Способы и композиции для модуляции гепсином стимулирующего макрофаги белка

Способы и композиции для модуляции гепсином стимулирующего макрофаги белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Для настоящей заявки испрашивается приоритет по Предварительной Патентной заявке США № 61/253990, поданной 22 октября 2009 г., содержание которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится, главным образом, к области молекулярной биологии и регуляции факторов роста. Более конкретно, изобретение относится к модуляторам ферментной активации стимулирующего макрофаги белка и к использованию указанных модуляторов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Стимулирующий макрофаги белок (MSP) опосредует свою биологическую активность через связывание и активацию рецепторной тирозинкиназы Ron, члена семейства Met-протоонкогенов (Leonard & Danilkovitch, 2000). Взаимодействие MSP с его рецептором приводит к фосфорилированию рецептора и активации киназы. Путь MSP/Ron вовлечен в онкогенез различных злокачественных опухолей (см., например, Wagh et al., 2008). MSP представляет собой белок плазмы, который в первую очередь конститутивно синтезируется в паренхимальных клетках печени, но на низких уровнях экспрессируется также в легких, надпочечниках и плаценте. MSP циркулирует в крови в форме неактивного одноцепочечного предшественника (про-MSP), требующего протеолитического расщепления по связи Ser-Lys-Leu-Arg483↓Val484 (SEQ ID NO:1) для приобретения функциональной активности (Skeel et al., 1991) (Yoshimura et al., 1993). Активный MSP представляет собой гетеродимер α- и β-субъединиц, удерживаемых вместе дисульфидной связью. Известно, что MSP активируется в участке, расположенном вне сосуда, несколькими трипсиноподобными сериновыми протеазами (Bhatt et al., 2007; Kawaguchi et al., 2009; Wang et al., 1994b; Wang et al., 1996; Wang et al., 1994c).

Гепсин является членом семейства трансмембранных сериновых протеаз типа II (Netzel-Arnett et al., 2003; Wu & Parry, 2007) и идентифицирован как один из генов с наиболее сильной повышающей регуляцией при раке предстательной железы (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001; Magee et al., 2001; Stamey et al., 2001; Stephan et al., 2004; Welsh et al., 2001). Иммуногистохимическим окрашиванием выявили сильную экспрессию в опухолях на поздней стадии и очагах метастазирования в костях (Morrissey et al., 2008; Xuan et al., 2006), что позволяет предполагать роль гепсина в прогрессировании опухолей. Более того, на основании анализа экспрессии гена, гепсин вовлечен также в рак яичника (Tanimoto et al., 1997), почечноклеточный рак (Betsunoh et al., 2007; Zacharski et al., 1998) и рак эндометрия (Matsuo et al., 2008). Beliveau et al установили, что гепсин не расщепляет про-MSP (Beliveau et al., (2009) FEBS J. 276:2213-26).

Существует явная необходимость во всеобъемлющем понимании физиологических субстратов гепсина. Изобретение удовлетворяет этим требованиям и предоставляет другие преимущества.

Полное содержание всех процитированных в настоящем документе ссылок, включая патентные заявки и публикации, приведено в качестве ссылки.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе описано, что гепсин эффективно превращает стимулирующий макрофаги пробелок (про-MSP) в стимулирующий макрофаги белок (MSP) посредством расщепления пептидной связи Arg₄₈₃-Val₄₈₄. Как описано в настоящем документе, физиологическим субстратом для гепсина является стимулирующий макрофаги пробелок, который является лигандом рецепторной тирозинкиназы Ron, члена семейства Met-протоонкогенов. В настоящем документе показано, что гепсин расщепляет про-MSP с высокой активностью, приводя к активированному MSP, обладающему нормальной биологической активностью. Изобретение относится к способам и композициям, основанным, по меньшей мере частично, на этих открытиях, подробно описанных в настоящем документе. Гепсин и его взаимодействие с про-MSP является уникальной и преимущественной мишенью для более тонкой регулировки при разработке профилактических и/или терапевтических способов против патологических состояний, ассоциированных с аномальной или нежелательной биологической активностью, опосредованной гепсином и/или MSP/Ron. Таким образом, изобретение относится к способам, композициям, наборам и изделиям для идентификации и для использования веществ, способных модулировать опосредованный гепсином и/или MSP/Ron биологический путь посредством модуляции молекулярных взаимодействий, вовлеченных в регуляцию активации MSP.

Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к способу скрининга (или идентификации) вещества-кандидата - ингибитора (т.е. антагониста), ингибирующего активацию гепсином про-MSP, где указанный способ включает: (a) контакт вещества-кандидата с первым образцом, содержащим гепсин и субстрат про-MSP, и (b) сравнение уровня активации про-MSP в образце с уровнем активации про-MSP в контрольном образце, содержащем сходные количества гепсина и субстрата про-MSP, как и в первом образце, но не подвергавшемся контакту с указанным веществом-кандидатом, при этом уменьшение уровня активации про-MSP в первом образце по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что вещество-кандидат способно ингибировать активацию про-MSP гепсином. В одном варианте осуществления гепсин в образце присутствует в эффективном количестве для активации указанного субстрата про-MSP. Субстрат про-MSP, пригодный для использования в этих способах, может присутствовать во множестве форм, при условии, что он мимикрирует характеристику участка расщепления гепсином в про-MSP.

Субстраты про-MSP включают, в качестве неограничивающих примеров, полноразмерную цепь MSP, содержащую форму пептидной связи Arg₄₈₃-Val₄₈₄ дикого типа, и любой фрагмент MSP, содержащий эту пептидную связь. Такой фрагмент может иметь любую длину, например, по меньшей мере (приблизительно) 5, 7, 10, 15, 20, 25 аминокислот в длину, или между (приблизительно) 4 и 25, 5 и 20, 7 и 15 аминокислотами в длину. Обычно и предпочтительно, субстрат про-MSP содержит пептидную связь Arg₄₈₃-Val₄₈₄, которую может расщеплять гепсин дикого типа. В некоторых вариантах осуществления субстрат про-MSP представляет собой синтетический субстрат про-MSP.

В другом аспекте изобретение относится к способу скрининга вещества, блокирующего активацию про-MSP гепсином, где указанный способ включает скрининг вещества, которое связывает (предпочтительно, но не обязательно, специфично) гепсин или про-MSP и блокирует специфическое взаимодействие (например, связывание) между гепсином и про-MSP. В некоторых вариантах осуществления вещество конкурирует с гепсином за связывание с MSP. В некоторых вариантах осуществления вещество конкурирует с про-MSP за связывание с гепсином. В одном варианте осуществления вещество содержит аминокислотную последовательность, состоит или в основном состоит из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% сходством или идентичностью последовательности по сравнению с про-MSP (например, человека), например, фрагмент MSP человека, содержащий аминокислотный остаток Arg₄₈₃ с пептидной связью с Val₄₈₄. В некоторых вариантах осуществления, где вещество содержит такую аминокислотную последовательность, состоит или в основном состоит из такой аминокислотной последовательности, фрагмент содержит мутацию по меньшей мере в части последовательности MSP или лишен по меньшей мере части последовательности MSP, ассоциированной с активностью, например, активацией Ron.

Как очевидно специалисту в данной области, анализы скрининга, совместимые с анализами, описанными выше, могут содержать также первую стадию скрининга для образования комплекса гепсин-MSP для получения первого набора модулирующих веществ-кандидатов с последующей второй стадией скрининга, основанной на способности первого набора модулирующих веществ-кандидатов модулировать активацию про-MSP и/или превращение про-MSP в форму, являющуюся биологически активной. Пригодные представления данных могут являться любыми, очевидными для специалиста в данной области, основанными на знании о формировании комплекса фермент-субстрат и/или видах биологической активности, ассоциированных с путем передачи сигнала гепсин/MSP/Ron. Образование фермент-субстратного комплекса можно измерять с использованием, например, общепринятых биохимических анализов (например, электрофореза в геле, хроматографии, ЯМР и т.д.).

В одном аспекте изобретение относится к антагонистам, нарушающим взаимодействие гепсин/MSP. Например, изобретение относится к молекуле, ингибирующей расщепление про-MSP гепсином (например, расщепление в положении Arg₄₈₃-Val₄₈₄). Молекула может проявлять свою ингибирующую функцию любым числом способов, включая, но без ограничения, связывание либо с гепсином, либо с про-MSP, так что ингибируется расщепление про-MSP гепсином, связывание с комплексом гепсин-про-MSP, так что ингибируется расщепление про-MSP, и/или связывание с про-MSP или гепсином (по отдельности или в комплексе), так что ингибируется расщепление MSP гепсином (например, ингибирование высвобождения MSP, следующего за расщеплением гепсином). В одном варианте осуществления молекула антагониста по изобретению ингибирует виды биологической активности, ассоциированные с активацией про-MSP/Ron.

В одном аспекте антагонист по изобретению получен на основании открытия, описанного в настоящем документе, что фрагмент ингибиторов активатора фактора роста гепатоцитов (HAI-1, HAI-1B, HAI-2) является сильным ингибитором активации про-MSP гепсином. В одном варианте осуществления изобретение относится к антагонисту активации про-MSP гепсином, где указанный антагонист содержит по меньшей мере часть (включая все) HAI-1, HAI-IB или HAI-2 человека. В одном варианте осуществления указанная часть содержит последовательность домена Кунитца (KD), способную ингибировать активацию про-MSP гепсином. В одном варианте осуществления указанная последовательность домена Кунитца представляет собой домен Кунитца 1 (KD1) HAI-1 или HAI-IB. В одном варианте осуществления антагонист по изобретению содержит вариант KD1, обладающий по меньшей мере приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичностью последовательности с KD1 дикого типа HAI-1 человека, где указанный вариант последовательности обладает способностью ингибировать расщепление про-MSP человека гепсином, по меньшей мере сравнимой со способностью KD1 дикого типа. В одном варианте осуществления антагонист по изобретению содержит вариант последовательности KD1, обладающий между приблизительно 70% и 99%, приблизительно 75% и 98%, приблизительно 80% и 97%, 85% и 95% идентичностью последовательности с KD1 дикого типа HAI-1 человека, где указанная последовательность обладает способностью ингибировать расщепление про-MSP человека гепсином, по меньшей мере сравнимой со способностью KD1 дикого типа. В одном варианте осуществления указанная последовательность домена Кунитца представляет собой один или оба из доменов Кунитца HAI-2. В одном варианте осуществления антагонист по изобретению содержит вариант последовательности домена Кунитца HAI-2, обладающий по меньшей мере приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичностью последовательности с соответствующим доменом(доменами) Кунитца HAI-2 человека дикого типа, где указанный вариант последовательности обладает способностью ингибировать расщепление про-MSP человека гепсином, по меньшей мере сравнимой со способностью HAI-2 дикого типа. В одном варианте осуществления антагонист по изобретению содержит вариант последовательности домена Кунитца HAI-2, обладающий между приблизительно 70% и 99%, приблизительно 75% и 98%, приблизительно 80% и 97%, 85% и 95% идентичностью последовательности с соответствующим доменом(доменами) Кунитца HAI-2 человека дикого типа, где указанная последовательность обладает способностью ингибировать расщепление про-MSP человека гепсином, по меньшей мере сравнимой со способностью HAI-2 дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления антагонист по изобретению представляет собой или содержит малую молекулу, пептид, антитело, фрагмент антитела, аптамер или их комбинацию. Антагонисты, как описано в настоящем описании, можно получать общепринятым образом с использованием способов, известных в данной области (включая способы, более подробно описанные ниже), на основании открытия взаимодействия гепсина и про-MSP, как описано в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления антагонист по изобретению конкурирует с гепсином за связывание с про-MSP, но не обладает способностью расщеплять про-MSP в участке расщепления гепсином (например, в Arg₄₈₃-Val₄₈₄). В некоторых вариантах осуществления антагонист по изобретению конкурирует с про-MSP за связывание с гепсином. Например, в одном варианте осуществления указанный антагонист содержит аминокислотную последовательность, состоит или в основном состоит из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% сходством или идентичностью последовательности по отношению к про-MSP (например, про-MSP человека) и по существу обладает способностью связывать гепсин, но лишен участка расщепления гепсином (например, пептидной связи про-MSP Arg₄₈₃-Val₄₈₄) и/или лишен биологической активности (например, когда β-цепь MSP подвергают мутации, так что ее функция по существу снижена или утрачена и т.д.). В одном варианте осуществления антагонист по изобретению содержит фрагмент про-MSP, состоит или в основном состоит из фрагмента про-MSP, способного связывать гепсин, где указанный фрагмент лишен по меньшей мере части последовательности MSP, ассоциированной с биологической активностью.

Таким образом, изобретение относится к мутанту MSP (или про-MSP), по существу способному связывать гепсин, но обладающему пониженной биологической активностью MSP по сравнению с MSP дикого типа, например, антагонисту активности MSP или варианту MSP со снижением, но не отсутствием, биологической активности MSP. В одном варианте осуществления антагонист по изобретению способен ингибировать биологическую активность (in vitro или in vivo) MSP дикого типа (такая биологическая активность включает, но без ограничения, биологическую активность по отношению к плазминогену в качестве субстрата). В одном варианте осуществления антагонист по изобретению обладает сниженной биологической активностью MSP.

В некоторых вариантах осуществления антитело-антагонист по изобретению содержит антитело против гепсина, блокирующее активацию про-MSP гепсином. В некоторых вариантах осуществления антитело против гепсина содержит (a) легкую цепь, содержащую (i) HVR-L1, содержащую последовательность RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:2); (ii) HVR-L2, содержащую последовательность SASSLYS (SEQ ID NO:3); и (iii) HVR-L3, содержащую последовательность QQYYSSYYLLT (SEQ ID NO:4); и/или (b) тяжелую цепь, содержащую (i) HVR-H1, содержащую последовательность GFNFSYSYMH (SEQ ID NO:5); (ii) HVR-H2, содержащую последовательность ASIYSYYGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:6); и (iii) HVR-H3, содержащую последовательность ARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDY (SEQ ID NO:7). В некоторых вариантах осуществления антитело против гепсина содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSSYYLLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:8) и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNFSYSYMHWVRQAPGKGLEWVASIYSYYGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDSWSYKSGYTQKIYSKGLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональные антитело. В других вариантах осуществления антитело представляет собой поликлональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, антитела после аффинного созревания, гуманизированного антитела и человеческого антитела. В конкретных вариантах осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 или scFv.

В некоторых вариантах осуществления связывание вещества или молекулы по изобретению с гепсином ингибирует активацию гепсином субстрата гепсина. В некоторых вариантах осуществления связывание вещества или молекулы по изобретению с гепсином конкурентно ингибирует активацию гепсином субстрата гепсина. В одном варианте осуществления вещество связывает гепсин в отсутствии соединения, блокирующего активный (например, каталитический) участок гепсина, но не связывает гепсин в присутствии соединения, блокирующего активный участок гепсина.

В некоторых вариантах осуществления связывание указанных вещества или молекулы с гепсином ингибирует рост клеток (например, пролиферацию, выживаемость, ангиогенез, морфогенез, миграцию клеток), индуцированный MSP. В некоторых вариантах осуществления связывание указанных вещества или молекулы с гепсином ингибирует активацию рецептора Ron. В некоторых вариантах осуществления связывание вещества или молекулы по изобретению с гепсином ингибирует связывание субстрата гепсина с гепсином. В некоторых вариантах осуществления связывание вещества или молекулы по изобретению с гепсином не ингибирует связывание субстрата гепсина с гепсином. В некоторых вариантах осуществления связывание вещества или молекулы по изобретению с гепсином ингибирует активность гепсина, такую как ферментативная активность гепсина. В некоторых вариантах осуществления ферментативная активность гепсина включает расщепление полипептидного субстрата гепсина. В одном варианте осуществления полипептидный субстрат гепсина представляет собой про-MSP.

В некоторых вариантах осуществления антагонист по изобретению получают способом скрининга или идентификации по изобретению, как описано в настоящем документе.

В одном аспекте молекула антагониста по изобретению связана с токсином, таким как цитотоксическое средство. Эти молекулы можно составлять или вводить в сочетании с дополнительным/усиливающим средством, таким как радиоактивное и/или химиотерапевтическое средство.

Изобретение относится также к способам и композициям, пригодным для модуляции состояний заболевания, ассоциированных с нарушением регуляции пути гепсин/MSP/Ron. Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу модуляции активации про-MSP у субъекта, где указанный способ включает введение субъекту молекулы модулятора гепсина/MSP по изобретению (например, молекулы антагониста, как описано в настоящем документе, ингибирующей расщепление про-MSP гепсином), посредством чего модулируют активацию про-MSP. В одном варианте осуществления указанная молекула представляет собой антагонист, ингибирующий активность MSP. В одном аспекте изобретение относится к способу лечения патологического состояния, ассоциированного с нарушением регуляции MSP у субъекта, где указанный способ включает введение субъекту антагониста по изобретению (например, любого из антагонистов расщепления про-MSP гепсином, как описано в настоящем документе), посредством чего ингибируют активацию про-MSP. В одном аспекте изобретение относится к способу модуляции активации Ron у субъекта, где указанный способ включает введение субъекту молекулы модулятора MSP/Ron по изобретению (например, молекулы антагониста, как описано в настоящем документе, ингибирующей расщепление про-MSP гепсином), посредством чего модулируют активацию Ron. В одном варианте осуществления указанная молекула представляет собой антагонист MSP/Ron, ингибирующий активность MSP/Ron. В одном аспекте изобретение относится к способу лечения патологического состояния, ассоциированного с нарушением регуляции Ron у субъекта, где указанный способ включает введение субъекту антагониста Ron по изобретению (например, любого из антагонистов расщепления про-MSP гепсином, как описано в настоящем документе), посредством чего ингибируют активацию Ron.

Путь передачи сигнала MSP/Ron вовлечен во множество биологических и физиологических функций, включая, например, стимуляцию роста клеток (например, пролиферацию клеток, выживаемость клеток, миграцию клеток, морфогенез клеток) и иммунный ответ (например, увеличенный воспалительный ответ, увеличенная продукция NO макрофагами).

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования роста (например, роста, пролиферации или выживаемости клеток) клетки, экспрессирующей Ron или MSP, или оба, где рост клетки, по меньшей мере частично, зависит от гепсина, Ron и/или MSP, где указанный способ включает контакт указанной клетки с антагонистом по изобретению, таким образом вызывая ингибирование роста указанной клетки.

В одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования миграции клетки, где миграция указанной клетки по меньшей мере частично зависит от гепсина, Ron и/или MSP, где указанный способ включает контакт указанной клетки с эффективным количеством антагониста по изобретению, таким образом ингибируя рост указанной клетки.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу стимуляции апоптоза клетки, экспрессирующей Ron или MSP, или оба, где выживаемость клетки по меньшей мере частично зависит от гепсина, Ron и/или MSP, где указанный способ включает контакт указанной клетки с антагонистом по изобретению, таким образом вызывая ингибирование роста указанной клетки.

В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования иммунного ответа (например, воспаления), где иммунный ответ по меньшей мере частично зависит от гепсина, Ron и/или MSP, где указанный способ включает введение в клетку, ткань и/или субъекту с состоянием, ассоциированным с аномальным иммунным ответом, антагониста по изобретению, посредством чего ингибируют иммунный ответ.

В одном аспекте изобретение относится к использованию антагониста по изобретению в получении лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль, нарушение пролиферации клеток и/или иммунное (например, аутоиммунное) нарушение. Антагонист может присутствовать в любой форме, описанной в настоящем документе, включая антитело, фрагмент антитела, малую молекулу (например, органическую молекулу), полипептид (например, олигопептид), нуклеиновую кислоту (например, олигонуклеотид, такой как антисмысловой олигонуклеотид или интерферирующая РНК), аптамер или их сочетание.

В одном аспекте изобретение относится к использованию нуклеиновой кислоты по изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль, нарушение пролиферации клеток и/или иммунное (например, аутоиммунное) нарушение.

В одном аспекте изобретение относится к использованию экспрессирующего вектора по изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль, нарушение пролиферации клеток и/или иммунное (например, аутоиммунное) нарушение.

В одном аспекте изобретение относится к использованию клетки-хозяина по изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль, нарушение пролиферации клеток и/или иммунное (например, аутоиммунное) нарушение.

В одном аспекте изобретение относится к использованию изделия по изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль, нарушение пролиферации клеток, иммунное (например, аутоиммунное) нарушение и/или связанное с ангиогенезом нарушение (при заживлении ран).

В одном аспекте изобретение относится к использованию набора по изобретению для получения лекарственного средства для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, опухоль, нарушение пролиферации клеток и/или иммунное (например, аутоиммунное) нарушение.

Способы по изобретению можно использовать для воздействия на любое подходящее патологическое состояние, например, клеток и/или тканей, ассоциированное с нарушением регуляции пути передачи сигнала гепсином и/или Ron/MSP. Иллюстративные нарушения описаны в настоящем документе и включают злокачественную опухоль, выбранную из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, рака яичника, рака щитовидной железы, рака яичка, рака эндометрия, рака головы и шеи (например, плоскоклеточной карциномы головы и шеи), злокачественной опухоли мозга (например, нейробластомы или менингиомы), рака кожи (например, меланомы, базально-клеточной карциномы или плоскоклеточной карциномы), рака мочевого пузыря (например, переходно-клеточной карциномы), карциномы молочной железы, рака желудка, колоректального рака (CRC), печеночно-клеточной карциномы, рака шейки матки, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, злокачественной опухоли почек и рака эндометрия.

В одном варианте осуществления клетка, на которую нацеливаются в способе по изобретению, представляет собой клетку злокачественной опухоли. Например, клетка злокачественной опухоли может представлять собой клетку, выбранную из группы, состоящей из клетки рака молочной железы, клетки колоректального рака, клетки рака легкого (например, клетки немелкоклеточного рака легкого), клетки рака щитовидной железы, клетки множественной миеломы, клетки рака яичка, клетки папиллярной карциномы, клетки рака толстого кишечника, клетки рака поджелудочной железы, клетки рака яичника, клетки рака шейки матки, клетки злокачественной опухоли центральной нервной системы, клетки остеогенной саркомы, клетки карциномы почек, клетки печеночно-клеточной карциномы, клетки рака мочевого пузыря (например, клетки переходно-клеточной карциномы), клетки карциномы желудка, клетки плоскоклеточной карциномы головы и шеи, клетки меланомы, клетки лейкоза, клетки рака эндометрия и клетки аденомы ободочной кишки. В одном варианте осуществления клетка, на которую нацеливаются в способе по изобретению, является гиперпролиферативной и/или гиперпластической клеткой. В другом варианте осуществления клетка, на которую нацеливаются в способе по изобретению, является диспластической клеткой. В другом варианте осуществления клетка, на которую нацеливаются в способе по изобретению, является метастазирующей клеткой.

Способы по изобретению могут, кроме того, включать дополнительные стадии обработки. Например, в одном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию, где намеченную клетку и/или ткань (например, клетку злокачественной опухоли) подвергают обработке радиоактивным излучением или химиотерапевтическим средством.

Как описано в настоящем документе, активация Ron является важным биологическим процессом, нарушение регуляции которого приводит ко множеству патологических состояний. Соответственно, в одном варианте осуществления способов по изобретению клетка, на которую нацеливаются (например, клетка злокачественной опухоли), представляет собой клетку, в которой активация Ron усилена по сравнению с нормальной клеткой, происходящей из той же ткани. В одном варианте осуществления способ по изобретению вызывает гибель намеченной клетки. Например, контакт с антагонистом по изобретению может приводить к неспособности клетки передавать сигнал через путь передачи сигнала Ron.

Нарушение регуляции активации Ron (и таким образом, передачи сигнала) может приводить к ряду изменений клеток, включая, например, сверхэкспрессию MSP (родственного Ron лиганда) и/или самого Ron.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способ по изобретению включает нацеливание на клетку, где Ron или MSP, или оба, более сильно экспрессируются в указанной клетке (например, клетке злокачественной опухоли) по сравнению с нормальной клеткой, происходящей из той же ткани.

Нарушение активации про-MSP (и таким образом, активации Ron) может приводить к ряду изменений клеток, включая, например, сверхэкспрессию гепсина, про-MSP и/или Ron. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способ по изобретению включает нацеливание на клетку или ткань, когда гепсин, про-MSP и/или Ron, более сильно экспрессируется в указанной клетке или ткани (например, клетке или ткани злокачественной опухоли) по сравнению с нормальной соответствующей клеткой или тканью.

В одном аспекте изобретение относится к композициям, содержащим один или несколько антагонистов по изобретению и носитель. В одном варианте осуществления носитель является фармацевтически приемлемым.

В одном аспекте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим антагонист по изобретению. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота по изобретению кодирует антагонист, который представляет собой или содержит полипептид (например, олигопептид). В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота по изобретению кодирует антагонист, который представляет собой или содержит антитело или его фрагмент.

В одном аспекте изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту по изобретению.

В одном аспекте изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор по изобретению. Вектор может представлять собой вектор любого типа, например, рекомбинантный вектор, такой как экспрессирующий вектор. Можно использовать любые из множества клеток-хозяев. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, например, E. coli. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку млекопитающего, такую как клетка яичников китайского хомяка (CHO).

В одном аспекте изобретение относится к способам получения антагониста по изобретению. Например, изобретение относится к способу получения антагониста, который представляет собой или содержит антитело (или его фрагмент), где указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора по изобретению, содержащего последовательность, кодирующую указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела (или его фрагмента). В другом примере изобретение относится к способу получения антагониста, который представляет собой или содержит полипептид (такой как олигопептид), где указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора по изобретению, кодирующего указанный полипептид (такой как олигопептид), и выделение указанного полипептида (такого как олигопептид).

В одном аспекте изобретение относится к изделию, содержащему контейнер; и композицию, содержащуюся внутри контейнера, где композиция содержит один или несколько антагонистов по изобретению. В одном варианте осуществления композиция содержит нуклеиновую кислоту по изобретению. В одном варианте осуществления композиция, содержащая антагонист, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления изделие по изобретению дополнительно содержит инструкции для введения композиции (например, антагониста) субъекту.

В одном аспекте изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, содержащий композицию, содержащую один или несколько антагонистов по изобретению; и второй контейнер, содержащий буфер. В одном варианте осуществления буфер является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления композиция, содержащая антагонист, дополнительно содержит носитель, который в некоторых вариантах осуществления является фармацевтически приемлемым. В одном варианте осуществления набор дополнительно содержит инструкции для введения композиции (например, антагониста) субъекту.

В одном аспекте изобретение относится к композиции, содержащей очищенные про-MSP и гепсин. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит клетки, экспрессирующие Ron.

В одном аспекте изобретение относится к способам детекции про-MSP в образце, включающим (1) контакт образца с гепсином в условиях, позволяющих протеолитический процессинг MSP гепсином, и (2) детекцию присутствия активированного гепсином MSP.

В одном аспекте изобретение относится к способам детекции гепсина в образце, включающим (1) контакт образца с про-MSP в условиях, позволяющих протеолитический процессинг MSP гепсином, и (2) детекцию присутствия активированного гепсином MSP.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

ФИГУРА 1: Активация про-MSP гепсином in vitro. Рекомбинантный гепсин активировал про-MSP зависимым от дозы образом при инкубации в течение 1 часа при 37°C. Продукты разделяли в SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. N-концевое секвенирование полосы ~25 кДа (показано) указывало на то, что она представляла собой β-цепь, и таким образом, гепсин расщеплял про-MSP по связи Arg₄₈₃-Val₄₈₄. На фигуре 1 описан SEQ ID NO:17.

ФИГУРА 2: Активация про-MSP экспрессированным на поверхности клеток гепсином для клеток LnCap-34. Клетки LnCap-34 со стабильной сверхэкспрессией гепсина подвергали голоданию по сыворотке и обрабатывали ¹²⁵I-про-MSP отдельно или в сочетании с различными ингибиторами в течение 3 часов. Рекомбинантный гепсин (10 нМ) использовали в качестве положительного контроля. Значительное увеличение процессинга про-MSP наблюдали через 3 часа по сравнению с началом эксперимента. Ингибиторы KQLR (SEQ ID NO 10), KD1 и антитело против гепсина Fab25 эффективно блокировали активацию про-MSP.

ФИГУРА 3: Связывание активированного гепсином MSP с Ron. (a) Для эксперимента поверхностного плазмонного резонанса, чип CM5 с присоединенным по аминогруппе специфическим антителом против Fc использовали для иммобилизации Ron-Fc на биосенсоре. Не наблюдали поддающегося детекции связывания про-MSP (1 мкМ) с Ron, в то время как для активированного гепсином MSP показали высокую аффинность связывания (Κ_D 7 нМ) с Ron, где данные подходили под модель связывания 1:1. (b) В эксперименте ELISA для измерения связывания MSP с Ron, определенная эффективная концентрация для получения половины максимального связывания (EC₅₀) составляла 0,519 нМ.

ФИГУРА 4: Фосфорилирование S6- и MAP-киназы. Ни гепсин, ни про-MSP по отдельности не были эффективны для активации пути передачи сигнала Ron, в то время как для обработки про-MSP гепсином показали сильное фосфорилирование как MAP-киназы, так и S6-киназы зависимым от дозы образом.

ФИГУРА 5: Анализ изменения морфологии перитонеальных макрофагов. При стимуляции активированным гепсином MSP перитонеальные макрофаги подвергаются определенным изменениям формы клеток, проявляемых ветвлением и удлинением. Эффект активированного гепсином MSP являлся сравнимым с эффектом коммерчески доступного MSP, так же как активированного HGFA MSP.

ФИГУРА 6: Анализ хемотаксиса. Обработка про-MSP гепсином приводила к значимому увеличению (p<0,001) миграции перитонеальных макрофагов, и эффект являлся сравнимым с эффектом зрелого MSP из коммерческого источника. Для предварительной обработки ингибитором анти-гепсином (антителом против гепсина Fab25) показано заметное уменьшение миграции макрофагов.

ФИГУРА 7: Ингибирование синтеза оксида азота. Для первичных макрофагов костного мозга мыши показали сильную продукцию оксида азота в ответ на LPS. Активированный гепсином MSP значительно ослаблял продукцию NO в происходящих из костного мозга макрофагах. Эффект активированного гепсином MSP являлся сравнимым с эффектом коммерчески доступного MSP. Обработка про-MSP или про-MSP, смешанным с гепсином и антителом против гепсина Fab25, не ингибировала сильную продукцию оксида азота в ответ на LPS.

ФИГУРА 8: Один из вариантов осуществления аминокислотной последовательности природного гепсина человека (SEQ ID NO: 18).

ФИГУРА 9: (A) & (B) Другой вариант осуществления аминокислотной последовательности природного гепсина человека (SEQ ID NO: 19).

ФИГУРА 10: Один из вариантов осуществления аминокислотной последовательности природного стимулирующего макрофаги пробелка человека (про-MSP) (SEQ ID NO: 20).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам, композициям, наборам и изделиям, содержащим модуляторы пути передачи сигнала MSP/Ron, включая способы использования таких модуляторов.

Подробное описание этих способов, композиций, наборов и изделий представлено в настоящем документе.

Общие способы

В практике настоящего изобретения используют, если нет иных указаний, общепринятые способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, к