Мутантные о-фосфосеринсульфгидрилазы и способ получения цистеина с их применением

Мутантные о-фосфосеринсульфгидрилазы и способ получения цистеина с их применением

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к мутантной O-фосфосеринсульфгидрилазе (также обозначаемой как «OPSS»), которая имеет аминокислотную последовательность, происходящую от Mycobacterium smegmatis, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 1, в которой осуществлены делеции от трех до семи C-концевых аминокислотных остатков. Настоящее изобретение относится также к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантную OPSS, экспрессионному вектору, несущему молекулу нуклеиновой кислоты, и к трансформанту, трансформированному экспрессионным вектором. Кроме того, настоящее изобретение касается способа получения цистеина в результате взаимодействия O-фосфо-L-серина (OPS) с сульфидом в присутствии мутантной OPSS.

Известный уровень техники

L-цистеин представляет собой аминокислоту, которая играет важную роль в метаболизме серы у всех живых организмов. Он используется в биосинтезе белков, таких как кератин волос, глутатиона, биотина, метионина и других содержащих серу метаболитов, а также служит в качестве предшественника коэнзима A. Кроме того, как известно, биосинтез цистеина тесно связан с биосинтезом других аминокислот, включая L-серин, L-глицин и L-метионин. L-цистеин, и его производные находят применение в различных отраслях промышленности, включая фармацевтическую промышленность (для лечения бронхиальных заболеваний), косметическую промышленность (в шампунях для волос, составах для перманентной завивки и т.д.) и пищевую промышленность (для антиоксидантов, усилителей вкуса, в качестве вспомогательного агента при приготовлении теста и т.д.).

Традиционно L-цистеин получали промышленным способом с помощью кислотного гидролиза волос человека или перьев животных (Biotechnology of the Amino Acids Production под редакцией Ko Aida, p 217-223, 1986). Однако получение цистеина из волос или перьев не только приводило к такому низкому выходу, как 7-8%, но также из-за использования хлористоводородной кислоты или серной кислоты возникало большое количество отходов, что приводило к загрязнению окружающей среды. Кроме того, экстракция из волос или перьев может индуцировать у пользователя сильные неблагоприятные эффекты. Эти проблемы дали толчок к развитию способов получения L-цистеина, благоприятных для окружающей среды, которые привели к ферментации с использованием микроорганизмов для получения L-цистеина.

Среди вариантов микробной продукции L-цистеина примером является биологическое превращение D,L-ATC с использованием микроорганизма (Ryu OH, Ju JY and Shin CS, Process Biochem., 32:201-209, 1997). Этот способ превращения является, однако, трудным для применения в промышленном масштабе из-за низкой растворимости предшественника D,L-ATC. Другой способ получения L-цистеина представляет собой прямую ферментацию с использованием E. coli (патент No. EP 0885962B; Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). Избыточная аккумуляция L-цистеина в микроорганизмах вызывает внутриклеточную токсичность, создавая ограничение для получения L-цистеина в высокой концентрации. Для преодоления этого препятствия применяли белки, экспортирующие L-цистеин, однако при этом не выявлено существенных улучшений продуктивности.

Относительно пути биосинтеза L-цистеина в бактериях и растениях, O-ацетилсерин (OAS) выполняет функцию промежуточного продукта предшественника, создавая углеродный каркас L-цистеина (Kredich NM and Tomkins GM, J. Biol. Chem., 241: 4955-4965, 1966). Фермент O-ацетилсеринсульфгидрилаза (OASS), используя сульфид водорода в качестве донора серы, катализирует превращение O-ацетилсерина в S-ацетилсерин и, наконец, в цистеин, высвобождая ацетат. Альтернативно, SO₄ может быть восстановлен до тиосульфата для использования в качестве донора серы при получении цистеина (Nakamura T, Kon Y, Iwahashi H and Eguchi Y, J. Bacteriol., 156: 656-662, 1983). В пути биосинтеза цистеина через OAS используются два фермента - серинацетилтрансфераза (CysE), которая катализирует превращение серина в OAS, и цистеинсинтаза (CysK), которая катализирует превращение OAS в цистеин. Следует отметить, что среди них серинацетилтрансфераза (CysE) высоко чувствительна к ингибированию конечным продуктом цистеином по механизму обратной связи (Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006). Следовательно, существует потребность в измененном ферменте, который не чувствителен к ингибированию по механизму обратной связи, однако, его трудно создать.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Следуя настоящему изобретению, изобретателями настоящего изобретения проведено интенсивное и исчерпывающее исследование продукции L-цистеина с высоким выходом с целью преодоления проблем, с которыми сталкивались на предшествующем уровне техники, что привело к обнаружению того, что в Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis и Trichomonas vaginalis существует O-фосфосеринсульфгидрилаза (OPSS), которая использует O-фосфо-L-серин(OPS)-специфичный путь, а не OAS-специфичный путь, для синтеза L-цистеина (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW and Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006), и что OPSS из M. tuberculoses, которая катализирует превращение OPS в цистеин с дополнительными ферментами mec+ и cysO, может использовать Na₂S в качестве донора серы при превращении OPS в цистеин даже в отсутствие дополнительных ферментов, когда из нее удаляется пять C-концевых аминокислотных остатков (Argen D, Schnell R and Schneider G, FEBS letters, 583: 330-336, 2009).

Техническое решение

Следовательно, целью настоящего изобретения является предоставление мутантной O-фосфосеринсульфгидрилазы (обозначаемой также как «OPSS»), которая имеет аминокислотную последовательность, происходящую от Mycobacterium smegmatis, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 1, в которой осуществлены делеции от трех до семи C-концевых аминокислотных остатков.

Дугой целью настоящего изобретения является предоставление молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантную OPSS.

Дополнительной целью настоящего изобретения является предоставление экспрессионного вектора, несущего молекулу нуклеиновой кислоты.

Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление трансформанта, трансформированного экспрессионным вектором.

Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление способа превращения O-фосфо-L-серина в цистеин при взаимодействии с сульфидом в присутствии мутантной OPSS.

Эффективные результаты изобретения

Как описано выше, мутантная OPSS с улучшенной ферментативной активностью, которая существенна для ферментативного превращения O-фосфосерина в L-цистеин, может быть использована для получения L-цистеина из OPS в широком масштабе и с высоким выходом с использованием простого способа.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 представляет собой график, демонстрирующий активность OPSS при различной температуре.

Фиг. 2 представляет собой панель графиков, демонстрирующих чувствительность OPSS к рН.

Фиг. 3 представляет собой фотографию, демонстрирующую уровень экспрессии фермента в системе pET и системе pCL-Pcj1 при анализе с помощью SDS-ПААГ.

Фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий ферментативную активность OPSS при превращении очищенного из ферментационного бульона OPS в цистеин.

Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий ферментативную активность OPSS при превращении OPS ферментационного бульона в цистеин.

Фиг. 6 представляет собой график, демонстрирующий продукцию OPS и цистеина, который получен под действием OPSS, использующей в качестве субстрата OPS, в масштабе 1 л сосуда.

Фиг. 7 представляет собой схематическое изображение карты экспрессионного вектора pCL-Pcj1, несущего ген, кодирующий мутантную OPSS.

Лучший способ осуществления изобретения

В соответствии с одним его аспектом в настоящем изобретении предлагается мутантная OPSS из Mycobacterium smegmatis с той же аминокислотной последовательностью, что и SEQ ID NO: 1 за исключением отсутствия от 3 до 7 C-концевых аминокислотных остатков аминокислотной последовательности O-фосфосеринсульфгидрилазы дикого типа.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения мутантная OPSS по настоящему изобретению может иметь аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, 3 и 4. Мутантная OPSS, имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, может быть дополнительно модифицирована с заменой остатка пролина (Pro) в положении 77 остатком серина (Ser). Кроме того, мутантная OPSS, имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, может быть дополнительно модифицирована с заменой остатка треонина (Thr) в положении 131 остатком аланина (Ala), остатка лизина (Lys) в положении 137 остатком аспарагина (Asp) и остатка треонина (Thr) в положении 238 остатком серина (Ser). Кроме того, аминокислотные последовательности, которые гомологичны, по меньшей мере, на 50%, предпочтительно на 60%, 70%, 75% и 80%, более предпочтительно на 85%, 90% и 95% и наиболее предпочтительно на от 97% до 99% указанных выше мутантов, попадают в объем настоящего изобретения.

Термин «Mycobacterium smegmatics» обозначает штамм в форме бацилл типа Actinobacteria, которые являются тонкими, прямыми или слегка изогнутыми, имеют нерегулярное ветвление и могут быть окрашены основным красителем анилином. В настоящем изобретении было обнаружено, что когда ее аминокислотная последовательность модифицирована, O-фосфосеринсульфгидрилаза из этого штамма может катализировать биосинтез L-цистеина с повышенным выходом.

Используемый в настоящем описании термин «O-фосфосеринсульфгидрилаза (OPSS)» обозначает фермент, который катализирует превращение OPS в цистеин. Фермент был впервые обнаружен в Aeropyrum pernix и так назван (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003, SEQ ID NO: 6).

Различные хорошо известные методы могут быть использованы для получения OPSS. Иллюстративные примеры методов включают, но не ограничиваются этим, методы генного синтеза на основе оптимизации кодонов, с помощью которых представляющие интерес ферменты могут быть получены с высоким выходом, и методы скрининга пригодных источников фермента с помощью биоинформатики, основанные на анализе массивов сохраненной генетической информации о микроорганизмах. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферменты OPSS, которые используют OPS в качестве субстрата для синтеза цистеина, были отобраны из различных микробов. В этом случае осадки клеток, полученные с использованием подходящей среды и культуральных условий, известных на данном уровне техники, (лизировали) с последующей очисткой супернатанта, содержащего фермент, с получением фермента OPSS.

Используемый в настоящем описании термин «мутантный» обозначает культуру или индивидуум, которые проявляют наследуемое или ненаследуемое стабильное изменение фенотипа. При использовании в отношении OPSS (O-фосфосеринсульфгидрилазы) термин «мутантный» предназначен для обозначения фермента OPSS, который генетически изменен так, что его активность может быть эффективно улучшена по сравнению с ферментом дикого типа.

На основе сообщения о том, что мутантные OPSS из Mycobacterium tuberculosis H37Rv с делецией пяти C-концевых аминокислотных остатков проявляют повышенное сродство к источнику серы, содержащему группу S^2-, даже в отсутствие дополнительных ферментов, была получена мутантная OPSS с помощью делеции пяти C-концевых аминокислотных остатков из OPSS Mycobacterium smegmatics. Мутантная OPSS по настоящему изобретению может иметь аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 1 OPSS из Mycobacterium smegmatis с делецией у нее от трех до семи, предпочтительно пяти C-концевых аминокислотных остатков.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения мутант, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, как обнаружено, характеризовался степенью превращения 100% в пределах одного часа после его применения для превращения OPS в цистеин (таблица 5).

Замена аминокислот может дополнительно повышать ферментативную активность мутантной OPSS по настоящему изобретению. До тех пор, пока он хорошо известен в данной области техники, любой метод может быть использован для улучшения активности фермента. В настоящем изобретении предпочтительно применяли случайный мутагенез для осуществления улучшения ферментативной активности мутантной OPSS. Подробнее, после подвергания OPSS случайному мутагенезу отбирали мутантов с улучшенной ферментативной активностью с использованием системы скрининга на основе HTS (скрининга с высокой производительностью), разработанной изобретателями настоящего изобретения. В результате с помощью проведения HTS скрининга гена Msm-T получены мутантные OPSS, Msm-T-HA2 и Msm-T-EP3, которые обладали улучшенной ферментативной активностью. Msm-T-HA2 представляет собой мутантную OPSS, которая имеет ту же самую аминокислотную последовательность что и SEQ ID NO: 2, за исключением того, что остаток (Pro) в положении 77 заменен остатком серина (Ser). Msm-T-EP3 представляет собой мутантную OPSS, которая имеет тот же самый аминокислотный остаток, что и SEQ ID NO: 2, за исключением того, что в мутанте существуют замены остатка аланина (Ala) на остаток треонина (Thr) в положении 131, остатка аспарагина (Asp) на остаток лизина (Lys) в положении 137, и остатка серина (Ser) на остаток треонина (Thr) в положении 238. Предпочтительно мутантные OPSS Msm-T-HA2 и Msm-T-EP3 имеют аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения как Msm-T-HA2 так и Msm-T-EP3, как обнаружено, проявляли более высокую ферментативную активность, чем Msm-T, имеющая аминокислотный остаток SEQ ID NO: 2 (таблицы 5 и 6). Более конкретно, мутантные OPSS Msm-T-HA2 и Msm-T-EP3 при измерении проявляли 5-кратное и 1,2-кратное увеличение степеней превращения на ранней стадии реакции превращения по сравнению с контрольной Msm-T. Кроме того, даже когда мутантную Msm-T-HA2, у которой активность в отношении синтеза цистеина в 4 раза выше, чем у фермента Msm-T, использовали в количестве, соответствующем 40% Msm-T, конечная степень превращения в цистеин была сходной.

При применении в настоящем описании термин «гомология» предназначен для обозначения процента идентичности между двумя полипептидами. Соответствие между одной и другой последовательностью может быть определено с помощью методов, известных в данной области техники. Например, гомология может быть определена путем прямого сравнения информации о последовательностях двух полипептидных молекул с помощью выравнивания последовательностей методами информатики и использования легкодоступных компьютерных программ. Альтернативно, гомология может быть определена путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, при которых образуются стабильные дуплексы между гомологичными областями, с последующим гидролизом нуклеазой, специфичной для одной цепи, и определения размеров гидролизованных фрагментов.

При применении в настоящем описании термин «гомологичный» во всех его грамматических формах и вариантах написания относится к взаимоотношению между белками, которые обладают «общим эволюционным происхождением», включая белки надсемейств (например, надсемейства иммуноглобулинов), и к гомологичным белкам различных видов (например, к легкой цепи миозина и т.д.). Такие белки (и кодирующие их гены) обладают гомологией последовательностей, что отражается в сходстве их последовательностей. Однако при обычном использовании и в текущей заявке термин «гомологичный» при применении с таким наречием как «высоко», может относиться к сходству последовательностей и может относиться, или может не относиться к общему эволюционному происхождению.

При применении в настоящем описании термин «сходство последовательностей» во всех его грамматических формах относится к степени идентичности или соответствия между последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислотными последовательностями белков, которые могут иметь или могут не иметь общее эволюционное происхождение. В конкретном варианте осуществления две аминокислотные последовательности являются «по существу гомологичными» или «по существу сходными», когда, по меньшей мере, 21% (предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 50% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 75%, 90%, 95%, 96%, 97% или 99%) аминокислот совпадают на протяжении определенной длины аминокислотных последовательностей. Последовательности, которые по существу гомологичны, могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей с использованием стандартных компьютерных программ и доступных баз данных последовательностей или с помощью эксперимента с гибридизацией по Саузерну, например, в жестких условиях, как определяется для этой конкретной системы. Определяемые условия гибридизации находятся в объеме данного уровня техники (например, Sambrook et al., 1989, ниже).

Мутантные OPSS по настоящему изобретению могут катализировать перенос тиоловой группы (SH группы) на OPS с получением цистеина. Предпочтительно, чтобы условия, которые позволяют мутантным OPSS по настоящему изобретению проявлять их оптимальную активность, включали, но не ограничивались этим: i) присутствие 0-2 мМ PLP (пиридоксаль-5'-фосфата) или 0-100 мМ DTT (дитиотреитола) в качестве кофактора, ii) температуру реакции от 25 до 60°С и iii) рН от 6,0 до 10,0.

Метод определения ферментативной активности OPSS, которая катализирует синтез цистеина путем переноса тиоловой группы на субстрат OPS, был раскрыт вместе с номенклатурой Ape-OPSS (Ape-O-фосфосеринсульфгидрилазы). Особенно из-за того, что Ape-OPSS обладает активностью превращения OAS в цистеин путем переноса тиоловой группы, метод основан на измерении активности фермента синтеза цистеина E. coli (OASS, O-ацетилсеринсульфгидрилазы, EC 4.2.99.8)) (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003).

В методе в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения PLP, который предоставляет тиоловую группу для OAS (O-ацетилсерина) или OPS, служащий кофактором OASS или OPSS при превращении в цистеин, добавляют в концентрации 0,2 мМ. Добавляют также DTT не только для предотвращения, благодаря его восстанавливающей силе окисления, экспонируемого на воздухе цистеина в цистин, но также для количественного определения количества уже окисленного цистеина. Предпочтительно чтобы, когда добавлено 25 мМ DTT или 0,2 мМ PLP, степень превращения в цистеин повышалась в 2,3 раза. Это означает, что PLP и DTT оказывают положительное влияние на превращение OPS в цистеин.

Ферменты Ape-OPSS, Mtb-OPSS и Mtb-T характеризуются оптимальной температурой реакции 60°С или 37°С при оптимальном рН 7,4, как сообщалось ранее (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Agren D, Schnell R and Schneider G, FEBS letters, 583: 330-336, 2009). На основе этих данных могут быть оптимизированы условия реакции превращения для мутантных OPSS с улучшенной ферментативной активностью.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения мутантные OPSS могут катализировать превращение при температуре от 37°С до 80°С. Подробнее, фермент Ape-OPSS из Archea spp., которая может расти даже при высоких температурах, проявляет более высокую ферментативную активность при 60°С, чем при 37°С. Высокая термостабильность самого фермента также ведет к оптимальной температуре 60°С. С другой стороны, Msm-T проявляет оптимальную ферментативную активность при 37°С и уязвима при температурной обработке при 60°С. Ферменты OPSS, как обнаружено, сохраняют активность в отношении превращения на протяжении диапазона рН от 6,0 до 10,0. Оптимальная ферментативная активность была определена при рН 7,4 у Ape-OPSS и при рН от 8,0 до 9,0 у Msm-T. Однако Msm-T стабильна на протяжении более широкого диапазона рН, чем Ape-OPSS.

В соответствии с другим его аспектом в настоящем изобретении предлагается молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутантную OPSS.

При применении в настоящем описании термин «молекула нуклеиновой кислоты» предназначен для охвата молекул ДНК и РНК. Нуклеотиды, которые составляют структурные единицы молекул нуклеиновой кислоты, включают не только существующие в природе нуклеотиды, но также аналоги с модифицированной структурой сахаров или оснований (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).

В соответствии с дополнительным аспектом в настоящем изобретении предлагается экспрессионный вектор, несущий молекулу нуклеиновой кислоты.

«Вектор» относится к любому носителю для клонирования и/или переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может представлять собой репликон, к которому может быть присоединен другой сегмент ДНК так, чтобы осуществлялась репликация присоединенного сегмента. «Репликон» относится к любому генетическому элементу (например, к плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который функционирует в качестве автономной единицы репликации ДНК in vivo, т.е. способен реплицироваться под своим собственным контролем. Термин «вектор» включает как вирусные, так и невирусные носители для введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина in vitro, ex vivo или in vivo. Термин «вектор» может также включать миникольцевые ДНК. Например, вектор может представлять собой плазмиду без последовательностей бактериальной ДНК. Удаление последовательностей бактериальной ДНК, которые обогащены областями CpG, как показано, снижает сайленсинг экспрессии трансгенов и ведет к более устойчивой экспрессии из плазмидных ДНК-векторов (смотри, например, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) Mol Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11: 856-64). Термин «вектор» может также включать транспозоны, такие как транспозон Спящая Красавица (Izsvak et al. J. Mol. Biol. 302:93-102 (2000)), или искусственные хромосомы.

В качестве вектора в данной области техники хорошо известна система pET (Novagen), использующая промотор T7. В настоящем изобретении могут быть использованы без ограничения различные экспрессионные системы, известные в данной области техники.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения применялась экспрессионная система, использующая CJ1 промотор, разработанная изобретателями настоящего изобретения для экспрессии экзогенного гена (смотри вложенную корейскую патентную публикацию No. 10-2006-0068505, фиг. 7).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения сравнивали уровни экспрессии OPSS между системой pET, включающей промотор T7, и системой CJ1, включающей промотор CJ1, при одних и тех же заданных условиях. В результате система CJ1 продемонстрировала более высокий уровень экспрессии OPSS, чем система pET (фиг. 3). Кроме того, для гиперэкспрессии OPSS в системе pET требовалась низкая температура (18°С) и длительный период времени, а в системе CJ1 высокая температура (37°С) и короткий период времени. Следовательно, для эффективного получения OPSS предпочтительно использовать промотор CJ1, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

В соответствии с еще одним его аспектом в настоящем изобретении предлагается трансформант, трансформированный экспрессионным вектором.

При применении в настоящем описании термин «трансформация» во всех его грамматических формах и вариантах написания относится к искусственному генетическому изменению клетки, являющемуся результатом введения чужеродного гена в клетку-хозяина, так что введенный ген может реплицироваться сам или как часть, включенная в хромосому.

Вектор по настоящему изобретению может быть введен в клетки-хозяева с помощью подходящих стандартных методов, известных в данной области техники, примеры которых включают, но не ограничиваются этим, электропорацию, сопреципитацию с фосфатом кальция, инфицирование ретровирусами, микроинъекцию, использование ДЭАЭ-декстрана и липосомный катионный кальций.

Термин «клетка-хозяин, трансформированная рекомбинантным вектором», при применении в настоящем описании, относится к клетке-хозяину, которая фиксирует в себе рекомбинантный вектор, несущий представляющий интерес ген. Клетка-хозяин, подходящая для использования в настоящем изобретении, может быть прокариотной или эукариотной. Примеры включают энтеробактерии и дифтериеподобные бактерии, предпочтительно Escherichia spp. и Serratia spp. при наибольшей предпочтительности E. coli.

В соответствии с еще одним его аспектом в настоящем изобретении предлагается способ получения цистеина, включающий превращение OPS с помощью сульфида в присутствии мутантной OPSS по настоящему изобретению.

Мутант по настоящему изобретению может быть применен для массового производства цистеина. Когда используется трансформант, экспрессирующий мутант, массовая продукция цистеина может осуществляться в оптимальных культуральных условиях, которые хорошо известны в данной области техники. Следовательно, способ массовой продукции цистеина включает культивирование трансформанта в оптимальных условиях, которые хорошо известны в данной области техники.

Для использования в качестве субстрата OPS может быть в чистой форме или может быть в форме ферментируемой культуры, содержащей OPS. Чистый OPS может быть коммерческим препаратом, продаваемым Sigma-Aldrich под каталожным No. P0878, или CAS407-41-0 от Wako. Однако содержащая OPS культура, полученная путем микробной ферментации, имеет экономические преимущества по сравнению с имеющимся в продаже чистым OPS, заключающиеся в том, что содержащая OPS культура может быть использована без дополнительной очистки, и кофактор PLP, необходимый для превращения, может быть получен в ферментируемой культуре.

Любое соединение серы может быть использовано в настоящем изобретении до тех пор, пока оно может превращаться в тиоловую группу (SH). Предпочтительно могут быть использованы Na₂S, H₂S или S₂O₃ в форме жидкости или газа.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве источника серы использовался Na₂S. Na₂S может быть добавлен в молярной концентрации, в от 0,1 до 3 раз более высокой, чем концентрация OPS, используемая в ферментативном превращении. Подробнее, Msm-T-HA2, которая обеспечивала 80% степени превращения в цистеин, что эквивалентно степени превращения под действием Msm-T, используют в концентрации 50 мкг/мл при условиях реакции, включающих 50 мМ OPS ферментационного бульона или 60 мМ очищенного OPS ферментационного бульона, 100 мМ или 120 мМ Na₂S и 0,2 мМ PLP.

Специалистам в данной области техники должно быть ясно и вполне понятно, что с высокоактивными ферментами процесс ферментативного превращения может быть оптимизирован и масштабирован. В одном варианте осуществления, когда 19,317 г/л OPS ферментационного бульона инкубировали в присутствии 50 мг Msm-T-HA2, цистеин продуцировался в концентрации до 9,075 г/л. В 1 л сосуде OPS превращался в цистеин в присутствии мутанта со степенью 71,83% (фиг. 6).

Аббревиатура и терминология

Для лучшего понимания настоящего изобретения и для обучения тем методам в данной области техники, которые необходимы для осуществления настоящего изобретения, дано описание последующих выражений и методов. Пока в контексте ясно не указано иначе, во всем описании и формуле изобретения слова «включает», «включающий» и тому подобное должны истолковываться в смысле включения как противоположного смыслу исключения или исчерпания, что соответствует смыслу выражения «включая, но, не ограничиваясь этим». Формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте ясно не указано иначе. Например, термин «включающий клетку» обозначает «включающий одну клетку или множество таких клеток, но не ограничивается этим».

Когда используется ссылка на перечисление двух или более предметов, «или» покрывает все последующие интерпретации слова: любого из предметов в перечислении, всех предметов в перечислении и любого сочетания предметов в перечислении.

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же самое значение, что и понимаемое специалистами в той области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Имеющие отношение к изобретению методы и вещества раскрыты ниже, но сходные или эквивалентные методы и вещества могут быть использованы на практике или в экспериментах по настоящему изобретению. Вещества, методы и примеры, представленные ниже, предлагаются как иллюстративные, но не должны быть истолкованы как ограничивающие настоящее изобретение. Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения должны быть понятны из последующего описания и прилагаемой формулы изобретения.

Делеция: мутация, при которой один или более нуклеотидов или аминокислотных остатков удалены из молекулы нуклеиновой кислоты или белка, соответственно.

Способ осуществления изобретения

Лучшее понимание настоящего изобретения может быть достигнуто с помощью последующих примеров, которые предлагаются с целью иллюстрации, но не истолковываются как ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1: Конструирование OPSS

Сообщалось, что Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis и Trichomonas vaginalis содержат OPSS, фермент, который использует OPS вместо OAS в E. coli в качестве субстрата для синтеза цистеина (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW and Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006). На основании этих сообщений авторы настоящего изобретения обнаружили два типа OPSS, которые превращают OPS в цистеин, в Aeropyrum pernix и Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Из них фермент OPSS из Mycobacterium tuberculosis H37Rv был использован для скрининга аминокислотной гомологии. В результате было получено три мутанта OPSS Msm-OPSS, Rjo-OPSS и Nfa-OPSS из Mycobacterium smegmatis str. MC2 155, Rhodococcus jostii RHA1 и Nocardia farcinica IFM 10152, соответственно.

Для получения OPSS из каждого штамма была сконструирована векторная система pET28a (Novagen), которая обычно используется для экспрессии ферментов. Все матрицы и праймеры, использованные для клонирования пяти разных ферментов сульфгидрилазы OPS, и полученные рекомбинантные плазмиды суммированы в таблице 1 ниже. Подходящие сочетания матриц и праймеров, как представлено в таблице 1, были использованы для ПЦР для амплификации каждого гена OPSS. Продукты ПЦР и вектор pET28a гидролизовали NdeI и HindIII (37°С в течение 3 часов). Каждый из фрагментов генов лигировали с гидролизованным вектором pET28a (Novagen). Секвенирование оснований подтвердило конструирование экспрессионных векторов, несущих каждый из генов OPSS. Экспрессионные векторы фермента были введены в E. coli (DE3) с получением штаммов, способных экспрессировать ферменты OPSS. Наименования ферментов представлены в таблице 1 ниже.

Таблица 1
Фермент	Вектор	Матрица	Праймер
Ape-OPSS	pET28a-Ape-OPSS	Синтетическая ДНК	SEQ ID NO: 7 и 8
Mtb-OPSS	pET28a-Mtb-OPSS	Геномная ДНК Mtb	SEQ ID NO: 9 и 10
Msm-OPSS	pET28a-Msm-OPSS	Геномная ДНК Msm	SEQ ID NO: 11 и 12
Rjo-OPSS	pET28a-Rjo-OPSS	Геномная ДНК Rjo	SEQ ID NO: 13 и 14
Nfa-OPSS	pET28a-Nfa-OPSS	Геномная ДНК Nfa	SEQ ID NO: 15 и 16

Экспрессию ферментов осуществляли в соответствии с инструкциями производителя системы pET (Novagen). Одиночные колонии каждого штамма с чашек LB инокулировали в 5 мл бульона LB и инкубировали при 37°С в течение 16 часов со встряхиванием при 200 об/мин. Культуры переносили в 25 мл свежего бульона LB (в 250-мл флаконах) и инкубировали до OD600, равной 0,5-0,6 (в течение 2-3 часов), в тех же условиях, сразу после чего к среде добавляли 1 мМ IPTG для индукции подлежащих экспрессии ферментов во время инкубации при 18°С в течение 18 часов со встряхиванием при 120 об/мин. Ферменты очищали с использованием колонок Ni-NTA для His-tag с помощью His SpinTrap (GE Healthcare). Из пяти выделенных таким образом ферментов, OPSS четыре были обнаружены в растворимой форме, а один (Rjo-OPSS) находился в тельцах включений по данным анализа с помощью 14% SDS-ПААГ-электрофореза.

Пример 2: Анализ OPSS на предмет активности в синтезе цистеина

Четыре фермента OPSS, полученные из разных штаммов микроорганизмов, анализировали на способность катализировать превращение OPS в цистеин. В плане условий и методов анализа (ферментативного анализа cysM) дается ссылка на предшествующие сообщения (Mino K and Ishikawa K, FEBS letters, 551: 133-138, 2003; Burns KE, Baumgart S, Dorrestein PC, Zhai H, McLafferty FW and Begley TP, J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005; Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol. Chem., 281: 25062-25075, 2006). Количество использованного субстрата представлено в единицах на мл. Условия анализа ферментативной активности суммированы в таблице 2 ниже.

Таблица 2
Исходный раств.	Конечная конц.	Блэнк	Сульфгидрилаза OPS
6xhis-фермент		-	40 (50 мг)
1 М HEPES (pH 7,4)	100 мМ HEPES	100	100
0,5 М Na2S	10 мМ Na2S	20	20
10 мМ PLP	0,2 мМ PLP	20	20
100 мМ OPS	5 мМ OPS	0	50
DW		790	750
Всего		1000	1000

Растворы для реакции, исключая ферменты, инкубировали при 37°С в течение 5 мин, после чего к раствору для реакции добавляли 50 мг очищенной OPSS. В заранее определенные моменты времени инкубации при 37°С отбирали 100 мл раствора ферментативной реакции и смешивали с 100 мл 33,2% ТХУ для остановки ферментативной реакции. Концентрации цистеина в растворах ферментативной реакции количественно анализировали путем измерения поглощения при ОП560 согласно методу Гейтонд. Активность в отношении синтеза цистеина четырех разных ферментов сульфгидрилазы OPS суммирована в таблице 3 ниже. Титры синтеза цистеина ферментов OPSS выражены в виде степени превращения в цистеин за время реакции.

Таблица 3
	Степень превращения в цистеин (%)
10 мин	30 мин	60 мин
Ape-OPSS	63,4	89,7	97,4
Mtb-OPSS	1,7	4,8	10,1
Msm-OPSS	12,8	25	43,7
Nfa-OPSS	0,1	0,1	0,2

Как можно видеть в таблице 3, было подтверждено, что ферменты OPSS из Aeropyrum pernix и Mycobacterium tuberculosis H37Rv обладают способностью использовать OPS в качестве субстрата для синтеза цистеина. Впервые была обнаружена способность к синтезу цистеина новой OPSS из Mycobacterium smegmatis str. MC2 155, которая была получена путем скрининга аминокислотной гомологии с ферментом Mtb-OPSS. С другой стороны, новая OPSS из Nocardia farcinica IFM 10152, полученная скринингом гомологии, проявляла несущественную активность в отношении превращения O-фосфосерина в цистеин.

Как видно из данных таблицы 3, степень превращения OPS в цистеин Ape-OPSS достигает почти 100% за один час.

Конечная степень превращения под действием фермента Msm-OPSS, который был впервые отобран посредством скрининга фермента на основе OPSS из Mycobacterium tuberculosis H37Rv, о которой сообщалось ранее, составляла 43,7%, что в 4,3 раза превышало степень превращения под действием Mtb-OPSS.

Пример 3: Получение Mtb-T и Msm-T, мутантов, лишенных 5 C-концевых аминокислотных остатков Mtb-OPSS и Msm-OPSS

OPSS из Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Mtb-OPSS), которая катализирует превращение OPS в цистеин с помощью дополнительных ферментов mec+ и cysO, способна использовать источник серы, содержащий S^2-, для превращения OPS в цистеин даже в отсутствие дополнительных ферментов, когда из нее удалены пять C-концевых аминокислотных остатков. На основании этого факта была получена Mtb-T (SEQ ID NO: 24), которая может быстро превращать OPS в присутствии S^2- в качестве источника серы. Была также получена Msm-T из Msm-OPSS, которая имеет высокую аминокислотную гомологию с Mtb-OPSS, путем делеции 5 C-концевых аминокислотных остатков. Были сконструированы экспрессионные векторы, несущие два мутантных фермента. Для этого проводили ПЦР c pfu на геномной ДНК Mycobacterium tuberculosis H37Rv и Mycobacterium smegmatis str. MC2 155 в присутствии каждой пары праймеров SEQ ID NOS: 17 и 18 и SEQ ID NO: 19 и 20. Полученные таким образом фрагменты генов OPSS обрабатывали NdeI и HindIII и клонировали в вектор pET28a, гидролизованный теми же ферментами рестрикции, для конструирования рекомбинантных экспрессионных векторов, названных pET28a-Mtb-T и pET28a-Msm-T, соответственно. Рекомбинантные экспрессионные векторы были введены в E. coli (DE3). Экспрессия двух мутантных OPSS, полученных в тех же условиях, что и в примере 1, была подтверждена с помощью 14% SDS-ПААГ. В результате были получены Mtb-T (SEQ ID NO: 5) и Msm-T (SEQ ID NO: 2).

Пример 4: Анализ Mtb-T и Msm-T на предмет способности к синтезу цистеина

Ферментативную активность полученных выше Mtb-T и Msm-T оценивали путем измерения конечной степени образования цистеина. Ферментативную активность анализировали таким же образом, что и в примере 2. Образованный цистеин количественно определяли методом Гейтонд, и результаты суммированы в таблице 4 ниже.

Таблица 4
	Степень превращения в цистеин (%)
10 мин	30 мин	60 мин
Mtb-T	9,5	18,6	37,1
Msm-T	20,3	54,6	100

Как видно из таблицы 4, Msm-T обес