдувать кислород или содержащий кислород газ. Для анаэробных или микроаэробных условий азот, водород или углекислый газ подаются без аэрации. Культуральная среда может обычно поддерживаться при температуре от 27°С до 37°С и предпочтительно при температуре от 30°С до 35°С. Что касается периода культивирования, культивирование может поддерживаться до тех пор, пока представляющий интерес продукт будет получен в желаемом количестве, и предпочтительно этот период находится в диапазонах от 10 до 100 часов.

Для дальнейшего сбора и извлечения из культуральной среды OPS, продуцируемого в течение стадии культивирования, подходящий метод, известный в данной области техники, может быть выбран в зависимости от типа культуры и процесса культивирования, был ли он периодическим, непрерывным или периодическим подпитываемым.

В способе по настоящему изобретению стадия 2) направлена на взаимодействие OPS со стадии 1) с сульфидом в присутствии O-фосфосеринсульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, экспрессирующего OPSS, для индукции превращения O-фосфосерина в цистеин или его производные.

Сульфид может быть использован в форме жидкости или газа, а также в твердой форме, обычно используемой в данной области техники, из-за различия в рН, давлении и/или растворимости. Любое соединение серы, такое как сульфид (S^2-) или тиосульфат (S₂O₃ ^2-), может быть использовано в настоящем изобретении до тех пор, пока оно может превращаться в тиоловую группу (SH). Предпочтительно могут быть использованы Na₂S, NaSH, H₂S, (NH₄)₂S, NaSH и Na₂S₂O₃, все они могут предоставлять тиоловую группу для OPS. В реакции одна тиоловая группа предоставляется одной молекуле OPS для получения одной молекулы цистеина или его производного. При этом ферментативном превращении сульфид может быть предпочтительно добавлен в молярной концентрации в от 0,1 до 3 раз и более предпочтительно от 1 до 2 раз более высокой по сравнению с используемой для OPS. В плане экономии предоставляющий тиоловую группу сульфид и OPS наиболее предпочтительно используются в молярном отношении 1:1. В одном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве источника серы использовали Na₂S. Na₂S добавляли в молярной концентрации в от 1 до 3 раз более высокой, чем концентрация OPS, используемая в реакции превращения. Предпочтительно он подавался в молярной концентрации в два раза более высокой, чем концентрация OPS для эффективного превращения OPS в цистеин (таблица 34).

Используемый в настоящем описании термин «O-фосфосеринсульфгидрилаза (OPSS)» обозначает фермент, который катализирует перенос тиоловой группы (SH) на OPS (O-фосфосерин) с превращением OPS в цистеин. Фермент был впервые обнаружен в Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis и Trichomonas vaginalis (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE et al., J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005).

Используемый в настоящем описании термин «мутантный» обозначает культуру или индивидуум, которые проявляют наследуемое или ненаследуемое изменение фенотипа. При использовании в отношении OPSS термин «мутантный» предназначен для обозначения фермента OPSS, который генетически изменен так, что его активность может быть эффективно увеличена по сравнению с ферментом дикого типа.

В настоящем изобретении мутантный OPSS может быть сконструирован путем делеции, замены или добавления части нуклеотидной последовательности, кодирующей OPSS. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения фермент OPSS с увеличенной активностью получали путем делеции пяти C-концевых аминокислотных остатков фермента OPSS Mycobacterium smegmatis.

Мутантный OPSS может быть получен в E. coli, широко используемой для экспрессии ферментов, с применением методов генного синтеза на основе оптимизации кодонов, с помощью которых представляющие интерес ферменты могут быть получены с высоким выходом. Альтернативно, для получения мутантного OPSS могут быть использованы методы скрининга пригодных источников фермента, основанные на анализе массивов генетической информации о микроорганизмах методами биоинформатики. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферменты OPSS, которые используют OPS в качестве субстрата для синтеза цистеина, были отобраны из различных микробов путем скрининга гомологии аминокислотных последовательностей. В этом случае осадки клеток, полученные с использованием среды и культуральных условий, которые подходят для данного уровня техники, лизировали с последующей очисткой супернатанта, содержащего фермент, с получением фермента OPSS (таблица 26).

Кроме того, для экономного получения фермента OPSS была разработана экспрессионная система, дающая высокий выход. Вектор pET с применением промотора T7 хорошо известен в данной области техники. Однако изобретатели настоящего изобретения разработали экспрессионную систему для фермента, названную системой CJ1 (корейский патент 10-0620092 B1), вместо применения обычной системы. В одном варианте осуществления настоящего изобретения сравнивали уровни экспрессии OPSS системой pET, включающей промотор T7, и системой CJ1, включающей промотор CJ1, при одних и тех же заданных условиях. В результате система CJ1 показала более высокий уровень экспрессии OPSS, чем система pET. Кроме того, для гиперэкспрессии OPSS в системе pET требовалась низкая температура (18°С) и длительный период времени, а в системе pCL-pCJ1 высокая температура (37°С) и короткий период времени. Для получения OPSS предпочтительно используется система pCL-pCJ1 (пример 46).

Увеличение ферментативной активности может быть достигнуто с использованием различных хорошо известных методов. Например, его можно добиться с помощью увеличения количества копий гена, кодирующего OPSS, использования сильного промотора или введения генетической мутации.

Оптимизация ферментативного превращения под действием OPSS может быть достигнута с использованием различных методов, известных в данной области техники. Например, оптимизация может быть основана на полном понимании характеристик OPSS, таких как оптимальная температура и рН, ингибирование субстратами, концентрация субстратов и т.д. Кроме того, оптимизация может быть определена по оптимальным условиям для ферментативного превращения, таким как оптимальная концентрация OPSS, оптимальные балансы используемых субстратов в плане концентраций, предпочтительные соединения серы, предоставляющие SH для ферментативного превращения, предпочтительность определенных буферов, влияние генерируемых ионов и кофакторы и их оптимальные концентрации.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения был охарактеризован фермент OPSS, полученный с использованием указанного выше способа, и на основе определенных характеристик был разработан экономически выгодный способ ферментативного превращения, который характеризуется высокой степенью образования цистеина из OPS с гарантией стабильности фермента. В способе ферментативного превращения температура реакции может быть установлена от 37°С до 80°С. Подробнее, Ape-OPSS (SEQ ID NO: 12), принадлежащий Archea, проявляет повышенную ферментативную активность при 60°С по сравнению с 37°С и сам фермент высоко стабилен при нагревании с оптимальной реакционной способностью при 60°С. С другой стороны, Msm-T (SEQ ID NO: 10) проявляет оптимальную активность при 37°С и снижает активность при температурной обработке при 60°С. Фермент OPSS, как обнаружено, обладает ферментативной активностью на протяжении диапазона рН от 6,0 до 10,0. Ape-OPSS проявлял оптимальную активность при рН 7,4. При появлении оптимальной активности при рН от 8,0 до 9,0 Msm-T проявлял стабильность на протяжении более широкого диапазона рН по сравнению с Ape-OPSS (таблица 28 и 31 и фиг.2 и 3).

При ферментативном превращении в качестве кофактора может быть использован 0,001-2 мМ PLP (пиридоксаль-5'-фосфат) или 0,001-100 мМ DTT. В одном варианте осуществления настоящего изобретения степень превращения в цистеин была повышена в 2,3 раза в присутствии 25 мМ DTT или 0,2 мМ PLP. Как таковая обработка DTT или PLP вызывает улучшение степени превращения в цистеин на стадии 2). Добавление кофактора приводило к приемлемому уровню в плане рассмотрения повышенной стоимости продукции и увеличенной степени превращения (таблица 30).

Условия реакции для OPSS могут варьироваться в зависимости от типов и концентрации используемого OPS. В одном варианте настоящего изобретения чистый OPS (имеющийся в продаже), OPS, очищенный из культуры, полученной на стадии 1), и содержащую OPS культуру со стадии 1) использовали при различных условиях для обеспечения оптимальных степеней превращения. В результате степень превращения в цистеин варьировала в зависимости от типа и концентрации OPSS, температуры реакции и типа и концентрации OPS (фиг.5 и 6, таблица 35).

Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать выделение и очистку цистеина, полученного на стадии 2). После ферментативного превращения цистеин может быть выделен и очищен из культуральной среды с использованием метода, хорошо известного в данной области техники.

Специалисты в данной области техники могут химически синтезировать из цистеина производные цистеина с использованием хорошо известного метода. Цистеин можно легко ввести в реакцию с ацетилирующим агентом с получением NAC (N-ацетилцистеина) и с галогенуксусной кислотой в основных условиях с получением SCMC (S-карбоксиметилцистеина). Эти производные цистеина используются в качестве агентов в медицине для лечения кашля, бронхита, бронхиальной астмы и больного горла.

В настоящем изобретении бульон OPS, полученный с помощью микробной ферментации, используется в качестве субстрата для синтеза цистеина. Бульон OPS, полученный с помощью микробной ферментации, имеет экономические преимущества над имеющимся в продаже чистым OPS, заключающиеся в том, что бульон OPS может быть использован без необходимости дополнительной очистки, и кофактор PLP, необходимый для превращения, может быть получен из ферментируемой культуры.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения был разработан способ превращения, который обеспечивает степень превращения в цистеин настолько высокую, как 80%, при использовании 50 мкг/мл Msm-T при условиях реакции: 50 мМ бульона OPS или 60 мМ очищенного бульона OPS, 100 мМ Na₂S или 120 мМ Na₂S и 0,2 мМ PLP. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что ферментативное превращение с использованием высоко активных ферментов может быть легко оптимизировано и масштабировано.

В соответствии с другим его аспектом, настоящее изобретение относится к рекомбинантному микроорганизму, у которого снижена активность SerB, для продукции OPS. В одном варианте осуществления рекомбинантный микроорганизм демонстрирует повышение serA или serC, устойчивых к ингибированию серином по механизму обратной связи, или делецию, по меньшей мере, одного выбранного из PhnC/PhnD/PhnE ABC транспортера алкилфосфоната (оперона phnCDE), щелочной фосфатазы (phoA) и кислой фосфатазы (alpha). Предпочтительно рекомбинантный микроорганизм для получения OPS представляет собой микроорганизм, положенный на хранение под № поступления KCCM11103P или KCCM11212P. Более предпочтительно рекомбинантный микроорганизм для получения OPS представляет собой микроорганизм, положенный на хранение под № поступления KCCM11103P.

Способ осуществления изобретения

Лучшее понимание настоящего изобретения может быть достигнуто с помощью последующих примеров, которые предлагаются с целью иллюстрации, но не истолковываются как ограничивающие настоящее изобретение.

Получение O-фосфосерина, продуцируемого Corynebacterium, и продукция O-фосфосерина с ее использованием

Пример 1: Получение штамма Corynebacterium с недостаточностью фосфосеринфосфатазы (serB)

Corynebacterium glutamicum 13032 модифицировали путем делеции гена serB (SEQ ID NO: 13, EC 3.1.3.3), кодирующего фосфосеринфосфатазу, которая катализирует синтез L-серина из O-фосфосерина. С этой целью был сконструирован фрагмент для инактивации serB. Для этого были сконструированы праймеры для получения рекомбинантного штамма 13032-ДserB по настоящему изобретению. Прежде всего была получена последовательность serB Corynebacterium glutamicum 13032 со ссылкой на данные NIH GenBank, и на основе последовательности serB были синтезированы праймеры SEQ ID NO: с 22 по 27. Для сайт-специфического разрушения гена использовали вектор pDC, который не может реплицироваться в Corynebacterium glutamicum. Была сконструирована плазмида pDC-ДserB, в которой открытая рамка считывания serB была внутренне нарушена, и эта плазмида была адаптирована для получения сайт-специфической делеции гена serB в мутантном штамме Corynebacterium glutamicum. Внутреннее разрушение гена pDC-ДserB производилось с помощью кроссоверной ПЦР с использованием пар праймеров SEQ ID NO: 22 и 23 и SEQ ID NO: 24 и 25 с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы и введением продукта ПЦР в вектор pDC. Полученной рекомбинантной плазмидой трансформировали Corynebacterium glutamicum дикого типа путем электропорации (van der Rest et al. 1999). Плазмиду вводили в хромосому путем первичной рекомбинации (кроссинговера) с пос