Терапевтическое средство от зуда

Терапевтическое средство от зуда

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Техническая область

Настоящее изобретение относится средствам для лечения или профилактики зуда.

Уровень техники

Многие цитокины известны в качестве гуморальных факторов, вовлеченных в рост и дифференцировку различных типов клеток, или в активацию функций дифференцированных зрелых клеток. Стимулированные цитокинами клетки продуцируют различные типы цитокинов, тем самым образуя в организме сети из множества цитокинов. Биологический гомеостаз поддерживается посредством тонкого равновесия взаимной регуляции цитокинов в этих сетях. Полагают, что многие воспалительные заболевания являются следствием нарушений в таких цитокиновых сетях. Таким образом, значительное внимание привлекает терапия на основе моноклональных антител. Например, было показано, что антитела против TNF и антитела против рецептора для IL-6 являются клинически высоко эффективными. С другой стороны, существует множество примеров неудач, когда отсутствуют терапевтические эффекты, если блокируют только один цитокин, такой как IL-4, вследствие активации компенсаторных каскадов при конкретных патологических состояниях.

Авторы настоящего изобретения добились успеха в выделении нового рецептора цитокинов NR10, который является высокогомологичным gp130, рецептору для передачи сигнала IL-6 (патентный документ 1). NR10 образует гетеродимер с рецептором онкостатина M (OSMR) и функционирует в качестве рецептора IL-31 (непатентный документ 1). NR-10 также известен как glm-r (непатентный документ 2), GPL (непатентный документ 3), IL-31RA (непатентный документ 4), и т.д. Также было описано, что у трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих IL-31, самопроизвольно развивается зудящий дерматит (непатентный документ 4).

Однако нельзя утверждать, что инициированная экспрессия цитокинов у мышей или высокая концентрация цитокинов в крови у мышей с патологией являются истинными причинами заболевания. Совершенно неясно, вызывает ли блокада антителом передачи сигнала терапевтический эффект. Например, у трансгенных мышей, у которых сверхэспрессирован IL-18 в кератиноцитах, развивается зудящий дерматит. В модели самопроизвольного атопического дерматита у мышей NC/Nga концентрация IL-18 в крови возрастает при прогрессировании патологического состояния. Из этих данных было предположено, что причиной заболевания является сверхэкспрессия IL-18. Однако в действительности введение нейтрализующего антитела не оказывало терапевтического действия (непатентный документ 5).

Таким образом, ингибирование функции цитокинов не обязательно вызывает терапевтический эффект при заболеваниях с повышенной экспрессией цитокинов. Таким образом, из уровня экспрессии цитокина трудно предсказать, на какое заболевание ингибирование цитокинов оказывает терапевтический эффект. Таким образом, важно идентифицировать заболевания, при которых ингибирование передачи сигнала цитокина-мишени в действительности оказывает терапевтическое действие.

Документы уровня техники для настоящего изобретения представлены ниже.

Патентный документ 1: WO00/75314.

Непатентный документ 1: IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis., J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb;117(2):418-25.

Непатентный документ 2: A novel type I cytokine receptor is expressed on monocytes, signals proliferation, and activates STAT-3 and STAT-5.J Biol Chem 277, 16831-6, 2002.

Непатентный документ 3: GPL, a novel cytokine receptor related to GP130 and leukemia inhibitory factor receptor. J Biol Chem 278, 49850-9, 2003.

Непатентный документ 4: Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol 5, 752-60, 2004.

Непатентный документ 5: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga., British Journal of Dermatology 149: 39-45, 2003.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблемы, решаемые изобретением

Ввиду обстоятельств, описанных выше, было выполнено настоящее изобретение. Задачей настоящего изобретения является предоставление средств для лечения или профилактики зуда.

Средства для решения проблем

Авторы настоящего изобретения провели специализированные исследования для выполнения задачи, описанной выше. Авторы настоящего изобретения открыли, что антагонисты NR10, такие как нейтрализующие антитела против NR10, пригодны в качестве терапевтических или профилактических средств от зуда, тем самым, выполнив настоящее изобретение.

Настоящее изобретение относится к средствам для лечения или профилактики зуда. Более конкретно, настоящее изобретение относится к:

[1] профилактическому или терапевтическому средству от зуда, которое содержит в качестве активного ингредиента антагонист NR10;

[2] профилактическому или терапевтическому средству согласно [1], где антагонист NR10 представляет собой антитело, обладающее нейтрализующей активностью против NR10;

[3] профилактическому или терапевтическому средству согласно [2], где антитело представляет собой моноклональное антитело;

[4] профилактическому или терапевтическому средству согласно [3], где антитело представляет собой моноклональное антитело, обладающее нейтрализующей активностью против NR10 человека;

[5] профилактическому или терапевтическому средству согласно любому из [2]-[4], где антитело представляет собой рекомбинантное антитело; и

[6] профилактическому или терапевтическому средству согласно любому из [2]-[5], где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлен график, на котором показана оценка индуцируемого IL-31 поведения расчесывания. Среднее значение ± стандартная ошибка.

На фиг. 2 представлен график, на котором показана оценка индуцированного антигеном клещей поведения расчесывания. Среднее значение ± стандартная ошибка.

На фиг. 3 представлен график, на котором показаны процентные изменения массы тела с течением времени в модели колита DSS на мышах.

На фиг. 4 представлен график, на котором показаны изменения толщины уха с течением времени в модели индуцированного пикрилхлоридом контактного дерматита.

На фиг. 5 представлен график, на котором показан эффект антитела против NR10 H0L0 в отношении супрессии зуда с использованием в качестве индикатора количества расчесываний.

Способ осуществления изобретения

NR10 представляет собой белок, который образует гетеродимер с рецептором онкостатина M (OSMR) и функционирует в качестве рецептора IL-31. NR10 также известен как glm-r (J Biol Chem 277 16831-6, 2002), GPL (J Biol Chem 278, 49850-9, 2003), IL31RA (Nat Immunol 5, 752-60, 2004), и т.п. Таким образом, NR10 в настоящем изобретении также включает белки, имеющие эти названия.

NR10 в настоящем изобретении включает NR10, происходящий из человека, мышей и других млекопитающих. Предпочтительный NR10 включает, но не ограничивается конкретно ими, NR10, происходящий из человека и мышей. Существует множество известных вариантов по сплайсингу происходящего из человека NR10 (WO 00/075314). Среди указанных выше вариантов по сплайсингу, NR10.1 состоит из 662 аминокислот и содержит трансмембранный домен. NR10.2 представляет собой растворимый подобный рецептору белок, состоящий из 252 аминокислот, без трансмембранного домена. При этом известные варианты по сплайсингу NR10, которые функционируют в качестве трансмембранных рецепторных белков, включают NR10.3 и IL-31RAv3. NR10 человека по настоящему изобретению конкретно не ограничен, при условии, что он образует гетеродимер с рецептором онкостатина M (OSMR) и функционирует в качестве рецептора IL-31. Предпочтительный NR10 включает NR10.3 (также называемый ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) и IL-31RAv3. NR 10.3 (IL31RAv4) состоит из 662 аминокислот (WO 00/075314; Nat Immunol 5, 752-60, 2004) и IL31RAv3 состоит из 732 аминокислот (регистрационный номер GenBank No: NM_139017). Аминокислотная последовательность IL31RAv4 представлена в SEQ ID NO: 6, и аминокислотная последовательность IL31RAv3 представлена в SEQ ID NO: 7. При этом происходящий из мыши NR10 включает белки, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

В настоящем изобретении термин антагонист NR10 относится к веществу, которое блокирует внутриклеточную передачу сигнала, опосредуемую активацией NR10, через связывание с NR10 и, таким образом, приводит к утрате или подавлению биологической активности клеток. Биологическая активность включает, но не ограничивается ими, например, активность индукции или подавления продукции биологически активного вещества (например, хемокинов, воспалительных цитокинов и т.д.), активность стимуляции или подавления секреции биологически активного вещества, активность роста, активность индукции роста, активность выживания, активность дифференцировки, активность индукции дифференцировки, транскрипционную активность, активность мембранного транспорта, активность связывания, протеолитическую активность, активность фосфорилирования/дефосфорилирования, активность окисления-восстановления, активность переноса, нуклеолитическую активность, активность дегидратации, активность индукции клеточной гибели и активность индукции апоптоза.

Наличие антагонистической активности можно определять способами, известными специалистам в данной области. Например, тестируемое соединение может контактировать с NR10, экспрессированным на клеточной поверхности, в присутствии лиганда для определения того, произойдет ли внутриклеточная передача сигнала, которая служит признаком активации NR10. Это определение можно проводить, например, способом, описанным в ссылке "Dillon SR, et al., Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol. 2004 Jul; 5(7):752-60". Соединения, которые ингибируют внутриклеточную передачу сигнала, отвечающую на стимуляцию лигандом, считают антагонистами NR10.

Антагонисты по настоящему изобретению могут представлять собой встречающиеся в природе или искусственные соединения. В настоящем изобретении можно использовать известные антагонисты. Можно использовать новые соединения, которые, как определено способами, описанными выше, обладают антагонистической активностью.

Один из вариантов осуществления антагониста NR10 по настоящему изобретению включает антитела, которые связываются с NR10. Такие антитела, которые связываются с NR10, конкретно не ограничены; однако предпочтительными являются антитела, которые специфично связываются с NR10. Предпочтительный вариант осуществления антител, которые связываются с NR10, включает антитела, обладающие нейтрализующей активностью против NR10. В настоящем изобретении "антитело, обладающее нейтрализующей активностью против NR10," относится к антителу, обладающему активностью подавления биологической активности, основанной на NR10. В настоящем изобретении "антитела, обладающие нейтрализующей активностью против NR10," могут представлять собой поликлональные или моноклональные антитела; однако в предпочтительном варианте осуществления антитела представляют собой моноклональные антитела.

Антитела по настоящему изобретению конкретно не ограничены, при условии, что они связываются с NR10, и они включают рекомбинантные антитела, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека. Химерные антитела содержат, например, константные области тяжелой и легкой цепи антитела человека и вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела не являющегося человеком млекопитающего, такого как мышь. Химерные антитела можно получать известными способами. Например, антитела можно получать клонированием гена антитела из гибридомы, встраиванием его в соответствующий вектор и введением этой конструкции в хозяев (см., например, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Конкретно, синтезируют кДНК вариабельных областей (V-областей) антитела из мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После получения ДНК, кодирующих V-области представляющего интерес антитела, их связывают с ДНК, кодирующими константные области (C-области) требуемого антитела человека. Полученные конструкции встраивают в экспрессирующие векторы. Альтернативно ДНК, кодирующие V-области антитела, можно встраивать в экспрессирующие векторы, содержащие ДНК, кодирующие C-области антитела человека. ДНК встраивают в экспрессирующие векторы, так чтобы они экспрессировались под регуляцией участков регуляции экспрессии, например, энхансеров и промоторов. На следующей стадии клетки-хозяева можно трансформировать экспрессирующими векторами для обеспечения экспрессии химерного антитела.

Гуманизированные антитела также называют переформированными антителами человека, и их получают переносом определяющих комплементарность областей (CDR) антитела, происходящего из не являющегося человеком млекопитающего, такого как мышь, в CDR антитела человека. Также для их получения известны общие способы генетической рекомбинации. Конкретно, синтезируют последовательность ДНК, сконструированную так, чтобы CDR антитела мыши были связаны с каркасными областями (FR) антитела человека, с помощью ПЦР с использованием в качестве праймеров нескольких олигонуклеотидов, которые имеют участки, охватывающие концы как CDR, так и FR. Затем полученную ДНК лигируют с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, встраивают в экспрессирующий вектор и вводят хозяину для продукции антитела (см. публикацию патентной заявки Европы № EP 239400 и публикацию международной патентной заявки № WO 96/02576). FR, подлежащие связыванию с CDR, выбирают таким образом, чтобы CDR образовывали подходящий антигенсвязывающий участок. Если необходимо, в каркасные области вариабельной области антитела можно вносить аминокислотную замену, делецию, добавление и/или вставку, так чтобы CDR переформированного антитела человека образовывали надлежащий антигенсвязывающий участок (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Способы получения антител человека также известны. Например, желаемые антитела человека с антигенсвязывающей активностью можно получать путем (1) сенсибилизации лимфоцитов человека представляющими интерес антигенами или клетками, экспрессирующими представляющие интерес антигены in vitro; и (2) слияния сенсибилизированных лимфоцитов с клетками миеломы человека, такими как U266 (см. публикацию японской патентной заявки Kokoku No. (JP-B) H01-59878 (рассмотренная, принятая японская патентная заявка, опубликованная для опротестования)). Альтернативно, желаемое антитело человека также можно получать иммунизацией трансгенного животного, имеющего полный набор генов антител человека, требуемым антигеном (см. публикации международных патентных заявок №№ WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Более того, известны способы получения антител человека сортировкой фаговых библиотек антител человека. Например, с использованием способа фагового дисплея вариабельную область антитела человека экспрессируют в качестве одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фага, и можно отбирать фаги, которые связываются с антигеном. Посредством анализа генов выбранных фагов можно определять последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области антител человека, которые связываются с антигеном. Если идентифицируют последовательности ДНК scFv, которые связываются с антигеном, можно конструировать соответствующие экспрессирующие векторы, содержащие эти последовательности, с получением антител человека. Такие способы хорошо известны. В качестве ссылки могут быть приведены WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388 и т.п.

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой или легкой цепи может иметь замену, делецию, добавление и/или вставку одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, у которого была подтверждена нейтрализующая активность против NR10. Хорошо известные специалистам в данной области способы получения аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, обладающего активностью нейтрализации NR10, в которой одна или несколько аминокислот заменены, удалены, добавлены и/или вставлены в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи, включают способы внесения мутаций в белки. Например, специалисты в данной области могут получить мутанты, функционально эквивалентные вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, обладающего активностью нейтрализации NR10, путем внесения соответствующих мутаций в аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, обладающего активностью нейтрализации NR10, с использованием сайт-направленного мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, и Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, и Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492) или сходные с ними. Таким образом, также к вариабельным областям тяжелых или легких цепей антитела по настоящему изобретению относятся вариабельные области тяжелых или легких цепей антитела, которые содержат одну или несколько аминокислотных мутаций в вариабельных областях тяжелых или легких цепей и обладают активностью нейтрализации NR10.

Когда заменяют аминокислотный остаток, предпочтительно проводят мутацию аминокислоты в отличающуюся аминокислоту(ы), которая сохраняет свойства боковой цепи аминокислоты. Примерами свойств боковой цепи аминокислот являются: гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y и V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S и T), аминокислоты, содержащие алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I и P), аминокислоты, имеющие содержащие гидроксильную группу боковые цепи (S, T и Y), аминокислоты, имеющие содержащие серу боковые цепи (C и M), аминокислоты, имеющие содержащие карбоновую кислоту и амид боковые цепи (D, N, E и Q), аминокислоты, содержащие основные боковые цепи (R, K и H), и аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи (H, F, Y и W) (аминокислоты представлены в скобках с помощью однобуквенного кода). Аминокислотные замены в пределах каждой группы называют консервативными заменами. Хорошо известно, что полипептид, содержащий модифицированную аминокислотную последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков данной аминокислотной последовательности удалены, добавлены и/или заменены другими аминокислотами, может сохранять исходную биологическую активность (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1984) 81:5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-500; Wang, A. et al., Science (1984) 224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409-13). Такие мутанты обладают идентичностью аминокислот по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, с вариабельными областями тяжелых и легких цепей до мутаций аминокислот. В настоящем документе идентичность последовательности определяют как процент остатков, идентичных остаткам в исходной аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, определенный после выравнивания последовательностей и внесения соответствующим образом пропусков для максимального увеличения идентичности последовательности, при необходимости. Идентичность аминокислотных последовательностей можно определять способом, описанным выше.

Альтернативно аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой или легкой цепи, которые имеют замену, делецию, добавление и/или вставку одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности вариабельных областей тяжелой или легкой цепи и сохраняют нейтрализующую активность против NR10, можно получать из нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельных областей тяжелой или легкой цепи. Строгие условия гибридизации для выделения нуклеиновой кислоты, гибридизующейся в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельных областей тяжелой или легкой цепи, включают, например, условия 6M мочевины, 0,4% SDS, 0,5x SSC, и 37°C, или условия гибридизации со строгостью, эквивалентной этой. При более строгих условиях, например, условиях 6M мочевины, 0,4% SDS, 0,1x SSC и 42°C, можно ожидать выделения нуклеиновых кислот со значительно более высокой гомологией. Последовательности выделенных нуклеиновых кислот можно определять известными способами, описанными ниже. Общая гомология нуклеотидной последовательности выделенной нуклеиновой кислоты представляет собой по меньшей мере 50% идентичность последовательности или более, предпочтительно 70% или более, более предпочтительно 90% или более (например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более).

Нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельных областей тяжелой или легкой цепи, также можно выделять с использованием, вместо описанных выше способов с использованием технологий гибридизации, способов амплификации генов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием праймеров, синтезированных на основе информации нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельных областей тяжелой или легкой цепи.

Конкретно, идентичность одной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности с другой последовательностью можно определять с использованием алгоритма BLAST, Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5873-7). На основе этого алгоритма были разработаны программы, такие как BLASTN и BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). Для анализа нуклеотидных последовательностей согласно BLASTN на основе BLAST, параметры устанавливают, например, как score = 100 и wordlength = 12. С другой стороны, параметры, используемые для анализа аминокислотных последовательностей с помощью BLASTX на основе BLAST, включают, например, score= 50 и wordlength= 3. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST используют параметры по умолчанию для каждой программы. Конкретные способы для таких анализов известны в данной области (см. web-сайт National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Альтернативно антитела по настоящему изобретению могут представлять собой низкомолекулярные антитела. Низкомолекулярные антитела по настоящему изобретению включают фрагменты антител, лишенные некоторых частей целого антитела (например, целого IgG), и они конкретно не ограничены, при условии, что они сохраняют активность нейтрализации NR10. Низкомолекулярные антитела по настоящему изобретению конкретно не ограничены, при условии, что они содержат часть целых антител. Низкомолекулярные антитела предпочтительно содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) или вариабельную область легкой цепи (VL). Особенно предпочтительные низкомолекулярные антитела содержат как VH, так и VL. Кроме того, предпочтительные примеры низкомолекулярных антител по настоящему изобретению включают низкомолекулярные антитела, содержащие CDR антитела. CDR, содержащиеся в низкомолекулярных антителах, могут включать некоторые или все из шести CDR антитела.

Низкомолекулярные антитела по настоящему изобретению предпочтительно имеют меньшую молекулярную массу, чем целые антитела. Однако низкомолекулярные антитела могут образовывать мультимеры, например димеры, тримеры или тетрамеры, и, таким образом, их молекулярная масса может превышать молекулярную массу целых антител.

Пример низкомолекулярных антител по настоящему изобретению включает антитела ScFv. Антитела ScFv представляют собой одноцепочечные полипептиды, полученные связыванием вариабельной области тяжелой цепи ([VH]) и вариабельной области легкой цепи ([VL]) через линкер, или сходные с ним (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, eds., Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp. 269-315, (1994)). Порядок связывания вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, подлежащих связыванию, конкретно не ограничен, и они могут быть расположены в любом порядке. Примеры расположения приведены ниже.

[VH] линкер [VL]

[VL] линкер [VH]

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи может содержать замену, делецию, добавление и/или вставку. Более того, вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи также могут быть лишены некоторых частей или в них могут быть добавлены другие полипептиды, при условии, что они обладают активностью связывать антиген при связывании вместе. Альтернативно вариабельные области могут быть химеризованными или гуманизированными.

В настоящем изобретении линкеры, которые связывают вариабельные области антитела, включают произвольные пептидные линкеры, которые можно встраивать с использованием способов генетической инженерии, или синтетические линкеры, такие как линкеры, описанные в Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996.

Предпочтительными линкерами в настоящем изобретении являются пептидные линкеры. Длина пептидных линкеров конкретно не ограничена, и специалисты в данной области могут соответствующим образом выбрать длину, в зависимости от цели. Типичная длина составляет от одной до 100 аминокислот, предпочтительно от 3 до 50 аминокислот, более предпочтительно от 5 до 30 аминокислот, и особенно предпочтительно от 12 до 18 аминокислот (например, 15 аминокислот).

Аминокислотные последовательности таких пептидных линкеров включают, например:

Ser;

Gly-Ser;

Gly-Gly-Ser;

Ser-Gly-Gly;

Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 8);

Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 9);

Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 10);

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 11);

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 12);

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 13;

Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 14);

Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 15);

(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 10))n; и

(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 11))n,

Синтетические химические линкеры (химические поперечно-сшивающие агенты) включают поперечно-сшивающие агенты, которые обычно используют для поперечного сшивания пептидов, например, N-гидроксисукцинимид (NHS), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS³), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP), дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), этиленгликоль-бис (сукцинимидилсукцинат) (EGS), этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинат) (сульфо-EGS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), бис[2-(сукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES) и бис[2-(сульфосукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (сульфо-BSOCOES). Эти поперечно-сшивающие агенты являются коммерчески доступными.

Антитела по настоящему изобретению включают антитела, в которых к аминокислотной последовательности антитела по настоящему изобретению добавлены два или более аминокислотных остатков. Кроме того, к настоящему изобретению относятся слитые белки, которые получены слиянием одного из описанных выше антител и второго пептида или белка. Эти слитые белки можно получать лигированием полинуклеотида, кодирующего антитело по настоящему изобретению, и полинуклеотида, кодирующего второй пептид или полипептид, в рамке считывания, встраиванием его в экспрессирующий вектор, и экспрессией слитой конструкции в хозяине. Для этой цели доступны некоторые способы, известные специалистам в данной области. Пептид- или полипептид-партнер, слитый с антителом по настоящему изобретению, может представлять собой известный пептид, например, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6x His, состоящий из шести остатков His (гистидина), 10x His, гемагглютинин вируса гриппа (HA), фрагмент c-myc человека, фрагмент VSV-GP, фрагмент p18HIV, T7-метку, HSV-метку, E-метку, фрагмент T-антигена SV40, lck-метку, фрагмент α-тубулина, B-метку и фрагмент белка C. Другие полипептиды-партнеры, подлежащие слиянию с антителами по настоящему изобретению, включают, например, GST (глутатион-S-трансферазу), HA (гемагглютинин вируса гриппа), константную область иммуноглобулина, β-галактозидазу и MBP (связывающий мальтозу белок). Полинуклеотид, кодирующий один из этих коммерчески доступных пептидов или полипептидов, можно подвергать слиянию с полинуклеотидом, кодирующим антитело по настоящему изобретению. Слитный полипептид можно получать путем экспрессии слитой конструкции.

Более того, антитела по настоящему изобретению могут представлять собой конъюгированные антитела, которые связаны с любыми из различных молекул, включающих полиэтиленгликоль (PEG), гиалуроновую кислоту, радиоактивные вещества, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, ферменты и токсины. Такие конъюгированные антитела можно получать путем химической модификации полученных антител. Способы модификации антител являются общепризнанными в данной области (например, US 5057313 и US 5156840). "Антитела" по настоящему изобретению также включают такие конъюгированные антитела.

Кроме того, предпочтительный вариант осуществления антител против NR10 в настоящем изобретении включает, но не ограничивается конкретно ими, антитела, которые распознают домен 1. В настоящем изобретении домен 1 относится к участку из аминокислот в положениях от 21 до 120 (от LPAKP до LENIA) в аминокислотной последовательности NR10 человека SEQ ID NO: 7, где нумерация аминокислот основана на последовательности, включающей сигнальный пептид.

Антитела по настоящему изобретению могут отличаться по аминокислотной последовательности, молекулярной массе, изоэлектрической точке, наличию/отсутствию цепей сахаров и конформации, в зависимости от клетки или хозяина, продуцирующих антитело, или способа очистки, как описано ниже. Однако полученное антитело относится к настоящему изобретению, при условии, что оно обладает функцией антагониста NR10. Например, когда антитело по настоящему изобретению экспрессируется в прокариотических клетках, например E. coli, на N-конец исходной аминокислотной последовательность антитела добавляют остаток метионина. Такие антитела относятся к настоящему изобретению.

Моноклональные антитела, обладающие нейтрализующей активностью против NR10, можно получать, например, следующим способом: моноклональные антитела против NR10 получают с использованием в качестве антигена NR10 или его фрагмента, происходящих из млекопитающего, такого как человек или мышь, известными способами, а затем из полученных таким образом моноклональных антител против NR10 отбирают антитела, обладающие нейтрализующей активностью против NR10. В частности, для иммунизации в соответствии с общепринятыми способами иммунизации в качестве сенсибилизирующего антигена используют желаемый антиген или клетки, экспрессирующие желаемый антиген. Моноклональные антитела против NR10 можно получать путем слияния полученных иммунных клеток с известными исходными клетками с использованием общепринятых способов слияния клеток, и скрининга их в отношении продуцирующих моноклональное антитело клеток (гибридом) общепринятыми способами скрининга. Животные, подлежащие иммунизации, включают, например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, овцы, обезьяны, козы, ослы, коровы, лошади и свиньи. Антиген можно получать с использованием известной последовательности гена NR10 в соответствии с известными способами, например, способами с использованием бакуловируса (например, WO 98/46777).

Гибридомы можно получать, например, в соответствии со способом Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) или сходными с ним. Когда иммуногенность антигена является низкой, иммунизацию можно проводить после связывания антигена с макромолекулой, обладающей иммуногенностью, такой как альбумин.

Варианты антител по настоящему изобретению, которые обладают активностью нейтрализации NR10, включают моноклональные антитела, которые обладают активностью нейтрализации NR10 человека. Антигены, используемые для получения моноклональных антител, которые обладают активностью нейтрализации NR10 человека, конкретно не ограничены, при условии, что они обеспечивают получение антител, которые обладают активностью нейтрализации NR10 человека. Например, известно, что существует ряд вариантов NR10 человека, и в качестве иммуногена можно использовать любой вариант, при условии, что он обеспечивает получение антител, которые обладают активностью нейтрализации NR10 человека. Альтернативно, в тех же условиях, в качестве иммуногена можно использовать пептидный фрагмент NR10 или белок, в котором в природную последовательность NR10 внесены искусственные мутации. NR10.3 человека является одним из предпочтительных иммуногенов для получения антител, которые обладают активностью связывания и/или нейтрализации NR10, по настоящему изобретению.

Более того, активность нейтрализации антитела против NR10 можно измерять, например, путем выявления эффекта подавления роста IL-31-зависимой клеточной линии, как описано в справочных примерах.

При этом моноклональные антитела также можно получать путем иммунизации посредством ДНК. Иммунизация посредством ДНК представляет собой способ, в котором векторную ДНК, сконструированную так, чтобы ген, кодирующий антигенный белок, мог экспрессироваться у животного, подлежащего иммунизации, вводят животному, и в организме животного экспрессируется иммуноген, обеспечивая стимуляцию иммунной системы. По сравнению с общепринятыми способами иммунизации на основе введения белковых антигенов, ожидается, что иммунизация посредством ДНК является преимущественной в том, что:

- она обеспечивает стимуляцию иммунной системы при сохранении структуры мембранного белка; и

- не требуется очистка иммуногена.

С другой стороны, трудно комбинировать иммунизацию посредством ДНК со средством для стимуляции иммунной системы, таким как адъювант.

Для получения моноклонального антитела посредством иммунизации ДНК, животному, подлежащему иммунизации, сначала вводят ДНК, кодирующую NR10. ДНК, кодирующую NR10, можно синтезировать известными способами, такими как ПЦР. Полученную ДНК встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор и вводят животному, подлежащему иммунизации. Экспрессирующие векторы, которые можно использовать, включают коммерчески доступные экспрессирующие векторы, такие как pcDNA3.1. Вектор можно вводить в живой организм общепринятыми способами. Например, иммунизацию ДНК можно проводить путем введения золотых частиц, покрытых экспрессирующим вектором, в клетки с помощью генной пушки. Вспомогательное введение с использованием экспрессирующих NR10 клеток после иммунизации ДНК представляет собой предпочтительный способ получения моноклонального антитела.

После иммунизации млекопитающего, как описано выше, и подтверждения повышения уровня желаемого антитела в сыворотке, собирают иммунные клетки млекопитающего и подвергают их слиянию. Предпочтительными иммунными клетками, в частности, являются клетки селезенки.

Для слияния с указанными выше клетками иммунной системы используют миеломные клетки млекопитающих. Предпочтительно, чтобы миеломные клетки имели соответствующие селективные маркеры для скрининга. Селективный маркер относится к фенотипу, который позволяет (или не позволяет) выживание в конкретных условиях культивирования. Известные селективные маркеры включают дефицит гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (в дальнейшем в настоящем документе сокращаемый как "дефицит HGPRT") и дефицит тимидинкиназы (в дальнейшем в настоящем документе сокращаемый как "дефицит TK"). Дефицитные по HGPRT или TK клетки проявляют чувствительность к гипоксантин-аминоптерин-тимидину (в дальнейшем в настоящем документе обозначаемую как "чувствительность к HAT"). В селективной среде HAT, чувствительные к HAT клетки не могут синтезировать ДНК и, таким образом, погибают. Однако при слиянии с нормальными клетками они могут продолжать синтезировать ДНК через каскад спасения нормальных клеток и, таким образом, могут расти даже в селективной среде HAT.

Дефицитные по HGPRT или TK клетки можно отбирать с использованием среды, содержащей 6-тиогуанин, 8-азагуанин (в дальнейшем в настоящем документе сокращаемый как "8AG") или 5'-бромдезоксиуридин. В то время как нормальные клетки погибают вследствие в