2537245 - Диагностика и лечение злокачественной опухоли с использованием антитела против ereg

Диагностика и лечение злокачественной опухоли с использованием антитела против ereg

Иллюстрации

Показать все

Группа изобретений основана на выявлении повышенной экспрессии гена и белка EREG при раке толстого кишечника, аденокарциноме легкого, раке поджелудочной железы, раке желудка и раке почки. Группа изобретений раскрывает антитела, которые распознают белок EREG, используют для лечения злокачественной опухоли. Группа изобретений относится к средствам и фармацевтическим композициям против злокачественной опухоли, содержащим в качестве активного ингредиента связывающее EREG антитело. Группа изобретений эффективна в лечении вышеуказанных опухолей. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 22 ил., 5 табл., 11 пр.

Реферат

Уровень техники

Настоящее изобретение относится к способам диагностики и лечения злокачественной опухоли, ингибиторам пролиферации клеток и средствам против злокачественной опухоли.

Предпосылки изобретения

Член семейства эпидермальных факторов роста (в дальнейшем в настоящем описании обозначаемого как EGF), очищенный Toyoda et al., был назван "эпирегулином (EREG)". Известно, что EREG функционирует в качестве ингибитора роста злокачественной опухоли, который индуцирует морфологические изменения клеток HeLa (непатентный документ 1). Аминокислотная последовательность полученного из мыши EREG (зрелый белок), очищенного Toyoda et al., состоит из 46 аминокислотных остатков и обладает степенью идентичности последовательности с другими членами семейства EGF, составляющей приблизительно 24-50%. EREG мыши демонстрировал низкую аффинность в отношении рецептора EGF на клетках A431 (клеточная линия эпителиальной карциномы человека). Анализ с клонированием и экспрессией гена EREG человека, проведенный Toyoda et al., показал, что, несмотря на то, что другие члены семейства EGF экспрессируются повсеместно в тканях человека, экспрессия EREG детектируется в макрофагах, плаценте и различных типах злокачественных клеток (непатентный документ 2). Кроме того, было показано, что растворимая форма EREG оказывает эффект подавления пролиферации на несколько типов злокачественных клеток (WO 94/29340).

Takahashi et al. показали, что активация Erk (MPK3) и p38 (MAPK14) в дифференцированных гладкомышечных клетках (в дальнейшем в настоящем описании обозначаемых как VSMC) от крыс индуцирует дифференцировку клеток. Более того, было показано, что EREG, секретируемый VSMC, действует в качестве аутокринного и/или паракринного фактора дифференцировки. Гомодимер ненасыщенной лизофосфатидной кислоты и PDGFB, который может действовать в качестве факторов дифференцировки VSMC, быстро повышал экспрессию мРНК EREG зависимым от MAPK Erk и p38 образом. Анализ посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (в дальнейшем в настоящем описании обозначаемой как ОТ-ПЦР) и иммуногистохимический анализ или иммуногистохимия (в дальнейшем в настоящем описании обозначаемая как IHC) выявил локализованную экспрессию EREG в атеросклеротических артериях и поврежденных баллоном артериях крысы. Исходя из этих результатов, Takahashi и другие сделали предположение, что EREG может быть вовлечен в прогрессирование ремоделирования сосудов, такого как атеросклероз (непатентный документ 3).

Minn et al. идентифицировали несколько генных кластеров, связанных с метастазами в легкое рака молочной железы, с помощью селекции in vivo, транскриптомного анализа, функционального анализа и клинического исследования, и показали, что EREG является одним из указанных генов (непатентный документ 4).

Более того, Shirasawa et al. показали, что EREG экспрессируется не только в кератиноцитах, но также в тканевых макрофагах, и что у мышей, нокаутированных EREG, развивается хронический дерматит. Осмотр при анализе таких мышей показал, что EREG играет важную роль в иммунных и воспалительных ответах кератиноцитов и макрофагов на границе с внешней средой (непатентный документ 5).

Как описано выше, была показана связь между EREG и дерматитом, метастазами злокачественной опухоли и атеросклерозом. Однако в настоящее время все еще отсутствует конкретное описание эффекта связывающих EREG антител, которые обладают нейтрализующей активностью и цитотоксической активностью на экспрессирующие EREG злокачественные клетки.

[Непатентный документ 1] J. Biol. Chem. 270: 7495-7500, 1995.

[Непатентный документ 2] Biochem. J. 326: 69-75, 1997.

[Непатентный документ 3] Circulation 108: 2524-2529, 2003.

[Непатентный документ 4] Nature 436: 518-524, 2005.

[Непатентный документ 5] Proc. Nat. Acad. Sci. 101: 13921-13926, 2004.

Описание изобретения

[Проблемы, решаемые посредством изобретения]

Задачей настоящего изобретения является предоставление антител против EREG и их применение. Более конкретно, задачей настоящего изобретения является предоставление новых способов диагностики и лечения злокачественной опухоли с использованием антител против EREG, новых ингибиторов пролиферации клеток и средств против злокачественной опухоли, содержащих антитела против EREG, и новых антител против EREG.

[Способы решения проблем]

Авторы настоящего изобретения открыли, что EREG высоко экспрессируется в злокачественных клетках, таких как клетки рака толстого кишечника. Более того, когда определяли активность комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) и антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичности (ADCC) антител против EREG, было обнаружено, что антитела против EREG обладают активностью CDC и активностью ADCC в экспрессирующих EREG клетках. Авторы настоящего изобретения также показали, что антитела против EREG оказывают эффект подавления пролиферации на злокачественные клеточные линии посредством нейтрализации. Более того, исходя из указанных выше открытий, авторы настоящего изобретения обнаружили, что антитела против EREG были эффективны в отношении диагностики, профилактики и лечения различных типов первичных и метастазирующих злокачественных опухолей, и, таким образом, дополнили настоящее изобретение. Более конкретно, авторы настоящего изобретения дополнили настоящее изобретение открытием того, EREG пригоден в качестве инструмента для лечения или диагностики злокачественных опухолей, при которых усиливается экспрессия EREG, включая рак толстого кишечника, аденокарциному легкого, рак поджелудочной железы, рак желудка и рак почки.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента антитело, которое связывается с белком EREG. Также настоящее изобретение относится к ингибиторам пролиферации клеток, содержащим в качестве активного ингредиента антитело, которое связывается с белком EREG. Кроме того, настоящее изобретение относится к средствам против злокачественной опухоли, содержащим в качестве активного ингредиента антитело, которое связывается с белком EREG. Предпочтительно антитело, которое связывается с белком EREG, обладает цитотоксической активностью. Более предпочтительно антитело также обладает нейтрализующей активностью. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения злокачественные опухоли, на которые можно нацеливать лечение, представляют собой рак толстого кишечника, аденокарциному легкого, рак поджелудочной железы, рак желудка и рак почки. Средства против злокачественной опухоли, содержащие антитело против EREG согласно изобретению, пригодны для лечения таких злокачественных опухолей, которые, главным образом, представляют собой первичные или метастазирующие злокачественные опухоли и обладают повышенной экспрессией EREG. Особенно предпочтительными мишенями для лечения согласно изобретению являются первичный рак толстого кишечника, метастазирующий рак толстого кишечника и рак поджелудочной железы.

Более того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело, которое связывается с белком EREG, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции согласно изобретению пригодны для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей, которые обладают повышенной экспрессией EREG. Таким образом, настоящее изобретение относится к применению антитела, которое связывается с белком EREG, для изготовления фармацевтических композиций для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам индукции клеточного повреждения в клетках, которые экспрессируют белок EREG, посредством контактирования экспрессирующих EREG клеток с антителом, которое связывается с белком EREG. Также настоящее изобретение относится к способам подавления пролиферации клеток, которые экспрессируют белок EREG, посредством контактирования экспрессирующих белок EREG клеток с антителом, которое связывается с белком EREG. Антитело, которое связывается с белком EREG, предпочтительно обладает цитотоксической активностью. Клетки, которые экспрессируют белок EREG, предпочтительно представляют собой злокачественные клетки.

Более того, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с белком EREG и обладают цитотоксической активностью в клетках, которые экспрессируют белок EREG. Предпочтительно цитотоксическая активность представляет собой активность ADCC. Предпочтительно цитотоксическая активность представляет собой активность CDC. Также настоящее изобретение относится к антителам, с которыми связано цитотоксическое вещество. В настоящем изобретении цитотоксические вещества, которые могут быть связаны с антителом, включают химиотерапевтические средства, радиоактивные изотопы и токсические пептиды. Предпочтительно в настоящем изобретении антитело само по себе обладает цитотоксической активностью.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с белком EREG и которые обладают цитотоксической активностью и нейтрализующей активностью против экспрессирующих белок EREG клеток.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению белка EREG в качестве диагностического маркера злокачественной опухоли.

Более того, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам диагностики злокачественной опухоли, которые включают детектирование белка EREG с использованием антитела, которое связывается с белком EREG. В способах согласно изобретению предпочтительно проводят детектирование внеклеточного участка белка EREG. Предпочтительно способы согласно изобретению осуществляют с использованием антитела, которое распознает белок EREG. Предпочтительно в способах согласно изобретению проводят детектирование белка EREG в крови, сыворотке или плазме или белка EREG, выделенного из клеток.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам диагностики злокачественной опухоли, которые включает следующие стадии:

(a) получение образца от субъекта и

(b) детектирование белка EREG, присутствующего в полученном образце, с использованием антитела, которое связывается с белком EREG.

В настоящем изобретении в качестве указанного выше образца можно использовать любой образец при условии, что его можно получить от субъекта. В одном варианте осуществления используют образец крови, полученный от субъекта. Предпочтительным образцом крови в настоящем изобретении является сыворотка. В другом варианте осуществления можно использовать образцы, полученные от субъекта хирургически или посредством биопсии. Способы диагностики можно использовать для любой злокачественной опухоли, при условии, что она представляет собой злокачественную опухоль, при которой злокачественные клетки-мишени экспрессируют белок EREG. Злокачественные опухоли, которые являются предпочтительными для настоящего изобретения, представляют собой рак толстого кишечника, аденокарциному легкого, рак поджелудочной железы, рак желудка и рак почки. С помощью настоящего изобретения можно диагностировать как первичные, так и метастатические очаги таких злокачественных опухолей. Злокачественные опухоли, которые являются особенно предпочтительными, представляют собой первичный рак толстого кишечника, метастазирующий рак толстого кишечника и рак поджелудочной железы.

В настоящем изобретении стадию получения образца от субъекта также можно выразить как стадию предоставления образца, полученного от субъекта.

Более того, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам диагностики злокачественной опухоли, которые включают в себя стадии: (1) введения субъекту меченного радиоактивным изотопом антитела, которое связывается с белком EREG; и (2) детектирования накопления радиоактивного изотопа. В определенном варианте осуществления радиоактивный изотоп представляет собой позитронно-активный нуклид. Предпочтительный позитронно-активный нуклид согласно изобретению может быть выбран, например, из группы, состоящей из ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F, ⁴⁵Ti, ⁵⁵Co, ⁶⁴Cu, ⁶⁶Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁶Br, ⁸⁹Zr и ¹²⁴I.

Более того, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам диагностики злокачественной опухоли, где выявляют экспрессию гена, кодирующего белок EREG.

Более того, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к диагностическим средствам и наборам, предназначенным для применения в способах диагностики согласно изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений-кандидатов в качестве лекарственных средств против злокачественной опухоли. В настоящем изобретении соединения могут быть выбраны в качестве лекарственного средства-кандидата против злокачественной опухоли с использованием в качестве показателя, например, уровня экспрессии EREG. Альтернативно, соединение может быть выбрано в качестве лекарственного средства-кандидата против злокачественной опухоли с использованием в качестве показателя нейтрализующего эффекта против активности EREG в отношении стимуляции клеточной пролиферации.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующему:

[1] фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента антитело, которое связывается с белком EREG;

[2] ингибитору клеточной пролиферации, содержащему в качестве активного ингредиента антитело, которое связывается с белком EREG;

[3] средству против злокачественной опухоли содержащему в качестве активного ингредиента антитело, которое связывается с белком EREG;

[4] средству против злокачественной опухоли по [3], где антитело, которое связывается с белком EREG, представляет собой антитело, которое обладает ингибирующей активностью в отношении клеточной пролиферации;

[5] средству против злокачественной опухоли по [3] или [4], где антитело, которое связывается с белком EREG, представляет собой антитело согласно любому из (1)-(57), ниже:

(1) антитело, содержащее H-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 в качестве CDR3;

(2) антитело, содержащее H-цепь согласно (1), где H-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 117-452 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 в качестве CH;

(3) антитело, содержащее H-цепь согласно (1), где H-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 117-446 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 в качестве CH;

(4) антитело, содержащее L-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 в качестве CDR3;

(5) антитело, содержащее L-цепь согласно (4), где L-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 107-213 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 в качестве CL;

(6) антитело, содержащее L-цепь согласно (4), где L-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 107-213 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 в качестве CL;

(7) антитело, содержащее H-цепь согласно (1) и L-цепь согласно (4);

(8) антитело, содержащее H-цепь согласно (2) и L-цепь согласно (5);

(9) антитело, содержащее H-цепь согласно (3) и L-цепь согласно (6);

(10) антитело, содержащее H-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 в качестве CDR3;

(11) антитело, содержащее H-цепь согласно (10), где H-цепь имеет CH, полученную из мышиного IgG1;

(12) антитело, содержащее H-цепь согласно (10), где H-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 117-446 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 в качестве CH;

(13) антитело, содержащее L-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59 в качестве CDR3;

(14) антитело, содержащее L-цепь согласно (13), где L-цепь имеет CL, полученную из мышиной κ-цепи;

(15) антитело, содержащее L-цепь согласно (13), где L-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 107-213 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 в качестве CL;

(16) антитело, содержащее H-цепь согласно (10) и L-цепь согласно (13);

(17) антитело, содержащее H-цепь согласно (11) и L-цепь согласно (14);

(18) антитело, содержащее H-цепь согласно (12) и L-цепь согласно (15);

(19) антитело, содержащее H-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65 в качестве CDR3;

(20) антитело, содержащее H-цепь согласно (19), где H-цепь имеет CH, полученную из мышиного IgG1;

(21) антитело, содержащее H-цепь согласно (19), где H-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 117-446 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 в качестве CH;

(22) антитело, содержащее L-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71 в качестве CDR3;

(23) антитело, содержащее L-цепь согласно (22), где L-цепь имеет CL, полученную из мышиной κ-цепи;

(24) антитело, содержащее L-цепь согласно (22), где L-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 107-213 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 в качестве CL;

(25) антитело, содержащее H-цепь согласно (19) и L-цепь согласно (22);

(26) антитело, содержащее H-цепь согласно (20) и L-цепь согласно (23);

(27) антитело, содержащее H-цепь согласно (21) и L-цепь согласно (24);

(28) антитело, содержащее H-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77 в качестве CDR3;

(29) антитело, содержащее H-цепь согласно (28), где H-цепь имеет CH, полученную из мышиного IgG1;

(30) антитело, содержащее H-цепь согласно (28), где H-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 117-446 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 в качестве CH;

(31) антитело, содержащее L-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83 в качестве CDR3;

(32) антитело, содержащее L-цепь согласно (31), где L-цепь имеет CL, полученную из мышиной κ-цепи;

(33) антитело, содержащее L-цепь согласно (31), где L-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 107-213 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 в качестве CL;

(34) антитело, содержащее H-цепь согласно (28) и L-цепь согласно (31);

(35) антитело, содержащее H-цепь согласно (29) и L-цепь согласно (32);

(36) антитело, содержащее H-цепь согласно (30) и L-цепь согласно (33);

(37) антитело, содержащее H-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89 в качестве CDR3;

(38) антитело, содержащее H-цепь согласно (37), где H-цепь имеет CH, полученную из мышиного IgG1;

(39) антитело, содержащее H-цепь согласно (37), где H-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 117-446 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 в качестве CH;

(40) антитело, содержащее L-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95 в качестве CDR3;

(41) антитело, содержащее L-цепь согласно (40), где L-цепь имеет CL, полученную из мышиной κ-цепи;

(42) антитело, содержащее L-цепь согласно (40), где L-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 107-213 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 в качестве CL;

(43) антитело, содержащее H-цепь согласно (37) и L-цепь согласно (40);

(44) антитело, содержащее H-цепь согласно (38) и L-цепь согласно (41);

(45) антитело, содержащее H-цепь согласно (39) и L-цепь согласно (42);

(46) антитело, содержащее H-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101 в качестве CDR3;

(47) антитело, содержащее H-цепь согласно (46), где H-цепь имеет CH, полученную из мышиного IgG1;

(48) антитело, содержащее H-цепь согласно (46), где H-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 117-446 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 в качестве CH;

(49) антитело, содержащее L-цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103 в качестве CDR1, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105 в качестве CDR2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107 в качестве CDR3;

(50) антитело, содержащее L-цепь согласно (49), где L-цепь имеет CL, полученную из мышиной κ-цепи;

(51) антитело, содержащее L-цепь согласно (49), где L-цепь имеет аминокислотную последовательность из положений 107-213 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 в качестве CL;

(52) антитело, содержащее H-цепь согласно (46) и L-цепь согласно (49);

(53) антитело, содержащее H-цепь согласно (47) и L-цепь согласно (50);

(54) антитело, содержащее H-цепь согласно (48) и L-цепь согласно (51);

(55) антитело, содержащее одну или несколько аминокислотных замен, делеций, добавлений и/или инсерций в антителе согласно любому из (1)-(54), которое обладает активностью, эквивалентной активности антитела согласно любому из (1)-(54);

(56) антитело, которое связывается с тем же эпитопом белка EREG, что и антитело согласно любому из (1)-(55); и

(57) мини-антитело антитела согласно любому из (1)-(56);

[6] средству против злокачественной опухоли по любому из [3]-[5], где антитело, которое связывается с белком EREG, распознает участок с Ala в положении 29 по Ser в положении 69, или с Val в положении 63 по Leu в положении 108, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21;

[7] средству против злокачественной опухоли по любому из [3]-[6], где злокачественная опухоль представляет собой любую злокачественную опухоль, выбранную из группы, состоящей из рака толстого кишечника, аденокарциномы легкого, рака поджелудочной железы, рака желудка и рака почки;

[8] средству против злокачественной опухоли по [7], где злокачественная опухоль представляет собой первичную злокачественную опухоль;

[9] средству против злокачественной опухоли по [7], где злокачественная опухоль представляет собой метастазирующую злокачественную опухоль;

[10] антителу, которое связывается с белком EREG и которое обладает активностью ингибирования клеточной пролиферации против клеток, экспрессирующих белок EREG;

[11] антителу по [10], где активность ингибирования клеточной пролиферации представляет собой цитотоксическую активность;

[12] антителу по [11], где цитотоксическая активность представляет собой активность ADCC;

[13] антителу по [11], где цитотоксическая активность представляет собой активность CDC;

[14] антителу по любому из [10]-[13], которое дополнительно обладает нейтрализующей активностью против белка EREG;

[15] антителу по [10], где активность ингибирования клеточной пролиферации представляет собой нейтрализующую активность;

[16] мини-антителу, полученному из антитела по [10];

[17] антителу по любому из [10]-[16], где с антителом связано химиотерапевтическое средство или токсический пептид;

[18] антителу, которое связывается с белком EREG, где с антителом связано любое цитотоксическое вещество, выбранное из группы, состоящей из химиотерапевтического средства, токсического пептида и радиоактивного изотопа;

[19] антителу по любому из [10]-[18], которое представляет собой антитело согласно любому из (1)-(57), ниже: